Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Нормальная микрофлора кишечника, ее состав и функции 10
1.2. Местный иммунитет пищеварительной системы 26
1.3. Дисбактериоз кишечника 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Методы исследования . 38
2.2.1. Микробиологические методы 38
2.2.2. Биохимические методы 42
2.2.3. Биологические методы 43
2.2.4. Статистические методы 43
ГЛАВА 3. Характеристика микрофлоры кишечника людей, получавших антибиотики 44
3.1. Качественный и количественный состав микрофлоры кишечника взрослых людей, получавших антибиотические препараты , 44
3.2. Характеристика эшерихий, выделенных от людей, получавших антибиотики 47
3.2.1. Состав популяции эшерихий, выделенных
от людей, получавших антибиотики 47
3.2.2. Биологические свойства эшерихий со сниженной ферментативной активностью, выделенных от людей, получавших антибиотики 56
3.3. Характеристика лактобактерий, выделенных от людей получавших антибиотики 70
3.3.1. Состав популяции лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом 70
3.3.2. Биологические свойства лактобактерий,
выделенных от людей с дисбактериозом 73
ГЛАВА 4. Характеристика микрофлоры кишечника мышей с экспериментальным лекарственным дисбактериозом, обусловленным антибиотиками широкого спектра действия 82
4.1 Характер изменений микрофлоры кишечника мышей при экспериментальном лекарственном дисбактериозе 82
4.2. Биологические свойства эшерихий со сниженной ферментативной активностью, выделенных из кишечника мышей в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза 100
4.3. Биологические свойства лактобактерий, выделенных из кишечника мышей в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза 104
ГЛАВА 5. Изменения местного иммунитета при лекарственном дисбактериозе 108
5.1. Изменения содержания лизоцима в копрофильтратах людей при дисбактериозе, обусловленном применением антибиотических препаратов 108
5.2. Изменение содержания лизоцима в копрофильтратах мышей в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза 115
5.3. Изменение активности кислородзависимых бактерицидных систем непрофессиональных фагоцитов кишечника в динамике экспериментального дисбактериоза 117
5.4. Коррекция активности кислородзависимых бактерицидных систем непрофессиональных фагоцитов кишечника препаратом «Наринэ» 133
Заключение 137
Выводы 153
Список литературы 155
- Микробиологические методы
- Биологические свойства эшерихий со сниженной ферментативной активностью, выделенных от людей, получавших антибиотики
- Характер изменений микрофлоры кишечника мышей при экспериментальном лекарственном дисбактериозе
- Изменения содержания лизоцима в копрофильтратах людей при дисбактериозе, обусловленном применением антибиотических препаратов
Введение к работе
Актуальность исследования. Организм человека с населяющей его микрофлорой составляет единую экологическую систему - макроорганизм-микрофлора, при превышении компенсаторных возможностей которой возникают микроэкологические нарушения. В поддержании динамического равновесия между микрофлорой и макроорганизмом важная роль принадлежит макроорганизму, контролирующему с помощью разнообразных факторов состав микрофлоры (В .И. Вершинина, 1981; М.М. Шкарупета, 1990; J.P. Grill et al., 1995). С другой стороны, достигнутые в последние десятилетия успехи в изучении нормальной микрофлоры, позволили сформулировать положение, что нормальная микрофлора организма человека является своеобразным «экстракорпоральным органом, регулирующим биохимические реакции и физиологические функции макроорганизма в естественных условиях его обитания» (Б.А. Шендеров, 1998). Нормальная микрофлора выполняет множество функций, поддерживающих постоянство внутренней среды макроорганизма (Б.А. Шендеров, 1998; О.Н. Минушкин с соавт., 1999). Изменения в микробиоценозах служат предвестником отклонений в физиологическом состоянии макроорганизма (И.Н. Блохина, В.Г. Дорофейчук, 1979).
Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является поддержание в кооперации с организмом хозяина колонизационной резистентности макроорганизма, обеспечивающей его противоинфеющонную защиту. Снижение колонизационной резистентности ведет к увеличению содержания условно-патогенных микроорганизмов в полостях организма, сообщающихся с внешней средой, развитию эндогенных инфекций, суперинфекций различных локализаций (В.М Бондаренко с соавт., 1987; А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер, 1986, 1988; Н.Н. Костюкова, 1989; К.Х. Алмагамбетов с соавт., 1991; А.В. Валышев с соавт., 1997; Ю.В. Езепчук, 1998; К. Orrhage et al., 2000). Считается, что уровень и состояние колонизационной резистентности зависят от количественного и качественного состава микрофлоры в биоценозах и условий ее обитания (А.А. Воробьев с соавт., 1997; В.М. Бондаренко с соавт.,
5 2003). Качественные и количественные изменения типичного для данного микробиоценоза состава микрофлоры определяется как дисбактериоз данного отдела (А.Ф. Бшшбин, 1975; В.Г. Петровская, О.П. Марко, 1976; Б.В. Пинегин с соавт., 1984; В.Н. Красноголовец, 1989; ЕМ. Горская с соавт., 1994; В.М. Коршунов с соавт., 1994, 1997, 1999; А.А. Воробьев, Б.А. Шендеров с соавт., 1996,1997; В.Г. Лиходед с соавт., 1999; И.Б. Куваева, 2001: D. Hentegens, 1996). Причины возникновения дисбактериозов многочисленны и разнообразны (Т.А. Логадырь, 1990; О.Г. Крамарь, 1997; О.Н. Минушкин с соавт., 1999; Л.В. Крамарь с соавт., 2002; В.М. Бондаренко с соавт., 2003). Одной из ведущих причин, приводящих к развитию дисбактериозов кишечника, является широкое, не всегда обоснованное и рациональное использование антибиотиков (Б.А. Шендеров, 1988; Л.И. Кафарская с соавт., 1991; А.Ю. Барановский, ЭЛ. Кондрашина, 2000; В.М. Бондаренко с соавт., 2003; N. Lambert-Zechowsky et al., 1985). По данным отечественных исследователей дисбактериозы кишечника регистрируются у 65-90% населения страны,
В доступной литературе достаточно полно отражены вопросы изменения характера микрофлоры при дисбактериозах (И.А. Бочков с соавт., 1991; В.Г. Акимкин с соавт., 1996; Б.А. Ефимов с соавт., 1996; В.М. Коршунов с соавт., 2001; Н. Haenel, 1975; S.L. Gorbach, 1985), изучены биологические свойства условно-патогенных микробов, колонизирующих кишечник людей с дисбактериозом (КБ. Куваева, Г.Г.Кузнецова, 1993; С.А. Калашникова, 1999; Н.В. Королева, 2001; Е.В. Кудря, 2002; Л.А. Леванова с соавт., 2002), описаны многочисленные изменения органов и систем (СИ. Сытник, 1988, 1994; Д.Г. Кулинич с соавт., 1992; А.А. Воробьев с соавт., 1996; Б.А. Шендеров, 1996; А.В. Валышев с соавт., 1997; И.Б. Куваева, 2001; Ю.В. Несвижский, 2003), видов обмена у людей с дисбактериозом (И.Б. Куваева, 1976; С.Д. Митрохин, 1989; С.Д. Митрохин, Б.А. Шендеров, 1991), разработана тактика восстановления микрофлоры у людей с дисбактериозом (А.А. Ленцнер с соавт., 1987; Е.А. Беюл с соавт., 1992; Б.А. Ефимов, 1993; Л.Н. Мазанкова, 1998; И.Е. Кюнкрикова, 2000; И.Б. Куваева, 2001; В.М. Бондаренко с соавт., 2003; R. Fuller, 1989; P.L. Conway et al., 1994).
Однако практически отсутствуют данные о механизмах развития дисбактериоза, нет единого мнения о связи дисбактериоза с иммунитетом. В частности, не до конца ясно, что первично в этом процессе — нарушения ли микрофлоры ведут к развитию иммунодефицитов, либо микроэкологические сдвиги в биоценозах развиваются вследствие неблагоприятного воздействия внешних факторов на систему защиты организма, особенно на местном уровне. Не до конца выяснены механизмы, влияющие на развитие микроэкологических изменений, увеличение численности условно-патогенных бактерий в биотопах организма.
