Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1 Распространенность доброкачественной гиперплазии предстательной железы и рака предстательной железы .10
1.2 Современные методы диагностики рака предстательной железы 12
1.2.1. Пальцевое ректальное исследование 13
1.2.2. Трансректальное Ультразвуковое Исследование 13
1.2.3. Магнитно-Резонансная Томография .15
1.2.4. Простатспецифический антиген .17
1.2.5. Биопсия предстательной железы 20
1.2.6. Иммуногистохимические маркеры .23
Глава II. Материал и методы исследования .34
2.1 Характеристики больных, включенных в исследование 34
2.2 Морфологическая верификация .36
2.3 Иммуногистохимическое исследование 37
Глава III. Значение традиционных методов исследования в дифференциальной диагностике рака предстательной железы 40
3.1. Клиническая характеристика больных с патологией предстательной железы 40
3.2 Биопсия предстательной железы 46
ГЛАВА IV. Результаты исследования ммп-9, белка ki-67 и коллагена IV .59
4.1 Характеристика пациентов, в биоптатах которых исследованы уровни экспрессии Ki-67, коллагена IV и матриксной металлопротениназы-9 .59
4.2 Гистологическая характеристика опухолей простаты 60
4.3 Иммуногистохимическая характеристика опухолей предстательной железы 66
4.3.1. Экспрессия Ki-67 в клетках аденокарциномы простаты и при ДГПЖ .66
4.3.2. Распределение коллагена IV в клетках аденокарциномы простаты и при ДГПЖ .72
4.3.3. Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 (MMП-9) в клетках аденокарциномы простаты и при ДГПЖ .76
Заключение .84
Выводы 90
Практические рекомендации 92 список сокращений 93
Список использованной литературы
- Современные методы диагностики рака предстательной железы
- Простатспецифический антиген
- Иммуногистохимическое исследование
- Гистологическая характеристика опухолей простаты
Современные методы диагностики рака предстательной железы
Заболевания предстательной железы занимают одно из основных мест в структуре урологических заболеваний. Мировая статистика свидетельствует, что доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) – самая распространенная урологическая патология среди мужчин пожилого и старческого возраста. ДГПЖ встречается у 50% мужчин в возрасте 50 лет и процент заболеваемости увеличивается с возрастом [McVary, 2009]. Проведенные в России эпидемиологические исследования указывают на постепенное увеличение заболеваемости ДГПЖ с 11,3% в возрасте 40-49 лет до 81,4% в возрасте 80 лет [Сивков, Кешишев, Ковченко, 2010]. Рак предстательной железы (РПЖ) является существенной проблемой здравоохранения. В мире РПЖ занимает 3-4 место среди заболеваемости злокачественными новообразованиями, ежегодно регистрируется более 600 000 новых случаев этого заболевания. В Соединенных Штатах это самый часто диагностируемый рак (без учета злокачественных новообразований кожи) и второй по смертности среди онкологических заболеваний. По оценкам Американского Онкологического Общества в 2011г. у 240,890 мужчин был диагностирован рак предстательной железы и 33,720 мужчин погибли от него [Siegel et al., 2011]. В 2011г. в США насчитывалось 2,4 млн. больных раком предстательной железы. По последним скрининг-исследованиям установлено, что примерно одному из 6 американцев будет поставлен диагноз рак предстательной железы и 1 из 33 мужчин умрут от этого диагноза [Brawley et al., 2012]. В целом, РПЖ наиболее распространен в США и Скандинавии, а наименее – в странах Азии [Orsted et al., 2011].
Главной эпидемиологической особенностью РПЖ является почти исключительное поражение лиц пожилого возраста. Среди всех больных РПЖ мужчины в возрасте до 50 лет составляют лишь 0,1%. Существенное увеличение риска заболевания наблюдается лишь после 60 лет [Heidenreich et al., 2014].
