Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1. Особенности окислительных процессов в митохонд риях насекомых. Компоненты дыхат ельной цепи. 8
2, Роль субстратов в функционировании ферментных и полиферментных мембраносвязанных систем . 13
3. Роль митохондрий в процессах внутриклеточной регуляции 18
4. Структурно-функциональные изменения биологических мембран под действием биологически активных веществ.
4.1. Пестициды как биологически активные вещества.22
4.2. Современные представления о механизмах действия пестицидов 25
4.3. Влияние биологически активных веществ на структурно-футщиональную организацию мембран митохондрий 29
4.4. Совместное действие двух ингибиторов на активность цепи переноса электрона в митохондриях 33
Глава 2. Материалы и методы J37.
1. Получение говлогената из грудных отделов жука T.motttor 37
2. Получение эритроцитов кролика 37
3. Методика регистрации низкотемпературных дифференциальных спектров субмитохондриальных частиц 37
4. Методика определения НАД.Н-оксидазной активности гомогената и СМЧ из Т.тоШог без и в присутствии биологически активных веществ 38
5. Измерение парциальных активностей субмитохондри-альных частиц без и в присутствии БАБ 4П
6. Методика экспериментов по изучению стабилизации субмитохондриальных частиц сукцинатом
7. Методика регистрации и обработки спектров ЭПР 42.
8. Определение коэффициентов распределения БАБ. 43
9. Методика приготовления образцов и регистрации ИК-спектров 45
10. Статистическая обработка результатов 45
11. Характеристика использованных химических соединений 46
Глава 3. Разработка методжй получения сувштохоццриальных частиц из tenebeio m0lit0e. и подбор условий регистрации их функциональной активности 50
1. Получение гомогената из Т. motitor и подбор условий измерения его НАД.Н-оксидазной активности 50
2. Влияние времени инкубации, бычьего сывороточного альбумина и переосавдения на активность гомогената 53
3. Получение субмитохондриальных частиц из Т. тоШог. 58
4. Подбор условий регистрации функциональной активности субмитохондриальных частиц из Т. тоШог. 64
Глава 4. Стабилизация дыхатмьной цепи субстратом и связанное с ней уменьшение удельной над.н-оксидазной активности 67
1. Изучение стабильности фрагментов внутренних мембран митохондрий из T.molUor при различных температурах. Термоиндуцированные структурно-функциональные изменения СМЧ из Т. тоШог 67
2. Влияние сукцината на стабильность субмитохондриальных частиц из T.molUor при инкубации при 30. 74
3. Распределение бензо-Чсарболинового зонда в Суспензии субмитохондриальных частиц из Т. mot і tor. 78
4. Изучение субстрат-ивдуцированной кинетики восстановления бензо-^г-карболинового зонда в суспензии СМЧ из Т. molitor 83
Глава 5. Изучение шшния биологически активных бществ на дшатшышо цепь сувштоховдриалъных частиц из темевшо M0lit0b 96
1. Выявление структурно-функциональных нарушений мембран митохондрий под действием биологически
активных веществ 96
2. Изучение влияния дилора и гептахлора на структурную организацию мембран СМЧ из Т. тоїїїог 121
3. Изучение влияния биологически активных веществна НАД.Н-оксидазную активность субмитохондриальных частиц из Т. rnolitor 125
4. Влияние биологически активных веществ на стабильность дыхательной цепи СМЧ из Т. monitor 132
5. Исследование взаимодействий N-фенил- hf',N -диэтилен-триамида фосфорной килоты (соединения А-4) с некоторыми компонентами биомембран 138
6. Изучение совместного действия двух ингибиторов на функциональную активность СМЧ из Т. mol'dor : поиск синергистов 145
Выводы 160
Литература 161
Принятые сокращения и обозначения 178
- Роль субстратов в функционировании ферментных и полиферментных мембраносвязанных систем
- Методика регистрации низкотемпературных дифференциальных спектров субмитохондриальных частиц
- Влияние времени инкубации, бычьего сывороточного альбумина и переосавдения на активность гомогената
- Влияние сукцината на стабильность субмитохондриальных частиц из T.molUor при инкубации при 30.
