Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Роль полиаминов в жизнедеятельности микроорганизмов 9
1.1.1. Биогенные полиамины и пути регуляции их внутриклеточной концентрации ...9
1.1.2. Физиологическая роль полиаминов 12
1.1.3. Роль полиаминов в адаптации к стрессу 15
1.2. Механизмы антибактериального действия основных групп бактерицидных
антибиотиков 16
1.2.1. Р-лактамы 17
1.2.2. Аминогликозиды 18
1.2.3. Хинолоны 19
1.2.4. Окислительное повреждение как неспецифический механизм действия антибиотиков разных групп 22
1.2.4.1. Механизмы образования активных форм кислорода и их токсическое действие на основные компоненты клетки 22
1.2 4 2. Развитие эндогенного окислительного стресса под действием разнообразных стрессовых факторов 25
1.2.4.3. Формирование окислительного стресса в условиях воздействия антибиотиков разных групп 26
1.3. Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам 28
1.3.1. Механизмы специфической устойчивости 29
1.3.1.1. Модификация мишени действия 29
1.3.1.2. Ферментативная инактиваг\ия антибиотика 30
1.3.2. Механизмы неспецифической устойчивости, основанные на функционировании
систем адаптации к различным видам стресса 31
1.3.2.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости, основанные на ограничении поступления ксенобиотиков в клетку 32
1.3.2.2. Активный выброс ксенобиотиков из клетки. Многоцелевые системы выброса 33
1.3.2.3. RpoS — глобальный транскрипционный регулятор общего стрессового ответа 34
1.3.2.4. MarA/SoxS/Rob — транскрипционные регуляторы множественной антибиотикорезистентности 35
1.3.2.5. Влияние полиаминов на устойчивость бактерий к антибиотикам 37
Экспериментальная часть 41
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Культивирование микроорганизмов 1 42
2.3. Определение активности Р-галактозидазы 45
2.4. Определение содержания полиаминов в клетке 45
2.5. Определение активности ферментов синтеза полиаминов 47
2.6. Определение концентрации белка 48
2.7. Определение содержания адениловых нуклеотидов в клетках 49
2.8. Подсчет числа живых клеток 49
2.9. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам 2.10. Определение содержания активных форм кислорода в клетках 50
2.11. Транспортная активность пориновых каналов 51
2.12. Оценка повреждения ДНК при действии антибиотиков 53
2.13. Статистическая обработка 54
Результаты 55
ГЛАВА 3. Полиамины как фактор устойчивости Е coli к антибиотикам
3.1. Влияние антибиотиков на активность системы синтеза полиаминов 55
3.2. Участие транскрипционных регуляторов SoxS и RpoS в регуляции активности лизиндекарбоксилаз 60
3.3. Влияние полиаминов на устойчивость Е. coli к антибиотикам 64
3.3.1. Эффект естественного содержания эндогенных полиаминов на степень устойчивости Е coli к антибиотикам 64
3.3.2. Влияние экзогенных полиаминов на устойчивость Е coli к антибиотикам 68
ГЛАВА 4. Роль полиаминов в адаптации Е. coli к окислительному стрессу, вызванному действием антибиотиков 72
4.1. Развитие окислительного стресса как следствие разобщения обменных процессов в результате сублетального действия антибиотиков 72
4.1.1. Антибиотики разных классов вызывают усиление продукции активных форм кислорода в клетках Е. coli 72
4.1.2. Изменение энергетического состояния клеток Е. coli в условиях сублетального действия антибиотиков 4.2. Роль антиоксидантных свойств полиаминов в адаптации Е coli к действию антибиотиков 79
4.3. Сравнение антиоксидантных свойств полиаминов и тиомочевины в условиях действия антибиотиков 83
ГЛАВА 5. Роль полиаминов в защите ДНК от повреждающего воздействия антибиотиков
5.1. Сублетальное действие антибиотиков вызывает фрагментацию бактериальной ДНК 87
5.2. Роль полиаминов в защите ДНК от разрывов, индуцированных сублетальным действием антибиотиков 89
5.3. Сравнение ДНК-защитных свойств полиаминов и тиомочевины в условиях действия антибиотиков 92
ГЛАВА 6. Ограничение проницаемости внешней мембраны Е coli как механизм защиты от действия антибиотиков 94
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов 97
7.1. Роль полиаминов в формировании адаптивного ответа Е. coli на действие различных групп антибиотиков 97
7.2. Антиоксидантное действие полиаминов при адаптации Е. coli к воздействию антибиотиков 102
7.3. Влияние полиаминов на окислительное повреждение бактериальной ДНК, вызванное воздействием антибиотиков разных классов 107
7.4. Роль полиаминов в ограничении проницаемости внешней мембраны Е. coli для антибиотиков 111
Заключение 114
Выводы 1
- Биогенные полиамины и пути регуляции их внутриклеточной концентрации
- Развитие эндогенного окислительного стресса под действием разнообразных стрессовых факторов
- Определение концентрации белка
- Антибиотики разных классов вызывают усиление продукции активных форм кислорода в клетках Е. coli
Введение к работе
з
Актуальность проблемы. Распространение антибиотикоустойчивых форм патогенных микроорганизмов в последнее время происходит в широких масштабах и с высокой скоростью. Знание механизмов, лежащих в основе антибиотикорезистентности, могло бы способствовать ее успешному преодолению и повышению эффективности антибактериальной терапии.
