Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
Структурная организация белков мембранного скелета эритроцитов 9
Периферические белки 9
Интегральные белки 12
Структурные переходы мембран эритроцитов 13
Область температур 17-25 С 14
Область температур ниже 17 С 16
Область температур 25-46С 17
Область температур 40—90С 18
Биологическая роль тритерпеновых гликозидов 22
Основные физико-химические характеристики тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда и ихагликонов 22
Фармакологическое действие 23
Действие наЦНС 24
Действие на поведенческие реакции 25
Антитромботическое действие 26
Иммунологические аспекты действия гликозидов 27
Антиканцерогенное действие 29
Действие женьшеня на диабет 29
Некоторые биохимические аспекты действия женьшеня и его гликозидов 30
Некоторые биофизические аспекты действия гликозидов 34
Действие тритерпеновых гликозидов и фракции сапонинов женьшеня на модельные и биологические мембраны 37
Гемолитическое и антигемолитическое действие гликозидов 39
ГЛАВА II. Материалы и методы 44
Материалы и реактивы 44
Получение эритроцитов человека и их теней 45
Приготовление многослойных везикул 45
Гиперосмотический гемолиз 46
Электронно-микроскопическое исследование 46
Микрокалориметрическое исследование 47
Исследование электрических характеристик липидного бислоя 48
Статистическая обработка данных 49
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 50
1. Гиперосмотический гемолиз эритроцитов и действие фракции сапонинов и тритерпеновых гликозидов 50
2. Влияние гликозидов на термоденатурацию белков мембранного скелета эритроцитов в изотонических и гиперосмотических условиях..55
3. Влияние гликозидов и их агликонов на фазовые переходы липидных мембран 64
Влияние общей фракции сапонинов 66
Влияние 20(5)-протопанаксатриола 66
Влияние 20(3)-протопанаксадиола 67
Влияние гликозидов Rb1 и Rg1 67
Влияние агликонов на фазовое поведение ДПФХ в смеси с холестерином 67
4. Исследование действия тритерпеновых гликозидов женьшеня на бислойные липидные мембраны 74
Ионные каналы фракции сапонинов женьшеня в липидной мембране 75
Действие на мембрану протопанаксадиола, протопанаксатриола, гликозидов Rh1l Rg1, Rb1 76
Заключение 80
Выводы 82
Список литературы
- Периферические белки
- Область температур ниже 17 С
- Антитромботическое действие
- Приготовление многослойных везикул
Введение к работе
Актуальность проблемы
Тритерпеновые гликозиды (сапонины) составляют многочисленную группу природных физиологически активных веществ и обладают широким спектром медико-биологического действия [Анисимов, Чирва, 1980].
Среди множества типов тритерпеновых гликозидов тетрациклические тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда (ТГДР) представлены в различных видах корня женьшеня [Чирва и др., 1990], причем наибольшее их содержание отмечается в корнях женьшеня Panax ginseng С.А. Meyer, который используется как средство народной медицины в течение многих веков в странах Восточной Азии. Фармакологические и клинические исследования показали его действительную ценность, и в настоящее время он официально признан и занесен в государственную фармакопею многих стран мира.
Стимулирующее и антистрессовое действие, повышение сопротивляемости организма и противовоспалительное действие, антиканцерогенное и мягкое нормализующее действие на кровяное давление и метаболизм сахара в крови, ЦНС-стимулирующее свойство, положительное влияние на функцию половых желез - это далеко не полный перечень действий женьшеня [Брехман, 1957; Грушвицкий, 1961; Elyakovet al., 1964].
Фармакологические и физиологические эффекты экстрактов женьшеня обусловлены активностью содержащихся в них компонентов, которые удалось идентифицировать сравнительно недавно. Проведенные химические исследования с использованием современных хроматографических и спектроскопических методов позволили значительно продвинуться на пути к установлению химической структуры этих молекул.
В настоящее время из корня женьшеня выделено и идентифицировано около 30 видов гликозидов, которые, как принято считать, и являются основными действующими компонентами [Shibata, 1985,1986].