Роль субстратов в функционировании ферментных и полиферментных мембраносвязанных систем
Существующее в литературе мнение о том, что субстрат способен выступать в определенных условиях в роли стабилизатора фермента, а также полиферментных мембраносвязанных систем, вряд ли следует подвергать сомнению, поскольку в настоящее время имеется достаточное количество экспериментального материала, прямо указывающего на правильность этого утверждения. Например, Росси с соавт. при изучении так называемой растворимой НАД.Н-дегидрогеназы, выделенной из экстракта, полученного путем обработки (Ж из сердца быка фосфолипазой А, установили, что субстрат окисления НАД.Н в анаэробных условиях стабилизировал фермент по функциональной активности - НАД.Н:феррицианид-оксидоредуктазной активности - к деградирующему действию температуры / 15 /. В отсутствие субстрата или в аэробных условиях происходила потеря каталитической активности фермента, сопровождающаяся появлением НАД.Нгцитохром о-оксидоредуктазной активности. В то же время авторами было отмечено, что НАД.Н как в анаэробных так и в аэробных условиях независимо от изученного интервала температур (20-37) вызывает фрагментацию изучаемого фермента, наблюдаемую по появлению новых фракций белка более низкого молекулярного веса, чем исходный, при пропускании экстракта через сефадекс G-200. Однако, каталитическая активность при наличии фрагментации остается без изменения в анаэробных условиях. Принимая во внимание результаты работы Росси с соавт. можно выдвинуть тезис о том, что субстрат может выступать не только в роли стабилизатора фермента, но и в других условиях выполнять функцию дестабилизатора, поскольку в этой же работе имеются данные о том, что быстрая НАД.Н-индуцированная фрагментация в аэробных условиях сопровождается инактивацией растворимой НАД.Н-дегидрогеназы / 15 /.
Рассмотрим в свете этого тезиса работу Лузикова В.Н. с соавт. по влиянию субстратов на стабильность дыхательной цепи и ее фрагментов / 16 /. В работе было показано, что НАД.Н вызывает инактивацию комплекса I при температуре 38 ( в отсутствие субстрата комплекс I более стабилен). Аналогично влияние НАД.Н на систему комплексов МП при температуре 38, причем авторы показали, что и цитохром с вызывал инактивацию комплексов І+Ш. Наибольшая же инактивация регистрировалась в случае инкубации системы комплексов І+Ш с НАД.Н и цитохромом с. На основании этих данных и данных, полученных в дальнейших работах, авторы делают вывод, что субстраты не способны предохранять фрагменты дыхательной цепи от деградации, а фрагменты стабилизируются лишь в том случае, когда они входят в состав дыхательной цепи / 17, 18 /. Такой вывод авторов справедлив, по-видимому, только в аэробных условиях, поскольку данные Росси с соавт. указывают на обратное действие субстрата в анаэробных условиях/15 /. Поэтому не исключено, что наблюдаемые Лузиковым В.Н. с соавт. эффекты, связанные с дестабилизацией комплексов I и І+Ш в присутствии НАД.Н,в анаэробных условиях не наблюдались бы, и НАД.Н в анаэробных условиях наоборот стабилизировал бы комплексы, что находилось бы в соответствии с работой / 15/. В настоящее время имеются указания в пользу обеих точек зрения относительно роли субстратов в процессах стабилизации и дестабилизации ферментных систем. Так, в работе / 19 / было показано, что субстраты дыхания защищали сущинатдегидрогена-зу от ингибирующего действия этоксимуравьиного ангидрида, который избирательно ингибировал электронный транспорт в СМЧ на участке KoQ-цитохром с. На примере СШ из сердца свиньи Денан-ту с соавт. удалось показать, что адриамицин- 5е3+-усиленное перекисное окисление липидов (П0І) удается снять при высоких скоростях окисления субстрата (более 50 нмолей НАД.Н/мин на I мг белка), однако при низких скоростях окисления (5-15 нмолей НАД.Ц/мин/мг белка) адриамицин-Ре3+-усиленное ПОД ускорялось в 2 раза / 20 / Далее, на микросомальных ферментных системах Попова В.И. с соавт. показали, что добавление субстрата (ами-нопирина) к микросомальному цитохрому Р-450 из печени крысы приводит к уменьшению степени инактивации цитохрома, индуцированной нитроксильными иодсодержащими радикалами, которые ковалентно связываются с активным центром фермента, вызывая его инактивацию / 21
Примеры субстрат-индуцированной инактивации простых ферментов подробно анализируются в обзоре Наградовой Н.К. / 22 /. Деградирующее действие субстрата было продемонстрировано в работе Курганова Б.И. с соавт. Ими изучалось действие трипсина на регуляторний фермент фосфорилазу Б и оказалось, что в присутствии активатора фермента (АМФ) или ингибиторов фермента (АТФ, глюкозы, глюкозо-б-фосфата) расщепление трипсином замедлялось, однако в присутствии субстрата глюкозо-1-фосфата оно ускорялось с ростом концентрации субстрата / 23 /.