Комплексное воздействие неблагоприятных факторов внешней среды на микроорганизмы способствовало формированию у них универсальных механизмов защиты. Функциональные возможности данных систем адаптации могут быть направлены, среди прочего, на противодействие антибиотикам и являться основой формирования множественной антибиотикорезистентности. Среди таких неспецифических адаптивных механизмов выделяют ограничение проникновения антибиотиков в клетку, а также их активное выведение из клетки посредством работы помп множественного лекарственного выброса (Сидоренко, Тишков, 2004). В последнее время появляются сообщения о вовлеченности активных форм кислорода (АФК) в антибактериальное действие разных групп антибиотиков (Albesa et al. 2004; Kohanski et al., 2007). Поскольку действие антибиотиков сопровождается окислительным повреждением бактериальной клетки, функционирование систем антиоксидантной защиты могло бы вносить вклад в снижение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. В качестве неспецифических адаптогенов, принимающих участие в процессе приспособления разнообразных организмов (от бактерий до растений и млекопитающих) к неблагоприятным условиям среды, рассматривают полиамины (Rhee et al, 2007; Kusano et al, 2008). Биогенные полиамины (путресцин, спермидин, кадаверин) оказывают влияние на устойчивость клеток Е. coli к окислительному, кислотному, тепловому и другим видам стресса (Ткаченко и др., 1997, 1998 и др.). Защитное действие полиаминов, основанное, в частности, на их антиоксидантных свойствах (На et al., 1998; Ткаченко и др., 2001) и способности ингибировать проницаемость пориновых каналов клеточной стенки (delaVega, Delcour, 1996) послужило основанием
4 для предположения о возможном участии этих соединений в адаптации бактериальных клеток к действию антибиотиков.
Цель работы - изучение роли полиаминов в формировании адаптивного ответа E.coli на действие антибиотиков, относящихся к различным классам.
Основные задачи исследования:
Исследовать активность основных ферментов синтеза полиаминов в условиях сублетального действия Р-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.
Оценить влияние полиаминов на чувствительность Е. coli к антибиотикам разных классов.
Исследовать изменение энергетического статуса клеток Е. coli в условиях сублетального действия антибиотиков.
Изучить роль полиаминов в защите клеток от окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков.
Оценить вклад различных полиаминов в регуляцию проницаемости пориновых каналов клеточной стенки Е. coli для антибиотиков.
Научная новизна. Установлено, что в ответ на действие Р-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в клетках Е. coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и увеличение их внутриклеточной концентрации. Показано, что накопление в клетках полиаминов (как за счет добавки извне, так и в результате эндогенного синтеза) сопровождается повышением их устойчивости к действию (3-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков. Впервые показана роль антиоксидантных свойств полиаминов в приспособлении клеток Е. coli к сублетальному действию трех исследованных групп антибиотиков. Выявлена роль путресцина и спермидина в защите бактериальной ДНК от повреждений, вызванных действием антибиотиков, в условиях in vivo. На основании различий эффектов полиаминов получены данные об их функциональной специализации в формировании адаптивного ответа клетки на действие антибиотиков: путресцин и спермидин, преимущественно, оказывают антиоксидантное и ДНК-протекторное
5 действие, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости клеточной стенки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах неспецифического защитного ответа бактериальных клеток на действие разных классов антибиотиков и роли полиаминов в этом процессе.
Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета.
Выявленная зависимость устойчивости клеток к антибиотикам от содержания полиаминов в среде культивирования свидетельствует о необходимости стандартизации сред по данному параметру при определении антибиотикочувствительности микроорганизмов и является практически значимым результатом.
Основные положения, выносимые на защиту.
Воздействие антибиотиков вызывает разобщение энергетического и конструктивного обменов и развитие окислительного стресса в клетках Е. coli, что является сигналом для активации системы синтеза полиаминов.
Полиамины повышают устойчивость Е. coli к действию Р-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.
В условиях окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков, полиамины оказывают антиоксидантное и ДНК-протекторное действие.
Выявлена функциональная специализация полиаминов в условиях воздействия антибиотиков: кадаверин, преимущественно, играет роль регулятора проницаемости клеточной стенки, тогда как путресцин и спермидин защищают бактериальную клетку от окислительного повреждения.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на 11-, 12-, 14-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007, 2008, 2010); 3-, 4-, 5-ой
6 международных молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2008, 2009); международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008); 7-ой международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет» (Пермь, 2008); 3-ей международной конференции молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2008); 3 Congress of European Microbiologists FEMS (Gothenburg, Sweden, 2009); 35th FEBS Congress «Molecules of Life» (Gothenburg, Sweden, 2010).
По теме диссертации опубликована 21 печатная работа.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками. Список литературы включает 259 работ отечественных и зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу», индекс приоритетного направления 5.19, 5.21, 5.24, номер госрегистрации 01.2.01.2.00 3 06932. Работа дополнительно финансировалась в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», а также была поддержана грантами РФФИ (04-04-97501, 09-04-99006) и грантом Уральского отделения РАН для молодых ученых.
Список сокращений. АСБ-абсолютно сухая биомасса, АФК-активные формы кислорода, ЛДК-лизиндекарбоксилаза, ОДК-орнитиндекарбоксилаза.
Биогенные полиамины и пути регуляции их внутриклеточной концентрации
Необходимость полиаминов для нормального протекания клеточного цикла наглядно продемонстрирована при изучении микроорганизмов с дефектными путями биосинтеза полиаминов. Такие микроорганизмы характеризуются низкой скоростью роста или его отсутствием на средах без добавки полиаминов. Возобновление нормального деления таких клеток происходит только после добавления полиаминов в среду (Herbst et al, 1948; Tabor, Tabor, 1969)
Участие полиаминов в основных клеточных процессах во многом определяется особенностями их молекулярной структуры. При физиологических значениях рН полиамины протонированы по атому азота и несут положительный заряд. Поликатионная структура позволяет им эффективно взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами клетки, такими как нуклеиновые кислоты, фосфолипиды, белки (Igarashi, Kashiwagi, 2000). Помимо этого, известна способность полиаминов образовывать водородные связи. Возможность таких взаимодействий определяет участие полиаминов в разнообразных клеточных процессах. Влияние полиаминов на биосинтез белка
Полиамины оказывают положительное влияние на работу трансляционного аппарата, регулируя сборку 30S субъединиц (Echandi, Algranati, 1975) и стабилизируя общую структуру рибосом (Tabor et al, 1981). Связываясь с мРНК, полиамины вызывают ее конформационные изменения, приводящие к дестабилизации вторичных структур, в которых заключены последовательность Шайна-Дальгарно и инициаторный кодон, и, делая их доступными для рибосомного комплекса, повышают уровень инициации трансляции (Yoshida et ah, 1999).