Поскольку изменения количественного и качественного состава микрофлоры, определяющие уровень и состояние колонизационной резистентности, могут зависеть от действия конкретных факторов (в частности, от действия антибиотических препаратов) целью работы явилось изучение некоторых особенностей колонизационной резистентности при дисбактериозах кишечника, обусловленных антибиотическими препаратами. Для реализации цели предстояло решить следующие задачи:
Изучить количественный и качественный состав микрофлоры кишечника взрослых людей с дисбактериозом, обусловленным введением антибиотических препаратов.
Исследовать биологические свойства представителей резидентной микрофлоры у людей с дисбактериозом.
Выявить микроэкологические изменения характера микрофлоры кишечника мышей в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного разными антибиотиками широкого спектра действия.
Проследить за изменением биологических свойств микроорганизмов, представителей резидентной флоры, при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном антибиотиками.
Определить изменение некоторых показателей неспецифической резистентности организма в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного приемом антибиотика.
Сопоставить изменения факторов неспецифической резистентности организма с характером микроэкологических нарушений.
7 Научная новизна:
Установлено, что при дисбактериозе, обусловленном приемом антибиотиков, как у взрослых людей, так и в эксперименте, отмечаются наиболее выраженные изменения со стороны таких представителей резидентной микрофлоры, как эшерихий и лактобактерии.
Впервые установлено, что антибиотики широкого спектра действия существенно снижают активность кислородзависимьк бактерицидных систем местных непрофессиональных фагоцитов (энтероцитов и колоноцитов). Наиболее значительное снижение активности отмечено в колоноцитах.
Выявлено, что увеличение численности в микробной популяции эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных бактерий зависит от активности кислородзависимых бактерицидных систем местных непрофессиональных фагоцитов (энтероцитов и колоноцитов).
Практическая значимость. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии по теме «Отношение паразит-хозяин в биоценозах кишечника при лекарственном дисбактериозе» в рамках договора № 034/201/003 (2001-2005 гг.).
Полученные результаты позволили установить, что одним из механизмов, способствующих развитию микроэкологических изменений в кишечнике, может быть снижение активности местных факторов неспецифической защиты, в частности, активности кислородзависимых систем колоноцитов и энтероцитов.
Использование лактосодержащих продуктов функционального питания, в частности, кисло-молочного «Нарию» может явиться средством профилактики дисбактериозов при проведении антибиотикотерапии препаратами широкого спектра действия.
Материалы диссертации включены в учебные программы и используются
в лекционных и практических курсах кафедры биохимии и микробиологии
Ростовского Государственного Университета для студентов,
специализирующихся по микробиологии, а также Факультета Усовершенствования Врачей Ростовского Государственного Медицинского Университета по курсу микробиологии.
Разработано и внедрено в практику учебно-методическое пособие для студентов биолого-почвенного факультета РГУ «Симбионтная микрофлора желудочно-кишечного тракта человека, Дисбактериоз и его коррекция».
Получен патент на изобретение «Питательная среда для выделения лактобактерий» (№ 2202609 от 20.04.2003 г.).
Оформлен и представлен на согласование в ГИСК им. Л.А. Тарасевича Экспериментально-производственный регламент на питательную среду для выделения и культивирования бифидобактерий, жидкую (ГТ-среда).
Получено разрешение Комитета медицинских иммунобиологических препаратов на внедрение в практику без проведения Гос. испытаний питательной среды для выделения и культивирования бифидобактерий, жидкой (ГТ-среда) (Выписка из протокола № 6 от 14.06.2001 г.).
Материалы диссертации использованы при подготовке Аналитического обзора «Новые подходы к коррекции и профилактике дисбактериозов», направленного в Департамент организации и развития медицинской помощи населению МЗ РФ.
Положения, выносимые на защиту:
При дисбактериозе кишечника, обусловленном введением антибиотиков, как у людей, так и в эксперименте на животных, происходят значительные юменения в составе кишечных микробиоценозов. Изменения полостной и мукозной микрофлоры носят синхронный характер и выражаются в основном в изменениях количественного состава и характера популяций эшерихий и лактобактерий, где нарастает численность эшерихий со сниженной ферментативной активностью, гемолитических эшерихий, лактобактерий со сниженной кислотообразующей активностью.