Заболеваемость РПЖ в России составляет 10–15 на 100000 человек. В России в 2000 г. на учете у онкологов состояло 37 442 больных РПЖ, в 2010 году – 107 942 пациента. Прирост за последние 10 лет составил 155% [Аполихин и др., 2010]. Если распределить больных РПЖ по стадиям, то статистика за 2010 г. будет выглядеть следующим образом: на долю локализованного РПЖ (I-II стадии) приходится 44,8%, местно распространенного РПЖ (III стадия) – 34,9%, метастатического РПЖ (IV стадия) – 18,5% [Чиссов, Русаков, 2010]. За последние годы отмечается отчетливая тенденция к увеличению доли локализованных форм опухоли в структуре рака предстательной железы (РПЖ), что связано с улучшением диагностических возможностей и повышением осознанности проблемы среди населения [Зеленова и др., 2010]. Например, в России доля больных РПЖ с локализованными стадиями выросла с 34% в 2001 году до 47,7% - в 2011 году [Чиссов, Старинский, 2012]. В связи с этим, одной из важных клинических проблем остается именно ранняя диагностика аденокарциномы предстательной железы, учитывая высокий процент выявления РПЖ в стадии наличия распространенных метастазов. Симптомы рака предстательной железы чаще всего появляются уже на поздних стадиях, для которых характерно прорастание капсулы и распространение опухоли в окружающие ткани. При этом радикальное лечение на этой стадии неосуществимо [Бухаркин, Подрегульский, 1999]. 50-70% больных обращаются за медицинской помощью по поводу уже развившихся осложнений, обусловленных РПЖ [Mettlin, Jones, Murphy, 1993]. При диагностике РПЖ на ранних стадиях выживаемость больных значительно выше [Altekruse et al., 2010].
Несмотря на высокий уровень заболеваемости, этиология РПЖ остается до конца неизученной. Единственными установленными факторами риска являются: возраст, раса и наследственная предрасположенность. Так, уровень андрогенов, диета, физическая активность, воспалительные заболевания и ожирение являются предполагаемыми факторами риска. Некоторые авторы считают, что не менее 42% риска развития рака предстательной железы относится именно к генетическим факторам [Fedewa et al., 2010].
Также характерной особенностью рака простаты является его частое сочетание с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и хроническим простатитом, что снижает специфичность, чувствительность и точность таких современных методов обследования как пальцевое ректальное исследование простаты (ПРИ), ТРУЗИ и уровень ПСА сыворотки крови [Alcaraz et al., 2009].
Современные методы диагностики рака предстательной железы У больных с подозрением на рак предстательной железы основными используемыми методами являются: пальцевое ректальное исследование (ПРИ), трансабдоминальное и трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ), компьютерная томографию (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), рентгенография костей таза и биопсия предстательной железы (ПЖ). В настоящий момент наиболее информативным и распрострененным методом диагностики и эффективности лечения РПЖ является метод определения уровня концентрации простатического специфического антигена (ПСА), его вариантов и молекулярных форм [Welch, Albertsen, 2009].
Пальцевое ректальное исследование Пальцевое ректальное исследование (ПРИ) является начальным и самым простым методом диагностики и определения клинической стадии рака предстательной железы. Качество интерпретации данных пальцевого ректального исследования во многом зависит от опыта проводящего исследование специалиста. Во время выполнения ПРИ обращают внимание на размеры железы, ее контуры, выраженность междолевой бороздки, на подвижность железы и ее консистенцию, наличие в предстательной железе узловых образований, смещаемость слизистой прямой кишки. Пальцевое ректальное исследование остается обязательным методом в дифференциальной диагностике рака предстательной железы, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, острого и хронического простатита. Недостатком метода является невозможность оценки стадии рака предстательной железы, невозможность пропальпировать опухоли, расположенные в передних отделах железы. По данным отечественной литературы, можно выявить всего 5,6% РПЖ, используя только данные ПРИ [Матвеев, 1999].
Простатспецифический антиген
Агрессивность опухоли главным образом зависит от степени метастазирования и от распространения метастазов. Метастазирование – комплексный процесс, включающий адгезию клетки к экстраклеточному матриксу (ЭКМ), его деградации с дальнейшим распространением опухолевых клеток из первичного очага в другие ткани [Littlepage et al., 2010].