Интересными представляются данные Костовой СВ. При изучении термостабильности ферментных комплексов митохондрий миокарда кроликов автор обнаружила, что субстрат дыхания НАД.Н при инкубации в аэробных условиях снижал активность НАД.В-оксидазы на 24$ по сравнению с исходной, в то время как в отсутствие субстрата комплекс І+Ш+ІУ был стабилен при 30 / 24 /. Автор полагает, что субстрат "каким-то образом дестабилизирует ферментный комплекс".
Авторы перечисленных работ по разному смотрят на механизмы, за счет которых происходит стабилизация и дестабилизация ферментных систем в присутствии субстратов. Росси с соавт. в свое! работе основные причины наблюдаемых эффектов объясняют возможностью таких конформационных изменений в молекуле НАД.Н-дегид-рогеназы при присоединении субстрата, которые делают структуру фермента достаточно стабильной в анаэробных условиях, но при этом обнажаются группы, способные модифицироваться при доступе кислорода. То есть стабилизация объясняется образованием комплекса фермент-субстрат, поскольку замена субстрата на его малоактивные аналоги не снимала защитного эффекта, хотя и несколько снижала его / 15 /.
Методика регистрации низкотемпературных дифференциальных спектров субмитохондриальных частиц
Дифференциальные спектры СМЧ из Т. то Lit or регистрировали на 2-х лучевом 2-х волновом спектрофотометре " Hit АС hi -557" (Япония) в специальных низкотемпературных кюветах с толщиной поглощающегося слоя I мм при температуре жидкого азота (77 К). Рабочая кювета содержала СИ в восстановленном состоянии, а кювета сравнения - (Ж в окисленном состоянии. Окисление проводили Б 02 (3,0$), восстановление - НАД.Н (60 мМ). Концентрация белка в обеих кюветах была 25,2 мг/мл. Среда измерения содержала буфер трис-НС1 50 мМ, рН 7,6; 10 мМ ЭДТА; 0,32 М сахарозы. Начальную удельную НАД.Н-оксидазную активность определяли спектрофотометрически на регистрирующем спектрофотометре " Н ita-chl -557". Типичная кинетическая кривая окисления НАД.Н кислородом в присутствии (Ж представлена на рис. 2. Удельную активность ( Ауд#) определяли по формуле: где VMaKC = 4г- - максимальная скорость окисления НАД.Н при Х= 339 HM,!D- оптическая плотность, t- время измерения в мин., 6 - молярный коэффициент экстинкции НАД.Н при Х=: 339 нм, равный 6,22 мМ"" см"1, - толщина поглощающего слоя ( 1см ), Белок) - концентрация белка в суспензии (Ж или нефракциони-рованного гомогената в среде измерения в мг/мл или мкг/мл. Среда измерения при определении А__ содержала буфер трис-НС1 30 мМ, рН 7,6; 6,2 мМ сахарозы; 87 мкМ ЭДТА и СМЧ или гомогенат (40-70 мкг белка/мл). Начальная концентрация НАД.Н - 140 мкМ. Реакцию начинали введением НАД.Н в среду измерения. Относительную НАД.Н-оксидазную активность определяли по формуле А0ТНв = А(/ А0, где А и AQ - удельные НАД.Н-оксидаз- ные активности (Ж или гомогената в присутствии этанольного раствора ЕАВ и этанола, соответственно.