При дисбактериозе, обусловленном антибиотиками широкого спектра действия, изменяются биологические свойства представителей нормальной резидентной флоры. Существенно снижаются антагонистическая и адгезивная активности эшерихий и лактобактерий, что свидетельствует об утрате ими функции поддержания колонизационной резистентности.
Под действием антибиотиков значительно изменяются показатели местной неспецифической резистентности: снижается активность
9 кислородзависимых бактерицидных систем местных непрофессиональных фагоцитов. Снижение активности кислородзависимых бактерицидных систем предшествует изменениям в составе нормальной микрофлоры. Максимум снижения активности кислородзависимых бактерицидных систем коррелирует с повышением в составе нормальной микрофлоры количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных микроорганизмов, особенно протея и гемолитических эшерихий. Использование «Наринэ» стимулирует активность кислородзависимых бактерицидных систем, приводит к уменьшению в кишечной микрофлоре количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных бактерий.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», посвященной 90-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (1999), научной конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», посвященной 30-летию кафедры микробиологии, вирусологии, и иммунологии Кабардино-Балкарского Государственного Университета (г. Нальчик, 1999).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ, изданы методические рекомендации, оформлен патент на питательную среду, оформлен экспериментально-производственный регламент.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 266 источников, в том числе, отечественных 180 и зарубежных 86. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 23 рисунками.
Микробиологические методы
Для выполнения работы на наличие дисбактериоза кишечника были обследованы 4392 человека в возрасте от 30 до 60 лет, и 250 практически здоровых людей. Из всей группы обследованных в разработку были отобраны 600 человек с дисбактериозом кишечника, обусловленным приемом антибиотиков широкого спектра действия и 64 практически здоровых человека, не получавших антибиотики в течение последнего полугода.
При воспроизведении экспериментального дисбактериоза использовано 400 белых беспородных мышей весом 16-18 г., у которых исследован характер полостной и пристеночной микрофлоры.
Биологические свойства представителей резидентной флоры исследованы у 300 штаммов эшерихий, 143 штаммов лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом, 65 штаммов эшерихий, 137 штаммов лактобактерий, полученных от условно-здоровых людей и 96 штаммов эшерихий, 100 штаммов лактобактерий, изолированных от мышей.
Состав микрофлоры кишечника изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника» (Москва, 1991).
Исследуемый материал в различных разведениях засевали на дифференциально-диагностические питательные среды для определения количества тех или иных микроорганизмов. Для изучения микробиоценоза кишечника применялись следующие питательные среды: Среда ГТі - для выделения бифидобактерий (Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии);
Среда МРС-5 (молочно-редуктивная среда Рогозы в модификации РНИИМП) — для выделения лактобактерий;
Кровяной агар — для подсчета гемолитических форм; Желточно-солевой агар — для стафилококков; Среда Эндо - для эшерихий и других энтеробактерий; Среда Плоскирева - для условно-патогенных энтеробактерий; Скошенный МПА для посева по Шукевичу — для протея; Среда Вильсон-Блер - для клостридий; Среда Сабуро—для дрожжеподобных грибов рода Кандида. Посевы инкубировались при температуре 37 С в течение 24 часов на средах Эндо, Плоскирева (энтеробактерий), кровяном агаре (гемолитические формы); 48 часов — на ЖСА (стафилококки), МРС (лактобактерий), ГТ( (бифидобактерий), среде Вильсон-Блер (клостридий). Среда Сабуро выдерживалась при 24С до 5 суток (грибы рода Кандида). После инкубации проводился учет выросших колоний. Подсчет колоний производился по формуле N l О/разведение фекалий, где N - количество выросших колоний. Далее проводилось сравнение с показателями возрастной нормы, делалось заключение об изменениях в составе микрофлоры фекалий и степени дисбактериоза (Метод, рекомендации, 1991). Проводился отбор штаммов для дальнейшего исследования биохимических, биологических, персистентных свойств культур микроорганизмов: эшерихий с нормальной ферментативной активностью, эшерихий со сниженной ферментативной активностью, лактобактерий, лактозонегативных энтеробактерий.