Опухолевые клетки осуществляют свой метастатический потенциал благодаря присущим им специфическим характеристикам, которые позволяют отрываться от первичной опухоли, циркулировать в сосудах, мигрировать, интравазировать и проникать в окружающие ткани, достигать тканей-мишеней метастазирования, экстравазировать и стабилизироваться в метастатический центр [Wan et al., 2012]. В процессе метастазирования злокачественные клетки включаются в ряд взаимодействий с ЭКМ непосредственно (как с таковым), с клетками эндотелия, цитокинами, базальными мембранами, протеинами, ассоциированными с ним факторами роста и циркулирующими клетками крови, микроокружением вторичного сайта, где опухолевые клетки в конечном итоге смещают нормальные ткани и формируют метастазы. [Boxler et al., 2010]. ЭКМ, часто называемый соединительной тканью, является организованной сетью внеклеточных молекул окружающих и поддерживающих клетки. ЭКМ состоит из большого разнообразия полисахаридов и белков, таких как ламинины, коллагены, фибронектин, и протеогликан, и играет важную роль в определении формы, развитии и функционировании клеток [Wu et al., 2010]. Разобщение компонентов ЭКМ, ключевых факторов метастазирования, достигается посредством действия нескольких протеолитических ферментов, секретируемых опухолью или стромальными клетками, существующими в опухолевом конгломерате. В нормальных физиологических условиях эти клеточные протеазы находятся под строгорегулируюемым контролем, однако в случае метастатических опухолей, эти механизмы управления нарушены [Decock et al., 2011]. Кроме того, исследования показали корреляцию между уровнем экспрессии и активностью нескольких клеточных протеаз к метастатическому поведению опухоли [Hua et al., 2011]. Основными клеточными протеазами является серин, цистеин, аспарагиновая кислота, однако расщеплять все структуры ЭКМ могут только матриксные металлопротеиназы (ММП). MMП играют главную роль в деградации ЭКМ или действуя независимо друг от друга или активируя другие протеазы, способствующие миграции опухоли и метастазированию [Szarvas et al., 2011].
Матриксные металлопротеиназы (ММП) составляют семейство Zn зависимых эндопептидаз, обладают способностью разрушать основные компоненты экстраклеточного матрикса и играют важнейшую роль в процессах его регулируемой (физиологической) деградации, то есть в тканевом морфогенезе, репарации тканей, эмбриогенезе и ангиогенезе. Ряд патологических состояний — ревматоидный артрит, остеоартрит, периодонтит, язвенная болезнь, аутоиммунные заболевания, гипертония, а также опухолевая инвазия и метастазирование развиваются с нарушением регуляции деградации ЭКМ, а значит, с участием ММП.
Белки ЭКM составляют базальную мембрану, которая лежит в основе базальной поверхности эпителиальных тканей и формирует физический барьер против инвазии опухоли. ММП рассматривают как критические молекулы, "ассистирующие" опухолевым клеткам на протяжении всего процесса метастазирования [Zhou et al., 2011]. Ингибицию ММП синтетическими или естественными ингибиторами связывают с ингибицией опухолевой инвазии. Напротив, сверхэкспрессия ММП обычно приводит к расширению опухолевой инвазии, что продемонстрировано гистологически, в модельных системах через выявление опухолевых клеток в отдаленных местах метастазирования, а также in vitro методом инвазии в Matrigel или ЭКМ [Roy, Yang, Moses, 2009]. Исследования 1980–1990 гг. в основном связывали ММП с опухолевой инвазией, миграцией клеток опухоли, ремоделированием тканей в связи с распространением опухоли и только иногда с метастазированием. Сегодня актуальным исследованиями являются определение связи ММП с ангиогенезом; роли специфических ММП в диссеминации опухоли; связи между ММП и появлением метастазов в отдаленных органах и тканях.