Кроме того, установлено, что полиамины, в частности спермидин, стимулируют связывание тРНК с аминокислотами (Igarashi et al., 19786), а также играют роль в повышении избирательности связывания аминоацил-т-РНК с рибосомой (Igarashi et al., 1978а). В результате действия полиаминов на разные этапы биосинтеза, трансляция 309 из 2742 мРНК Е.соН, в том числе таких глобальных транскрипционных регуляторов как rpoS, суа, feci, fis, находится под их положительным контролем (Childs et al, 2003; Yoshida et al, 2004). Взаимодействие полиаминов с ДНК
Помимо РНК полиамины также активно взаимодействуют с молекулами ДНК. Одна из моделей взаимодействия полиаминов с ДНК предложена Liquori (1967). Согласно этой модели полиамины электростатически взаимодействуют с полинуклеотидными цепями, располагая четырехуглеродную молекулу путресцина в малой бороздке и связывая три пары оснований, а триметиленовые группы спермидина и спермина могут образовывать мостики между смежными фосфатными группировками одной цепи. Связываясь с ДІЖ, полиамины участвуют в процессе ее компактизации (Bloomfield, 1996) и стабилизации структуры (Flink, Pettijohn, 1975), предохраняя от термической и щелочной денатурации, ферментативной деградации, воздействия радиации и ароматических красителей, а также активных форм кислорода (Spotheim-Maurisot et al., 1995; Espositoefa/., 1997).
Полиамины принимают участие в переходе правосторонней В-ДНК в левостороннюю Z-ДНК (Thomas, Messner, 1988). Это, в свою очередь, приводит к изменению функциональных свойств ДНК, оказывая влияние на процессы транскрипции и репликации. Как было установлено на ауксотрофных штаммах Е. coli, полиамины могут регулировать скорость движения репликативной вилки (Geiger, Morris, 1980), а также влиять на инициацию синтеза ДНК, участвуя в формировании крестообразных структур (Tabor, Tabor, 1984). Было продемонстрировано существование зависимости между содержанием полиаминов в клетке и топологическим состоянием ДНК (Ткаченко и др., 1998). Принимая во внимание то, что суперспирализация ДНК является одним из основных факторов регуляции транскрипции, полиамины можно отнести к классу транскрипционных модуляторов. В последнее время в литературе появляется все больше сведений об участии полиаминов , в регуляции генной экспрессии как в клеткахэукариотных организмов., так и у прокариот (Bryans, et aL, 1996; Childs a/;,2003;iTKa4eHKp и др., 2003 .2004, 2007) . . Объединение под прямым или: опосредованным контролем- полиаминов экспрессии более 300 генові дало основание М. Yoshida с соавторами говорить об особой системе регуляции экспрессии- «модулоне полиаминов», которая задействована в регуляцииіклеточного цикла (Yoshida et aL, 2004)., Взаимодействие полиаминов смембранами " " ;. .; ""
Полиамины, благодаря наличию; алифатической цепи, способны взаимодействовать с гидрофобными; компонентами клеточных мембрані В литературе имеются данные о способности полиаминов оказывать влияние на стабильность мембраны и клеточной стенки; (Grossowicz, Ariel, 1963), стабилизировать АТФ-азные комплексы; бактериальной; мембраны (Peter et aL,-1973), защищать мембраны митохондрий ил фосфолипидные везикулы от воздействия, фосфолипаз (Sechi et aL, 1978). Связываясь с мембранами эритроцитов, они повышают их механическую стабильность делая более устойчивыми кразрушению (BallastaL, 1983).
Влияние полиаминов "на. клеточный! рост" происходит и. благодаря их участию в обмене фосфолипидов (MuriroetaL, 1973) Установлено, что полиамины играют немаловажную роль в регуляции проницаемости мембрані Они способны блокировать активность поринов белков внешней мембраны, формирующих обводненные каналы, участвующие в неспецифическом транспорте, гидрофильных молекул (DelaVega, Delcour, 1996; Samartzidou, Deicour, 1999). Эффект полиаминов реализуется в блокировке пор и стабилизации их закрытого состояния за счет взаимодействия с отрицательно заряженными участками поринов (Iyer, Delcour-1997).
Развитие эндогенного окислительного стресса под действием разнообразных стрессовых факторов
Поскольку природные сообщества микроорганизмов включают виды, являющиеся продуцентами антибиотических веществ, бактерии в ходе длительной эволюции выработали сложные механизмы резистентности, позволяющие им адаптироваться к присутствию в среде ксенобиотиков, в том числе и антибиотиков.
Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может быть природной и приобретенной. Истинная природная устойчивость обеспечивается отсутствием мишени действия антибиотика или её недоступностью вследствие исходно низкой проницаемости клеточной стенки, а также ферментативной инактивацией антимикробного препарата. Формирование приобретенной устойчивости обусловлено либо изменением уровня экспрессии собственных генов, либо приобретением новой генетической информации. Выделяют следующие механизмы антибиотикорезистентности (Сидоренко, Тишков, 2004): 1) модификация мишени действия, 2) инактивация антибиотика, 3) формирование метаболического «шунта», 4) активное выведение антибиотика из микробной клетки, 5) ограничение поступления антибиотика в клетку. Последние два механизма входят в первый эшелон защиты от ксенобиотиков и обеспечивают устойчивость низкого уровня к широкому спектру химических агентов. Функционирование данных систем позволяет микроорганизмам дожить до момента формирования у них защиты высокой степени специфичности на основе трех других механизмов антибиотикорезистентности.
Далее будут рассмотрены механизмы, обеспечивающие устойчивость к аминогликозидным, фторхинолоновым и Р-лактамным антибиотикам.
Специфическая устойчивость формируется в ответ на действие определенного антибиотика и, соответственно, обеспечивает устойчивость бактериальной клетки к данному антибиотику или группе сходных с ним препаратов.
Модификация мишеней действия антибиотика может происходить вследствие мутаций кодирующих их генов, за счет химического видоизменения или экранирования мишени от антибиотика (защита мишени).
Мутации в генах, кодирующих субъединицы ДНК-гиразы и топоизомеразы, вносят наиболее значительный вклад в формирование клинически значимой устойчивости бактерий к фторхинолонам (Drlica, Malik, 2003).
Устойчивость такого рода к Р-лактамам обусловлена появлением мутаций в генах, кодирующих пенициллинсвязывающие белки (Job et ah, 2007).
Мишенью для аминогликозидов является рибосома, в частности, формирующая ее 16S рРНК. Поскольку ген, кодирующий 16S рРНК, представлен в бактериальном геноме несколькими копиями и для формирования устойчивости необходимо появление соответствующих зо мутаций во всех локусах, резистентность к аминогликозидам, формирующаяся в результате данных мутаций, встречается редко (Meier et al., 1994; Alangaden et al., 1998; Magnet, Blanchard, 2005). Вклад в формирование устойчивости к аминогликозидам могут вносить также мутации в генах, кодирующих рибосомные белки (Criswell et al., 2006).
Примером химической модификации мишени может являться метилирование рРНК в участках критичных для связывания аминогликозидов. Этот механизм резистентности изначально присущ микроорганизмам, продуцирующим антибиотики данной группы. Однако в последнее время ферменты, осуществляющие специфическое метилирование рРНК, были обнаружены в клетках клинических изолятов некоторых грамотрицательных патогенов (Galimand et al., 2003; Yamane et al., 2005).
К наименее изученным механизмам резистентности относится защита мишени. В основе этого механизма лежит способность бактерий синтезировать белки, которые, связываясь с мишенью, препятствуют присоединению к ней антибиотика. Подобный механизм был описан для фторхинолонов: пентапептид Qnr, присоединяясь к ДНК-гиразе и топоизомеразе, препятствует связыванию с ней фторхинолона и формированию расщепляющего комплекса (Martinez-Martinez et al., 1998, Tran et al., 2005).
Определение концентрации белка
Корректное сравнение эффектов антибиотиков, представляющих разные группы, возможно лишь при равной силе их антибактериального воздействия. Исходя из этого, в качестве интегрального параметра, отражающего интенсивность антибактериального воздействия, было выбрано влияние антибиотиков на уровень накопления бактериальной биомассы (рост бактериальной культуры). В подавляющем большинстве экспериментов на периодических культурах были использованы концентрации антибиотиков, приводящие к 50%-ному ингибированию накопления биомассы (А6оо) ьс пятому часу культивирования, за исключением исследования повреждения ДНК, которое проводили в условиях 80-90%-ного ингибирования роста. Такие концентрации антибиотиков были обозначены как сублетальные (СЛКА).