Первичную идентификацию проводили на средах Плоскирева и Эндо с последующим пересевом на среду Клиглера, на которой определяли способность к образованию сероводорода, а также способность к ферментации глюкозы, лактозы и мочевины. Дальнейшую идентификацию микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae проводили с использованием СИБ для идентификации энтеробактерий (г. Нижний Новгород). Видовую принадлежность школ определяли в соответствии с определителем видов «Берджи» (1992).
Для идентификации отобранных штаммов лактобактерий определяли наличие ферментов катал азы и цитохромоксидазы (М.О. Биргер, 1982), а также способности к утилизации углеводов (глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, маннит, сорбит, галактозу, лактозу) на среде Гисса (Е.И. Квасников, 1975). По совокупности признаков штаммы лактобактерий относились к тому или иному виду.
Определение антилизоцимной активности у выделенных штаммов осуществлялось по методике О.В. Бухарина с соавторами (1984), основанной на принципе «отсроченного антагонизма» (P. Fredencq, 1957) с использованием типового штамма M.lysodetkticus шт.№ 2665 (ГИСК им. Тарасевича).
Интерпретация результатов проводилась по В.О. Бозиеву, 1997. За низкий уровень принимались значения АЛА равные 1-2 мкг/мл; средний — 3-6 мкг/мл; высокий - свыше 6 мкг/мл.
Определение антиинтерцидной активности проводили по методике О.В. Бухарина с соавторами (1997) с интерцидом любезно предоставленным профессором О.В. Бухариным (Институт генетики микроорганизмов, г. Оренбург). Под «интерцидом» предложено понимать бактерицидную составляющую интерферона. В основе данной методики лежит принцип отсроченного антагонизма (P. Fredencq, 1957) с использованием типового штамма Corynebacterium xerosis шт. 181 (ГИСК им. Тарасевича).
Интерпретация результатов проводилась по А.В. Валышеву с соавторами (1997): за низкий уровень принималась способность к инактивации 1-2 единиц интерцида, за высокий уровень — 3 и более.
Антагонистическую активность штаммов микроорганизмов, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника, изучали методом отсроченного антагонизма (P. Fredericq, 1957) с использованием типовых штаммов, полученных из ГИСК им. Л.А. Тарасевича: 1. Shigella flexneri 2. Shigella sonnei 3. Proteus vulgaris 4. Proteus mirabilis 5. Klebsiella pneumoniae 6. Staphylococcus aureus. Штамм-антагонист считался высокоактивным, если величина зоны задержки роста была более 20 мм, среднеактивным — от 10 до 20 мм, низкоактивным — ниже 10 мм. Подсчитывались и неактивные штаммы-антагонисты по отношению к тому или иному тест-штамму.
Определение лизоцимной активности исследуемых штаммов производилось по методике О.В. Бухарина с соавторами (1985) основанной на явлении отсроченного антагонизма (P. Fredericq, 1957) с использованием суточной культуры M.lysodeikticus шт. № 2665 (ГИСК им. Тарасевича). Учет производился измерением в мм зоны лизиса вокруг макроколонии и оценивался по четырех-крестовой системе.
Биологические свойства эшерихий со сниженной ферментативной активностью, выделенных от людей, получавших антибиотики
В обеспечении колонизационной резистентности участвуют облигатные представители нормальной микрофлоры. Так как при развитии дисбактериоза, обусловленного применением антибиотиков, происходили изменения в популяциях таких эубионтов, как эшерихий и лактобактерий, представляло интерес проследить у данных видов микроорганизмов за изменением основных биологических свойств: антагонистической активности, адгезивной активности, персистентных характеристик.
Была изучена антагонистическая активность 150 штаммов эшерихии со сниженной ферментативной активностью, выделенных от людей с лекарственным дисбактериозом, и 50 штаммов эшерихии с нормальной ферментативной активностью.