В настоящее время выделено более 20 ферментов, входящих в состав семейства матриксных металлопротеиназ (табл.1). На основании клеточной локализации и субстратной специфичности ММП разделяют на 5 основных подсемейств: коллагеназы, желатиназы, стромелизины, матрилизины и мембранно-связанные ММП (МС-ММП). Существует группа недавно открытых и недостаточно изученных ММП, которые выделяют в отдельную группу - "другие ферменты". Известны также 4 представителя семейства тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP).
Иммуногистохимическое исследование
Как следует из данных, представленных в таблице 10, у большинства исследуемых пациентов (75 человек или 68,18%) уровень ПСА находился в пределах до 10 нг/мл, у 41 пациентов (37,27%) уровень ПСА составил менее 4 нг/мл.
У данной группы пациентов с уровнем ПСА менее 4 нг/мл были установлены следующие диагнозы: ДГПЖ у 27 больных (24,55%) и РПЖ у 14 пациентов (12,73%).
У обследуемых в группе с уровнем ПСА от 4 до 10 нг/мл распределение диагнозов было следующим: ДГПЖ у 13 пациентов (28,89%) , РПЖ у 21 пациента (32,31%). В группе с уровнем ПСА от 10 до 20 нг/мл установлены следующие диагнозы: ДГПЖ у 3 больных (6,67%), рак выявлен у 16 пациентов (24,62%).
В группе обследованных нами мужчин с уровнем ПСА от 30 до 100 нг/мл диагноз был следующим: РПЖ - у 5 пациентов (7,69%). У 2 (3,08%) больных с уровнем ПСА более 100 нг/мл установлен диагноз рака предстательной железы.
Наши данные свидетельствуют о высокой частоте рака в группе с уровнем ПСА более 30 нг/мл, что согласуется с данными отечественной и зарубежной литературы.
Как показывают результаты обследования пациентов, чувствительность определения концентрации ПСА в сыворотке крови с целью диагностики РПЖ составляет 74%. Как следует из данных, представленных в таблице 10, в группе со значительно повышенным уровнем ПСА (более 10 нг/мл) у 5 пациентов из 45 (11,11%) при обследовании не было обнаружено рака предстательной железы. Кроме того, у 16 больных ДГПЖ (40%) выявлено повышение уровня ПСА в сыворотке крови в пределах от 4,1 до 29,9 нг/мл. В связи с этим, ПСА не может считаться высокоспецифичным методом диагностики рака предстательной железы и использоваться как самостоятельный метод диагностики РПЖ.
Нами было обследовано 110 пациентов. При поступлении в стационар большая часть пациентов предъявляла жалобы на дизурию. Самыми распространёнными были: ночная поллакиурия, ишурия, странгурия и гематурия, а также часть больных предъявляли жалобы на боли в костях таза и пояснично-крестцовом отделе позвоночника.
Изменения предстательной железы, характерные для РПЖ, такие как бугристая поверхность, каменистая консистенция железы и наличие изолированных узлов в простате, выявлены у 56 (50,9%) пациентов. В ходе проведения ТРУЗИ неоднородность паренхиматозных сигналов, искаженность контуров предстательной железы, наличие пенетрации капсулы и гипоэхогенных участков в железе выявлены у 65 (59,09%) пациентов. В результате исследования установлено, что трансректальное ультразвуковое исследование является более чувствительным методом по сравнению с пальцевым ректальным исследованием.
Всем пациентам произведена трансректальная мультифокальная биопсия предстательной железы. По результатам патоморфологического исследования предстательной железы большую часть больных составили пациенты с диагнозом РПЖ - 65 пациентов, с диагнозом ДГПЖ - 45 пациентов.
Среди пациентов с морфологически верифицированным раком предстательной железы при пальцевом ректальном исследовании подозрение на РПЖ возникло у 31(47,69%) обследуемого пациента, по данным трансректального ультразвукового исследования злокачественное новообразование простаты было заподозрено у 40(61,54%) обследуемых пациентов. Как показывают результаты обследования пациентов, чувствительность определения концентрации ПСА в сыворотке крови с целью диагностики РПЖ составляет 74%.