Поскольку использованные в работе штаммы Ё. coli обладали разным уровнем природной чувствительности, СЛКА для них были различны и определялись в предварительных экспериментах путем титрования силы воздействия антибиотика на рост.
В экспериментах по определению антибиотикоустойчивости клеток с . разным эндогенным содержанием полиаминов культивирование проводили на синтетической минеральной среде М9 (Miller, 1992) с добавкой 0,4% глюкозы и 10 г/л лизина или орнитина - предшественников кадаверина и путресцина, соответственно. Бактериальные клетки культивировали в 50 мл питательной среды в колбах объемом 250 мл на термостатируемом шейкере (100 об/мин) при 37С до момента максимального накопления полиаминов в клетке. Максимальный уровень накопления путресцина и спермидина наблюдался на первый час культивирования в присутствии орнитина, кадаверина - на шестой час культивирования с добавкой лизина. Для того, чтобы исключить влияние экзогенных аминокислот, равное количество клеток (оценка по Абоо) отмывали физраствором и переносили в пробирки с 5 мл свежей среды М9 с добавкой глюкозы и исследуемого антибиотика. Дальнейшее культивирование осуществлялось в термостате при 37С, в ходе которого производили отбор проб для определения выживаемости. 2.3. Определение активности р-галактозидазы
Для определения уровня экспрессии генов rpoS, soxS, micF использован принцип генных слияний, когда регуляторная область исследуемого гена слита с беспромоторной частью репортерного гена lacZ, кодирующего (3-галактозидазу. Считается, что активность этого фермента в клетках пропорциональна уровню экспрессии исследуемого гена.
Активность Р-галактозидазы определяли методом Миллера, основанным на способности данного фермента гидролизовать хромогенные Р-галактозиды. В наших экспериментах использован о-нитрофенил-p-D-галактозид (ОНФГ) («Sigma», Германия), который во время гидролиза расщепляется до галактозы и о-нитрофенола, окрашенного в желтый цвет. Количество образующегося о-нитрофенола - пропорционально количеству фермента и времени взаимодействия фермента с ОНФГ (Miller, 1992).
После отбора проб клетки помещали в пробирки с Z-буфером (Na2HP04 - 0,06 М; NaH2P04 - 0,04 М; КС1 - 0,01 М; MgS04 - 0,001 М; 0-меркаптоэтанол - 0,05 М; рН 7,0) и обрабатывали смесью 0,1% додецилсульфата натрия и хлороформа при интенсивном встряхивании в течение 10 секунд. Реакцию инициировали внесением 200 мкл ОНФГ (4 мг/мл). Реакцию проводили при 28С и останавливали добавлением к реакционной смеси 0,5 мл раствора 1 М Na2C03. Интенсивность окраски оценивали на спектрофотометре UV-1650 PC («Shimadzu», Япония) по оптической плотности (А42о А55о)- Активность фермента рассчитывали в единицах Миллера по формуле:
AKTHBHOCTb=1000 (A42o-l,75-1- A55o)/t V A6oo, где А42о А55о - оптические плотности растворов при соответствующих длинах волн, t — время реакции, V - объем внесенной в реакционную смесь культуры, 1,75 - поправочный коэффициент рассеяния света для Е. coli.
Концентрацию полиаминов определяли методами ТСХ (Чудинов и др., 1984) и ВЭЖХ их дансил-производных. Полиамины экстрагировали 0,4 N хлорной кислотой из клеток Е. coli, сконцентрированных центрифугированием (2 мин, 16000g) в центрифуге Centrifuge 5415D («Eppendorf», Германия). К 100 мкл хлорнокислого экстракта, доведенного до рН 9,0 раствором Na2C03 (насыщенный), добавляли 100 мкл раствора 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорида (дансил-хлорид) («Sigma», США) в ацетоне (2,7 мг/мл) и инкубировали в течение 2 ч при 37С в темноте. Смесь выпаривали в концентраторе Concentrator 5301 («Eppendorf», Германия) и, в случае анализа методом ТСХ, экстрагировали бензолом. Бензольные экстракты количественно наносили на силикагелевые пластины для тонкослойной хроматографии («Sorbfil», Россия) размером 100x100 мм и последовательно разделяли в двух системах растворителей: I - бензол -триэтиламин (20:2); II - бензол - метанол (10: 0,45). Высушенные хроматограммы фотографировали на цифровую камеру Olimpus С-3040 (Япония) в ультрафиолетовом свете, возбуждающем сине - зеленое свечение пятен дансил-полиаминов, величина и яркость которых были пропорциональны их концентрации. По результатам компьютерного денситометрирования снимков с использованием стандартной программы. Adobe Photoshop 5.0 рассчитывали концентрацию полиаминов. Это было возможно благодаря нанесению на каждую пластину стандартных растворов полиаминов («Sigma», США), проведенных через все этапы обработки.