Анализ полученных результатов показал, что в большинстве случаев эшерихии со сниженной ферментативной активностью, выделенные от людей с дисбактериозом, проявляли тенденцию к снижению антагонистической активности в отношении исследованных тест-штаммов. Так достоверно чаще низкая степень антагонистической активности у штаммов эшерихии со сниженной ферментативной активностью по сравнению со штаммами с нормальной ферментативной активностью была выявлена в отношении Kl.pneumoniae (90,0 ± 2,4% против 64,0 ± 6,7% соответственно, t = 3,7), P.vulgaris (100% против 76,0 ± 6,0% соответственно, t = 4,0), P.mirabilis (98,7 ± 0,9% против 86,0 ± 4,9% соответственно, t = 2,5). Эшерихий со сниженной ферментативной активностью в 75,3 + 3,5% случаев проявляли низкую антагонистическую активность в отношении S.sonnei, чем эшерихий с нормальной ферментативной активностью — в 68,0+ 6,6% случаев. Средняя и высокая степень антагонистической активности достоверно реже фиксировалась у штаммов эшерихий со сниженной ферментативной активностью, чем у штаммов с нормальной ферментативной активностью в отношении Kl.pneumoniae, P.vulgaris, P.mirabilis, а в отношении S.sonnei обнаруживалась тенденция к снижению способности к антагонизму. Так в отношении Kl.pneumoniae 6,7 + 2,0% штаммов эшерихий со сниженной ферментативной активностью имели среднюю степень активности, 3,3 + 1,5% - высокую степень; эшерихий с нормальной ферментативной активностью — 34,0 ± 6,7% и 2,0 ± 1,8% соответственно. В отношении двух видов протея было обнаружено всего два случая средней степени антагонистической активности у эшерихий со сниженной ферментативной активностью. Среди эшерихий с нормальной ферментативной активностью средне- и высоко антагонистически активных в отношении тех же штаммов протеев было выявлено от 2,0 ± 1,8% до 22,0 ± 5,8%. Процент обнаружения среди эшерихий со сниженной ферментативной активностью средне- и высоко антагонистически активных штаммов в отношении S.sonnei был также ниже чем среди эшерихий с нормальной ферментативной активностью (13,3 + 2,8%, 11.3 ± 2,6% и 24,0 ± 6,0%, 8,0 ± 3,8% соответственно). В отношении тест-штамма S.aureus наблюдалась обратная тенденция: штаммы эшерихий со сниженной ферментативной активностью проявляли большую антагонистическую активность, чем штаммы эшерихий с нормальной ферментативной активностью. Проведенные исследования позволяют говорить о снижении антагонистической активности эшерихий со сниженной ферментативной активностью, выделенных от людей с дисбактериозом, обусловленным применением антибиотиков широкого спектра действия. Причем, в отношении таких условно-патогенных энтеробактерий, как протеи и клебсиеллы, имеющих большое значение при дисбактериозах кишечника, штаммы эшерихий преимущественно либо не обладали антагонистической активностью, либо обладали ею в минимальной степени. Поскольку антагонизм нормальной микрофлоры является одним из механизмов, обеспечивающих колонизационную резистентность, низкая антагонистическая активность штаммов эшерихий со сниженной ферментативной активностью в отношении условно-патогенных энтеробактерий свидетельствует о снижении колонизационной резистентности кишечника при дисбактериозах, обусловленных применением антибиотиков широкого спектра действия.
Характер изменений микрофлоры кишечника мышей при экспериментальном лекарственном дисбактериозе
Обнаруженные изменения состава нормальной микрофлоры кишечника людей при дисбактериозе, обусловленном приемом антибиотиков, изменение количества и биологических свойств таких нормальных эубионтов, как эшерихии и лактобактерии, а также отсутствие зависимости между изменением количества бифидобактерий и изменением структуры популяции и нарастанием патогенных свойств у эшерихии, послужили основанием для воспроизведения экспериментального лекарственного дисбактериоза.
Использование экспериментальной биологической модели (белые мыши) (G. Burn, 1934; J.H. Gordon et al., 1971) позволяло проследить не только за изменениями в составе полостной, но и пристеночной микрофлоры, а также показателей местной неспецифической резистентности организма.
В таблице 23 приведены данные о характере микрофлоры кишечника интактных и получавших антибиотики мышей.