Таким образом, установлено, что из трех основных исследований: пальцевого ректального исследования, трансректального ультразвукового исследования предстательной железы и определения уровня ПСА в сыворотке крови - определение простат-специфического антигена имеет наибольшую специфичность и наименьшее количество ложноотрицательных результатов.
Чувствительность метода высока при уровне ПСА в сыворотке крови более 10 нг/мл, и понижается по мере снижения показателей ПСА, особенно в интервале 2,5-9,9 нг/мл. Биопсия предстательной железы является обязательным финальным этапом диагностики рака предстательной железы, однако морфолог не всегда может четко ответить на вопрос о наличии и характере течения аденокарциномы простаты, что влияет на дальнейшую тактику лечения пациента с РПЖ. В связи с этим требуются новые методы диагностики и стадирования РПЖ, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью. В последние годы большое значение придается иммуногистохимическим методам исследования тканей с целью решения проблемы диагностики и эффективного лечения онкологических заболеваний.
Характеристика пациентов, в биоптатах которых исследованы уровни экспрессии матриксной металлопротениназы-9, Ki-67 и коллагена IV
В работе был использован операционный материал 53 пациентов c диагнозом аденокарцинома предстательной железы, средний возраст больных составил 67 с интервалом от 52 до 83 лет. В качестве контроля использовали биопсийный материал 10 пациентов той же возрастной группы с диагнозом доброкачественная гиперплазия предстательной железы.
Гистологическая оценка новообразований выполнена с использованием баллов шкалы Глисона, которое соответствовало наиболее выраженным анапластическим изменениям клеток опухолевых желез, выявленных при биопсии у данного пациента. У всех пациентов также определялся уровень общего простатспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови. При этом были выявлены 4 группы пациентов: с баллом 2 – 10 больных, с баллом 3 – 18 пациентов, с баллом 4 – 20 человек и баллом 5 – 5 пациентов.
Выделенные группы пациентов достоверно не отличались по возрасту и содержанию ПСА в сыворотке крови. (Таблица 11). Характеристика клинического материала по градации шкалы Глисона. Таблица Аденокарцинома шкала Глисона Кол-вопациентов ПСА М+S нг/мл Гистологическая характеристика опухолей простаты Доброкачественная гиперплазия предстательной железы Доброкачественная гиперплазия предстательной железы характеризуется пролиферацией эпителиальных и стромальных клеток простаты, в результате которой формируются крупные узлы в периуретральной области предстательной железы. На Рис.2 представлены микроскопические характеристики подобных узловых структур, образованных за счет пролиферации желез. В железах имеются два слоя: внутренний, состоящий из цилиндрического секреторного эпителия и наружного базального слоя, состоящего из клеток удлиненной формы, расположенного на неповрежденной базальной мембране. Для эпителия характерно образование большого количества выпячиваний и складок.
Гистологическая характеристика опухолей простаты
В аденокарциномах различных градаций в настоящем исследовании выявлен широкий спектр пролиферативной активности секреторных железистых клеток. Достоверные различия выявлены между всеми исследованными градациями опухолей за исключением низкодифференцированных аденокарцином, пролиферативная активность опухолей 4- и 5- градаций достоверно не различались. Установлена умеренная положительная корреляционная связь между градацией по шкале Глисона и индексом пролиферации клеток по показателю Ki-67 (rs =0,674) и умеренная отрицательная корреляционная связь градации опухолей с уровнем экспрессии матриксной металлопротеиназы–9 (rs= -0,660). Слабая достоверная отрицательная корреляция существует между уровнем пролиферативной активности клеток и экспрессией секреторными опухолевыми клетками MMП-9 (rs= -0,369).