Разнообразную активность, которую проявляют экстракты женьшеня (фракции сапонинов) и его высокоочищенные соединения (гликозиды) на уровне организма, связывают с их влиянием на процессы, происходящие на клеточном уровне. Показана активация внутри- и межклеточных сигнальных систем, отдельных ферментов, а также основных биохимических процессов, связанных с ростом и дифференцировкой клеток [Odashima et al., 1985; Ota et al., 1987].
Функциональное состояние клеток напрямую зависит от структуры клеточной мембраны и системы ионного транспорта, поэтому исследование влияния гликозидов женьшеня на эти системы является актуальной проблемой для понимания молекулярных механизмов фармакологического действия женьшеневых препаратов.
Имеющиеся в литературе данные не позволяют установить детальные механизмы действия гликозидов на биомембрану. До сих пор остается открытым вопрос о природе взаимодействия гликозидов с липидным матриксом биомембраны. По сей день нет единого мнения о механизмах гемолитического действия тритерленовых гликозидов. Детали же антигемолитической активности гликозидов женьшеня вообще не исследованы [Shibata, 1985, 1986; Joo, 1990].
Выбор в качестве объекта исследования эритроцитарнои мембраны обусловлен тем, что структура эритроцитарнои мембраны наиболее хорошо изучена и является адекватной моделью мембран клеток других тканей и органов [Bennett and Gilligan, 1993].
В качестве основного метода исследования мембран эритроцитов в работе использовали дифференциальную адиабатную сканирующую микрокалориметрию ДСК). Выбор данного метода обусловлен его высокой эффективностью в исследовании структуры мембран. ДСК является единственным методом, позволяющим на основе анализа температурной зависимости удельного теплопоглощения мембран одновремменно получить информацию о структуре и характере взаимодействия друг с другом всех основных белков (спектрина, анкирина, актина, белков 4.1 и 4.2, белка полосы-3) нативной мембраны.
Цель и основные задачи исследования
Целью работы являлось исследование действия фракции сапонинов и тритерленовых гликозидов женьшеня C.A.Meyer на эритроциты, эритроцитарные и модельные липидные мембраны.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучение влияния фракции сапонинов и гликозидов женьшеня на эритроциты при гиперосмотическом гемолизе.
2. Исследование влияния фракции сапонинов и гликозидов на структуру белковых доменов мембран теней эритроцитов в изотонических и гиперосмотических условиях.
-7 3. Исследование действия фракции сапонинов и гликозидов женьшеня на термоиндуцированные фазовые переходы в фосфолипидных мембранах.
4. Изучение каналоформиругащих свойств тритерпеновых гликозидов и фракции сапонинов на бимолекулярных липидных мембранах.
Научная новизна работы
Полученные данные расширили и углубили знания о механизмах действия гликозидов женьшеня на клеточном и мембранном уровнях. Впервые показано, что гликозиды женьшеня оказывают защитное действие на эритроциты при гиперосмотическом гемолизе. Подробно исследован механизм антигемолитической активности гликозидов. Показано, что антигемолитическая активность гликозидов носит концентрационно-зависимый характер.
Впервые обнаружены структурные изменения, происходящие в мембранном скелете эритроцитов при действии гликозидов женьшеня и гиперосмотического шока.
Изучено влияние гликозидов на фазовое состояние липидных мембран из дипальмитоилфосфатидилхолина. Обнаружено, что гликозиды влияют на упаковку липидов в искусственной мембране.
Впервые показано, что при встраивании гликозидов женьшеня в модельные липидные мембраны, содержащие холестерин, происходит формирование одиночных ионных каналов. Получена информация об основных физических характеристиках этих одиночных каналов.
Научно-практическая ценность
Результаты работы вносят вклад в понимание механизмов биологического действия тритерпеновых гликозидов женьшеня на клеточные мембраны и могут быть использованы при разработке антигемолитических препаратов нового поколения для применения в медицинской практике.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы докладывались на 6-м Международном симпозиуме "Life Science" (Таэчжон, Республика Корея, 1994), Международном симпозиуме "Euroasian symposium on current trends in biotechnology" (Анкара, Турция, 1995), 4-й Конференции молодым ученых (Пущино, 1999), 2-м съезде биофизиков России (Москва, 1999), научных конференциях и семинарах ИБК РАН.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 7 статей в реферируемых журналах.