При сопоставлении результатов обнаружено, что введение терапевтических доз антибиотиков вело к изменению характера кишечной микрофлоры мышей. Если снижение количества бифидобактерий было незначительным и статистически недостоверным, то количество выделенных эшерихий снизилось существенно (lg 7,4 ± 0,4 и lg 5,4 ± 0,3 соответственно; t=4). По сравнению с популяцией бифидобактерий, изменение количества лактобактерии было более выраженным (lg 7,1 ± 0,5 и lg 6,3 + 0,2 соответственно; г=1,6). В микрофлоре мышей, получавших антибиотики, значительно возросло количество гемолитических форм, главным образом, за счет кокковых видов, количество условно-патогенных микроорганизмов, в частности, лактозонегативных энтеробактерии, в том числе протея.
В таблице 24 представлены результаты изменения состава мукозной флоры мышей.
Как видно из результатов, представленных в таблице, изменений в количестве бифидо- и лактобактерии практически не произошло. Существенно увеличилось содержание эшерихий, главным образом за счет эшерихий со сниженной ферментативной активностью. Увеличились находки лактозонегативных энтеробактерий, гемолитических кокковых форм. Резко возросло количество протея, грибов рода Candida.
Поскольку основной вклад в обеспечение колонизационной резистентности вносит мукозная микрофлора (О.В. Чахава с соавт., 1982; Б.В. Пинегин с соавт.,1984; Д. Ван-дер-Ваай, 1990; MLOrrhage et ah, 1994), изменение ее состава свидетельствует о значительном нарушении колонизационной резистентности, происходящем в результате антибиотикотерапии. Для создания экспериментального лекарственного дисбактериоза у мышей нами были использованы следующие антибиотики: гентамицин, цефазолин и ципрофлоксацин. Антибиотики оказывают несколько различное действие на микрофлору. Гентамицин относится к аминогликозидам II поколения, активен в отношении грамотрицательных бактерий, обладает быстрым бактерицидным эффектом, практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте, токсичен. Цефазолин относится к парентеральным цефалоспоринам I поколения, активен в отношении грамположительных кокков (стрептококки, стафилококки) и грамотрицательных палочек (E.coli, P.mirabiHs), не активен в отношении анаэробных бактерий. Ципрофлоксацин относится к фторхинолонам II поколения, является «золотым стандартом» среди фторхинолонов, имеет широкий спектр активности, включающий стафилококки, грамотрицательные кокки (гонококк, менингококк), грам положительные палочки (листерии, коринебактерии, возбудители сибирской язвы), грамотрицательные палочки семейства Enterobacteriaceae (E.coli, сальмонеллы, шигеллы, протеи, энтеробактеры, клебсиеллы и др.), P.aeruginosa. Хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте (Л.С. Страчунский, С.Н. Козлов, 2002).
Изменения содержания лизоцима в копрофильтратах людей при дисбактериозе, обусловленном применением антибиотических препаратов
Важнейшими функциями лизоцима, содержащегося в кишечнике, является регулирующий эффект в отношении кишечной микрофлоры, который осуществляется благодаря бифидогенному действию лизоцима, его антибактериальной активности, нейтрализации эндогенных сенсибилизирующих субстанций. Вместе с кишечным соком лизоцим предохраняет слизистую от вредного влияния (И.Б. Куваева, 1976). Считается, что снижение содержания лизоцима приводит к ослаблению колонизационной резистентности слизистой оболочки (Э.Г. Щербакова с соавт., 1999; 2000). Снижение активности эндогенного лизоцима является информативным тестом первичного скрининга для формирования групп риска по развитию дисбактериоза, кишечных инфекций, других заболеваний пищеварительной системы (А.А. Баранов, В.Г. Дорофейчук, 1999; Э.Г. Щербакова с соавт., 1999).
Так как гиперсекреция слизистой кишечника, ее воспаление при патологических процессах ведут к увеличению количества лизоцима в испражнениях с параллельным уменьшением лизоцима в слизистой дистального отдела толстой кишки (О.В. Бухарин с соавт., 1979), были исследованы копрофильтраты от 246 человек, получавших антибиотики, и 64 человек, не получавших антибиотики в ближайшие полгода. Для сравнения использовались данные, полученные О.В. Бухариным с сотрудниками (1979), о содержании лизоцима в копрофильтратах здоровых людей на уровне 0,74 ± 0,02 мкг/мл.
Частота обнаружения различных концентраций лизоцима в копрофильтратах людей, получавших и не получавших антибиотики, представлена в таблице 33.