При анализе методом ВЭЖХ выпаренные пробы экстрагировали ацетонитрилом. Хроматографическая система включала хроматограф LC-20А («Shimadzu», Япония); колонку Luna СІ8(2) размером 250 мм 4.6 мм, 5 мкм («Phenomenex», США), предколонку С18 Securityguard, 4 ммхЗ мм, 5 мкм («Phenomenex», США); флуоресцентный детектор RF-10A XL («Shimadzu», Япония). Длины волн экстинкции и эмиссии были установлены на 400 и 516 нм, соответственно. В качестве мобильной фазы использовали воду и ацетонитрил, которые подавались на колонку со скоростью 1 мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 40 до 100% в течение 10 мин с последующим уравновешиванием в течение 10 мин 40%-ным ацетонитрилом. Количественный анализ проводился методом внешнего стандарта.
Для определения активности ферментов полиаминсинтезирующей системы использовался метод, основанный на измерении количества конечного продукта — путресцина или кадаверина, синтезированного in vitro в орнитин- или лизиндекарбоксилазной реакции (Ткаченко, Чудинов, 1989). Бактериальную культуру центрифугировали в Centrifuge 5804R («Eppendorf», Германия) в течение 8 минут при 3000g и температуре 0С, после чего дважды отмывали физраствором. Ресуспендированные клетки разрушали ультразвуком (22 кГц, 10 мА, в течение 30 сек десятисекундными циклами с охлаждением на ледяной бане), и осаждали обломки клеток центрифугированием (20 мин, 16000g). Активность декарбоксилаз определяли в полученном супернатанте. Инкубационная смесь для определения активности ферментов включала 100 мМ цитратно-фосфатный буфер с заданным рН, 0,04 мМ пиридоксальфосфата, 1 мМ дитиотрейтола, 10 мМ L-лизина или 10 мМ L-орнитина и супернатант, содержащий 100 мкг белка, в конечном объеме 0,5 мл. Ферментативную реакцию запускали добавлением субстрата после преинкубации реакционной смеси в течение 30 минут при 37С. Инкубацию проводили в тех же условиях 60 минут, после чего реакцию останавливали добавлением хлорной кислоты до 0,4 N конечной концентрации. Денатурированный белок осаждали центрифугированием (16000g, 10 минут). Удельную активность фермента подсчитывали по количеству продукта реакции (полиамина), образуемого 1 мг белка в минуту
Антибиотики разных классов вызывают усиление продукции активных форм кислорода в клетках Е. coli
В силу своей высокой реакционноспособности АФК (накопление которых наблюдается в клетках, подвергнутых действию антибиотиков) могут взаимодействовать с различными компонентами клетки. Известно, что одними из первых атаке активных форм кислорода подвергаются нуклеиновые кислоты. В результате действия АФК в составе ДНК образуются окисленные формы оснований, что приводит к повышению частоты мутаций, индуцирующих трансверсии типа ГЦ -»АТ, разрывам одной или обеих полинуклеотидных цепей и другим видам повреждений (Nunoshiba etal., 1999).
С целью изучения повреждающего воздействия антибиотиков на ДНК в настоящей работе использован анализ плазмидной ДНК, выделенной из предварительно трансформированных клеток, подвергнутых сублетальному действию антибиотиков, относящихся к различным классам. Повреждения регистрировались по появлению характерного «шмера» по ходу продвижения фракций ДНК в агарозном геле, интенсивность которого служила мерой силы повреждающего воздействия, а также по соотношению интенсивности полос релаксированной и суперскрученной фракций ДНК. Исследование проводили на культурах клеток Е. coli R091, трансформированных плазмидой pBR322.