Таким образом, сравнение показателей экспрессии MМП-9 в доброкачественной гиперплазии и аденокарциноме различных градаций выявило парадоксальную ситуацию, оказалось, что экспрессия этого протеолитического фермента выше в доброкачественной опухоли, не разрушающей коллаген базальной мембраны, по сравнению с аденокарциномой, характеризующейся инфильтративным ростом и разрушением базальной мембраны опухолевых желез. Кроме того, в наших полуколичественных исследованиях показано, что экспрессия этого фермента в секреторных опухолевых клетках снижается по мере возрастания градации аденокарциномы.
Проведенные исследования показали, что при доброкачественной гиперплазии предстательной железы высокая экспрессия ММП-9, в аденокарциномах происходит снижение экспрессии MMП-9, но она разрушает коллаген IV базальной мембраны железистых структур за счет отсутствия секреции данного фермента в протоки железы и таким образом расплавляет коллаген соединительной ткани. Пролиферативная активность секреторных опухолевых клеток по индексу Ki-67 возрастает по мере увеличения градации аденокарциномы простаты в то время как при ДГПЖ пролиферативная активность секреторного клеточного слоя не отмечалась.
Целью настоящего исследования явилось иммуногистохимическое выявление особенностей экспрессии матриксной металлопротеиназы-9, маркера пролиферации Ki-67 и коллагена IV при доброкачественной гиперплазии предстательной железы и аденокарциноме простаты различных градаций по шкале Глисона. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: дать сравнительную оценку диагностических методов, которые применяют для обследования больных с подозрением на РПЖ, изучить уровни экспрессии белка Ki-67, коллагена IV и матриксной металлопротеиназы-9 в эпителиальных клетках предстательной железы пациентов с доброкачественной гиперплазией и аденокарциномой предстательной железы, а также оценить клиническое значение и информативность данных показателей в дифференциальной диагностике заболеваний предстательной железы.
В основу работы положено обследование 110 пациентов с подозрением на РПЖ, находившихся на стационарном лечении в урологическом отделении Городской клинической больницы № 29 с декабря 2010 по сентябрь 2013 года. Всем пациентам было проведено следующее комплексное обследование: клинико-лабораторное исследование; пальцевое ректальное исследование предстательной железы; определение уровня общего простатспецифического антигена в сыворотке крови; трансректальное ультразвуковое исследование; рентгенография костей скелета; трансабдоминальное УЗИ исследование печени, почек, мочевого пузыря и забрюшинных лимфатических узлов; обзорная рентгенография органов грудной клетки; трансректальная биопсия предстательной железы с последующим патоморфологическим исследованием образцов.
Основную группу пациентов составляют мужчины старше 50 лет, что связано с корреляцией распространённости злокачественных новообразований предстательной железы и возрастом пациентов, представляющим собой основной фактор риска развития РПЖ. Возраст исследуемых пациентов составил от 53 до 82 лет. Средний возраст пациентов составил 64,47 (8,73) лет.
При поступлении в стационар большая часть пациентов предъявляла жалобы на дизурию. Самыми распространёнными были: ночная поллакиурия, ишурия, странгурия и гематурия. Часть больных (n=6) предъявляли жалобы на боли в пояснично-крестцовом отделе позвоночника и костях таза. Как показывают представленные данные, дизурия характерна как для ДГПЖ, так и для различных стадий РПЖ. Болевой синдром в поясничной области характерен для метастатического РПЖ, в то время как гематурия чаще встречается при ДГПЖ. У 15 пациентов (33,33%), страдающих ДГПЖ, возникла острая задержка мочеиспускания, что указывает на более частую встречаемость данного симптома у пациентов с ДГПЖ, чем у больных РПЖ.
При физикальном обследовании всем пациентам выполнялось пальцевое ректальное исследование предстательной железы. Оценивали следующие параметры: состояние перианальной области, тонус сфинктера, состояние поверхности, размер простаты, ее консистенцию, симметричность, наличие узловых образований, сохранение срединной бороздки, а также подвижность слизистой оболочки прямой кишки над предстательной железой. Изменения предстательной железы, характерные для РПЖ, такие как бугристая поверхность, каменистая консистенция железы и наличие изолированных узлов в простате, выявлены у 56 (50,9%) пациентов.