Как видно из таблицы, процент обнаружения лизоцима в копрофильтратах был достоверно выше в группе лиц, получавших антибиотики (87,4 + 2,1% против 50,0 ± 6,2% в группе лиц, не получавших антибиотики; t=5,9.
Среди данного контингента нормальное содержание лизоцима определялось у 37,5 ± 8,5% лиц не получавших антибиотики и 9,3 ± 2,0% людей с дисбактериозом (t=3,2). Средняя концентрация лизоцима в копрофильтратах обследованных людей была примерно одинаковой - 0,602 мкг/мл и 0,646 мкг/мл соответственно.
В копрофильтратах лиц, получавших антибиотики, достоверно чаще обнаруживались высокие концентрации лизоцима, свидетельствующие о наличии воспалительного процесса в толстом кишечнике (90,7 ± 2,0% против 62,5 ± 8,5% в группе лиц, не получавших антибиотики; t - 3,2). Средний уровень лизоцима, определенный в копрофильтратах людей с дисбактериозом, составил 4,25 мкг/мл, в то время как в группе условно-здоровых лиц этот показатель соответствовал 2,19 мкг/мл, т.е. почти в два раза меньше.
Как известно, содержание лизоцима в кишечнике складывается из лизоцима, секретируемого слизистой оболочкой, и микробного лизоцима, играющего роль в процессе межмикробного взаимодействия (О.В. Бухарин с соавт., 1985). Исходя из этого, была сделана попытка, проанализировать, зависит ли уровень лизоцима в копрофильтратах от изменений в составе микрофлоры кишечника людей с дисбактериозом.
Была изучена зависимость между содержанием лизоцима в копрофильтратах и изменениями в составе бифидо- и лактобактерий, являющихся продуцентами лизоцима. С этой целью отобраны две группы людей: 124 человека, у которых дисбактериоз характеризовался изменением количества и качества факультативно-анаэробной флоры (эшерихий, энтерококков, наличием условно-патогенных микроорганизмов), и 130 человек, у которых изменения заключались в снижении количества бифидо-и лактобактерий. Результаты сопоставления представлены в таблице 34,
Результаты, представленные в таблице 34, свидетельствуют, что снижение содержания бифидо- и лактобактерий в составе кишечной микрофлоры сопровождалось достоверным снижением частоты обнаружения лизоцима в копрофильтратах (t =2,1). В группе со сниженным содержанием бифидо- и лактофлоры достоверно выше число низких значений лизоцима в копрофильтратах (23,4 ± 3,8% и 35,4 ± 4,2%; t = 2,1). Средняя концентрация лизоцима в копрофильтратах людей с дефицитом бифидо- и лактобактерий составила 2,45 мкг/мл, в то время как в группе людей с нормальным содержанием данных эубионтов — 3,25 мкг/мл.
Так как в микробиоценозах кишечника людей, получавших антибиотики, отмечено наиболее частое изменение популяции эшерихий, на следующем этапе нами была проанализирована зависимость между содержанием лизоцима в копрофильтратах и содержанием эшерихий с измененной ферментативной активностью в составе микрофлоры. С этой целью были отобраны группы людей, у которых 100% высеваемых эшерихий имели либо нормальную, либо сниженную ферментативную активность при нормальном количестве бифидо- и лактобактерий. Результаты сопоставления представлены в таблице 35.
Частота обнаружения лизоцима в копрофильтратах была практически равной как в группе людей, из микрофлоры кишечника которых выделялись эшерихии с нормальной ферментативной активностью, так и людей, у которых вегетировали эшерихии со сниженной ферментативной активностью (87,7 ± 3,6% и 85,4 ± 3,7%). Среднее количество лизоцима в копрофильтратах обследованных групп также было одинаковым.
По данным литературы данным (О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, 1976) эшерихии не обладают выраженной способностью к продукции лизоцима. С другой стороны, в результате нашего изучения антилизоцимной активности эшерихии с нормальной и сниженной ферментативной активностью, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника (Е.В. Голошва с соавт., 1999), был обнаружен достаточно низкий уровень экспрессии этого признака у данных микроорганизмов. Данные обстоятельства, вероятно, и объясняют отсутствие влияния ферментативной активности эшерихии на концентрацию лизоцима в кишечнике.