В работе использовали следующую последовательность ввода реагентов: буфер трис НСІ, СМ или гомогенат, этанольный раствор ЕАВ (конечная концентрация этанола в среде измерения не более 2,7 об.#), НАД.Н. Измерение парциальных активностей проводили на регистрирующем спектрофотометре " Hitachi -557" при 30. НАД.Н:цитохром с- и сукцинат:цитохром с-оксидоредуктазные активности СМЧ определяли по скорости восстановления субстратом (НАД.Н или сукцинатом, соответственно) экзогенного окисленного цитохрома с / 112 /. За реакцией следили по скорости увеличения оптической плотности при А= 550 нм (максимум поглощения восстановленного цитохрома с).
Среда измерения содержала буфер трис-Ш1 30 мМ, рН 7,6; I мМ цианида натрия; 56 мкМ цитохрома с; 6,2 мМ сахарозы; 87 мкМ ЭДТА; 40-70 мкг белка СМЧ/мл. Реакцию начинали добавлением в среду измерения субстратов: 140 мкМ НАД.Н или 8,2 мМ сукцината, соответственно. В кювете сравнения был буфер и 56 мкМ цитохрома с. При изучении влияния пестицидов на НАД.Н:цитохром с-оксидо-редуктазную активность учитывали их влияние только на ротенон-чувствительную активность, которая составляла 65-70$ общей НАД.Н:щтохром с-оксидоредуктазной активности. На ротенон-не-чувствительную активность СМЧ изученные соединения не влияли. НАД.Н:феррицианид- и НАД.Н:менадион-оксидоредуктазные активности СМЧ определяли по скорости окисления НАД.Н феррици-анидом или менадионом (витамин Kg), которую регистрировали по скорости уменьшения оптической плотности при А= 339 нм / ИЗ /. Среда измерения содержала буфер трис-НС1 30 мМ, рН 7,6; 21 мМ цианида натрия; 870 мкМ феррицианида калия или 442 мкМ мена-диона; 6,2 мМ сахарозы; 87 мкМ ЭДТА; СМЧ (40 мкг белка при определении НАД.Н-феррициаїшд-оксидоредуктазной активности и 50-70 мкг белка/мл при определении НАД.Н:менадион-оксидоредук-тазной активности). Менадион вводили из этанольного раствора. Реакции начинали введением НАД.Н в среду измерения (140 мкМ). Результаты представляли в виде кривых изменения относительной парциальной активности (А/ Ап), где А? и Ап - парциальные активности в присутствии этанольного раствора БАБ и этанола.
Влияние времени инкубации, бычьего сывороточного альбумина и переосавдения на активность гомогената
Перед фракционированием гомогената (для получения субмито-хондриальных частиц) нами были изучены некоторые его свойства. Прежде всего мы изучили зависимость изменения НАД.Н-оксидазной активности гомогената от времени инкубации. Типичная кривая изменения НАД.Н-оксидазной активности от времени инкубации представлена на рис. 6. Из данных рис. 6 видно, что эта зависимость имеет сложный характер. Б начальный момент времени инкубации активность гомогената из Т. moUtor возрастает, по-видимому, за счет набухания митохондрий, приводящего к нарушению целостности внешних мембран митохондрий. Достигнув своего максимального значения, НАД.Н-оксидазная активность гомогената через 2-4 часа инкубации начинает уменьшаться. Наблюдаемое уменьшение активности связано, вероятно, с нарушением стабильности полиферментных систем, приводящим к их деградации и/или накоплением ингибиторов, в частности, свободных жирных кислот. Для разрыва наружной мембраны митохондрий млекопитающих, например при получении СМЧ из сердца быка, используют такие агенты как щелочь, спирт или подвергают суспензию митохондрий действию ультразвука / 101,124 /. Для насекомых же многие исследователи отмечают большую лабильность митохондрий, которые при инкубации начинают быстро терять способность к сопряженному с окислением фосфорилированию, что может быть одним из следствий нарушения внешней мембраны. Мы также склонны отметить, что митохондрии мучного хрущака весьма лабильны, и нарушение целостности наружной мембраны может происходить в мягких условиях за счет осмотического разрыва и/или в результате защелачивания среды.