Как и ожидалось, фторхинолон левофлоксацин, одним из аспектов бактерицидного действия которого является фрагментация бактериальной хромосомы (Drlica et aL, 2008), вызывал повреждение ДНК (Рис. 26А). Степень повреждения плазмидной ДНК зависела от концентрации антибиотика. При слабом действии левофлоксацина (падение количества КОЕ под действием антибиотика на 2-3 порядка, что соответствовало ингибированию роста бактериальной культуры на 50%) наблюдалось лишь изменение соотношения фракций суперскрученной и релаксированной ДНК (Рис. 26Б). Данный показатель топологического состояния смещался в сторону релаксированной фракции, что может быть связано с появлением единичных разрывов в молекуле ДНК. Действие более высоких концентраций антибиотика (падение количества КОЕ под действием антибиотика на 5 порядков, что соответствовало ингибированию роста на 80% и более) приводило к фрагментации плазмидной ДНК на полинуклеотидные участки разной длины, наблюдаемые на электрофореграмме в виде «шмера».
Повреждение ДНК Е. coli R091 pBR322 при сублетальном действии левофлоксацина: А - электрофореграмма плазмидной ДНК, Б - отношение яркости свечения суперскрученной фракции ДНК к релаксированной фракции. 1 - контроль без добавки антибиотика, 2 - 0,012 мкг/мл левофлоксацина, 3 - 0,017 мкг/мл левофлоксацина, 4 - 0,024 мкг/мл левофлоксацина.
Повреждение бактериальной ДНК наблюдалось не только в присутствии фторхинолоновых антибиотиков. «Шмер» обнаруживался также на электрофореграмме проб ДНК, выделенных из клеток, подвергнутых действию Р-лактама цефотаксима, основой действия которого является нарушение биосинтеза клеточной стенки (Рис. 27). Аналогичное повреждение ДНК вызывал аминогликозид амикацин, бактерицидное действия которого основано на нарушении белкового синтеза (Рис. 27).
Полученные результаты демонстрируют неспецифичность влияния антибиотиков на бактериальную ДНК, что свидетельствует в пользу окислительной природы повреждения нуклеиновых кислот в данных условиях и может рассматриваться как один из общих механизмов гибели клеток.
Роль полиаминов в защите ДНК от разрывов, индуцированных сублетальным действием антибиотиков
Известно, что наряду с признанными системами защиты (лоу-система репарации, регулоны антиоксидантной защиты soxRS и охуК) важную роль в предотвращении повреждения ДНК при окислительном стрессе играют полиамины (На etal., 19986; Ткаченко, 2004).
Исходя из этого, сделано предположение о том, что полиамины могли бы проявлять свои защитные свойства и при повреждении ДНК, вызванном воздействием антибиотиков. Для выяснения правильности сделанного предположения исследовали состояние ДНК, выделенной из клеток, подвергнутых воздействию антибиотиков в присутствии путресцина, кадаверина или спермидина, добавленных в бактериальные культуры в концентрации 10 мМ одновременно с антибиотиками.
Путресцин и спермидин практически полностью снимали повреждающий эффект левофлоксацина, что выражалось в исчезновении «шмера» на электрофореграмме, тогда как кадаверин не оказывал выраженного действия на степень повреждения ДНК (Рис. 28). Аналогичный положительный эффект полиаминов наблюдался и при повреждении ДНК амикацином (Рис. 28). Причем, протекторное действие усиливалось от кадаверина к путресцину и спермидину.
Положительный эффект полиаминов при повреждении ДНК приводил к повышению жизнеспособности клеток Е. coli. Изменение оптической плотности культуры под действием антибиотика показало, что путресцин и спермидин снижали силу антибактериального действия амикацина на 15 и 50%, соответственно (Рис. 29). В случае действия фторхинолонов защитные свойства полиаминов проявлялись еще ярче: путресцин повышал жизнеспособность клеток приблизительно в 1,5 раза, а спермидин более чем в 3 раза (Рис. 29). Кадаверин статистически значимого влияния на устойчивость клеток к антибиотикам в данных условиях не оказывал.