Далее был установлен характер влияния БСА на НАД.Б-оксидаз-ную активность гомогената из Т. molltor . Для этого были получены кривые изменения активности гомогената, полученного без и в присутствии БСА. Данные представлены на рис. 7. Оказалось, что в обоих случаях кривые имеют приблизительно равные максимумы, однако, различающиеся по времени их появления. Сначала выявляется максимум активности для гомогената, полученного в отсутствие БСА (кривая I), а затем для гомогената, полученного в присутствии БСА в среде выделения (кривая 2). Такое различи между гомогенатом, инкубировавшимся без и в присутствии БСА? хорошо согласуется с предположением об осмотическом нарушении внешней мембраны митохондрий, потому что введение БСА уменьшает градиент концентрации внутримитохондриальных веществ по отношению к окружающей среде. Таким образом, из приведенных данных видно, что БСА стабилизирует фракцию митохондрий за счет уменьшения осмотического нарушения внешних мембран и тем самым препятствуя прохождению НАД.Н к ферментам внутренней мембраны митохондрий.
Кроме того, нами было изучено влияние переосаждения на активность гомогената. На рис. 8 представлены кривые изменения активности гомогената, супернатанта и осадка, полученного после центрифугирования гомогената в течение 10 мин. при 200 , через 30 минут после выделения. Как видно из полученных данных, митохондриальная фракция в этих условиях осаждается, и изменение НАД.Н-оксидазной активности наступает раньше, чем в исходном гомогенате. Наблюдаемые различия можно объяснить с одной стороны-за счет осмоса, когда в ресуспендированном осадке увеличивается градиент концентрации внутримитохондриальных веществ по отношению к инкубационной среде, и нарушение наружной мембраны митохондрий происходит раньше, а с другой стороны - с наличием ингибиторов, которые остаются в супернатанте, поскольку известно, что, например, свободные жирные кислоты, присутствующие в биологических мембранах, являются ингибиторами НАД.Н-оксидазы / 125 /. С увеличением времени инкубации активность гомогената и осадка по своим значениям достигают равных величин, сливаются, и в дальнейшем происходит уменьшение активностей, связанное, вероятно, с нарушением стабильности частиц.
Таким образом, из приведенных выше экспериментальных данных видно, что после получения исходного гомогената время выделения становится существенным признаком, так как после 2-4 часов после получения .гомогената наблюдается спад НАД.Н-оксидазной активности. БСА, по-видимому, нецелесообразно использовать в качестве компонента среды выделения, так как он стабилизирует митохондрии, уменьшая разрыв внешней мембраны. Поэтому в дальнейшем мы не использовали БСА в среде выделения.
Влияние сукцината на стабильность субмитохондриальных частиц из T.molUor при инкубации при 30.
Данные, приведенные в 1 настоящей главы, свидетельствуют о неустойчивости СШ из насекомых при повышенных температурах. В работах Лузикова Б.Н. с соавт. /16-18,26,27/ было показано, что в условиях переноса электрона через дыхательную цепь митохондрий происходит увеличение ее термостабильности, устойчивости к протеолизу и действию лшголитического фермента фосфоли-пазы А2. Б этих работах также было показано, что эффект стабилизации дыхательной цепи характерен для всей системы в целом, а не для отдельных ее фрагментов, йало высказано предположение, что стабилизация может быть связана со структурными изменениями в мембранах субмитохондриальных частиц / 27 /. Б связи с неустойчивостью СМЧ из T.molLtor при повышенных температурах было исследовано действие субстрата дыхания сук-цината, как агента, способного стабилизировать дыхательную цепь насекомых к деградирующему действию температуры. На рис. 17"а" представлены кривые инкубации суспензии СМЧ без и в присутствии сукцината в аэробных условиях. Оказалось, что СМЧ, содержащие сукцинат, действительно становятся устойчивыми при температуре 30 и не подвергаются деградации в отношении НАД.Н-оксидазнои активности (кривая 2) по сравнению с частицами, инкубировавшимися в отсутствие субстрата, которые такой устойчивостью к действию температуры не обладали (кривая I). При длительных временах инкубации СМЧ с сукцинатом (более 50 мин.) наблюдается излом кинетической кривой (кривая 2), связанный с израсходованием субстрата, после чего происходит монотонное уменьшение НАД.Н-оксидазной активности.
Таким образом, дыхательная цепь насекомых, также как и млекопитающих, стабилизируется в присутствии субстрата окисления в аэробных условиях к действию температуры, которая в отсутствие субстрата вызывает деградацию цепи переноса электрона. Однако, в изученных экспериментальных условиях мы наблюда- ли, что эффект стабилизации дыхательной цепи сукцинатом сопровождался быстрым уменьшением удельной НАД.Н-оксидазной активности СМЧ (так называемый "сброс" активности) в начальный момент времени инкубации на 10-50$ в зависимости от получаемого препарата СМЧ. На рис. 17 "б" представлены в качестве примера данные для уменьшения активности на 50$. Было обнаружено, что глубина уменьшения НАД.Н-оксидазной активности в начальный момент времени инкубации СМЧ с сукцинатом (глубина "сброса") существенным образом зависела от концентрации субстрата в инкубационной среде. На рис. 18 "а" приведены данные по изменению относительной НАД.Н-оксидазной активности СМЧ из Т. moeitor в зависимости от начальной концентрации сукцината в среде инкубации в момент времени I мин. Из данных, представленных на рис. 18 "а", видно, что "сброс" происходит, начиная с определенной концентрации сукцината - 0,5 мМ. Характер зависимости, приведенной на рис. 18 "а", указывает на возможность кооперативно-структурных изменений, происходящих в мембранах СМЧ при добавлении определенных концентраций субстрата. Для доказательства этого предположения мы исследовали субстрат-индуцирован-ное восстановление спинового зонда в мембранах СМЧ из Т. mollior. Предварительно было изучено распределение используемого зонда в суспензии субмитохондриальных частиц.
В качестве зонда мы использовали спинмеченное производное бензо-р-карболина (структурную формулу см. рис. 3). Известно, что этот зонд частично растворим в воде и хорошо встраивается в мембранные структуры, в частности мембраны СМЧ из сердца быка / 107 /. Его спектр представляет собой суперпозицию по крайней мере двух сигналов, обусловленных молекулами зонда, связанными с биологической мембраной и растворенными в водной фазе (узкий триплетный сигнал). Нами было исследовано распределение бензо-Г-карболинового зонда в суспензии СМЧ из T.moUtor, Для этого были зарегистрированы спектры ЭПР бензо- -карболино-вого зонда в суспензии СМЧ при различном соотношении мембрана/ зонд . Данные представлены на рис. 19 "а". Из приведенных данных видно, что с увеличением концентрации СМЧ амплитуца "узких" линий, обусловленных молекулами зонда, растворенными в воде, уменьшается, одновременно возрастает амплитуда широкого сигнала от зондов, связанных с мембраной. В качестве характеристики относительного содержания зонда в мембранной и водной фазах суспензии использовали параметр д , равный отношению амплитуд низкополевых компонент спектра ЭПР от зонда, связанного и несвязанного с мембраной (см. рис. 3). На рис. 19 "б" приведена зависимость параметра л от соотношения концентраций СМЧ (по белку) и зонда в образце. Видно, что эта зависимость носит S-образный характер с выходом на плато. Информацию об изменении структуры биомембран можно получить при анализе компонент сигнала ЭПР от зонда, локализованного в мембранной фазе.
Похожие диссертации на Мембраны митохондрий из TENEBRIO MOLITOR и их структурно-функциональные изменения под действием биологически активных веществ