Структура диссертации
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Заключения и Выводов, изложенных на 103 страницах. Диссертация содержит 19 рисунков и 1 таблицу. Список цитированной литературы включает 237 источника.
Периферические белки
Спектрин. Мембранный каркас образован сетью молекул спектрина. Спектрин состоит из двух субъединиц: а (молекулярный вес 260 кДа) и р (молекулярный вес 225 кДа), по «200000 копий на клетку каждой, собранных в 105 тетрамеров [Bennett, 1985]. Белок мигрирует на электорофорезе в виде двух полос. Спектрин играет основную роль в сборке мембранного скелета в двумерную сеть с помощью актина и других белков. Спектрин-актиновыи комплекс содержит 4 основных белка: спектрин, актин, белок полосы 4.1, белок полосы 4.9. [Bennett, 1990]. Таких комплексов в эритроците насчитывается около 30000 [Gilligan and Bennett, 1993].
Аниирин мигрирует при электрофорезе в составе полосы 2.1, имеет молекулярный вес 206 кДа, состоит из трех доменов [Lambert et al, 1990]. В мембране эритроцита присутствует около 100000 молекул [Bennett, 1985]. Анкирин был открыт в эритроците как белок с высоким сродством к спектрину [Bennett, 1992]. Главная функция анкирина состоит в специфическом связывании сс-спектрина с цитоплазматическим фрагментом белка полосы 3 [Lambert et al, 1990; Lux et al, 1990; Michaely and Bennett, 1992]. На анкирине расположено два центра связывания цитоплазматического фрагмента белка полосы 3 [Davis et al, 1991; Michaely and Bennett, 1995].
Белок 4.1 представлен двумя изоформами "а" и "в" с молекулярным весом 80 и 78 кДа соответственно и мигрирует на электрофорезе двумя полосами. Изоформы отличаются С-концевым доменом в 24 кДа и 22 кДа соответственно. По мнению ряда авторов, изоформа 4.1 в свойственна молодым эритроцитам и ретикулоцитам, а изоформа 4.1а - зрелым и старым клеткам [Conboy, 1993]. Белок 4.1 не взаимодействует непосредственно с актином, но взаимодействует со спектрином [Tyler et al, 1980]. Белок 4.1 связывается в хвостовой части спектрина в области связывания актина и участвует в образовании высокостабильного комплекса спектрин-белок 4.1-актин (1:1:1) [Discher et al, 1995]. Кроме спектрина он взаимодействует с тропомиозином и белком полосы 4.9 [Sauberman et al, 1979; Mueller et al, 1987; Bennett 1990]. Белок представлен в мембране в количестве 200000 мономеров на клетку [Bennett, 1985], Основной мембранный центр связывания белка 4.1 расположен на N-концевой части цитоплазматического фрагмента белка полосы 3 [Jons and Drenckhahn, 1992; Lombardo et al, 1992]. Белок полосы 3 связывает основное количество белка 4.1 [Pasternack et al, 1985; Hemming etal, 1995]. Другой центр связывания белка 4.1 с мембраной расположен на гликофоринах А, С, D и белке р55.
Белок 4.2 (паллидин) с молекулярным весом весом 72 кДа присутствует в количестве -200000 молекул на эритроцит [Bennett, 1985] и связан с цитоплазматическим фрагментом белка полосы 3, анкирином и белком 4.1 [Cohen et al, 1993]. Функция белка 4.2 все еще не ясна, но четко показана способность взаимодействовать и стабилизировать четвертичную структуру в комплексе анкирин-белок полосы 3 [Bennett, 1990].
Белок 4.9 (дематин) состоит из двух полипептидов с молекулярной массой 48 кДа и 52кДа. В клетке насчитывается около 43000 тримеров, что примерно равно числу актиновых коротких филаментов [Husain-Chishti et al, 1988]. Агрегат белка мигрирует полосой с молекулярным весом 145-150 кДа. Белок не взаимодействует отдельно со спектрином; но после фосфорилирования связывается с актиновыми филаментами в соединительном комплексе. Основная функция заключается в кэпировании быстрорастущего конца акти нового филамента и поддержании одинаковой длины филамента [Bennet V, 1989]. Белок полосы 4.9 состоит из двух белков; 48 и 52 кДа и образует изолированные тримеры совместно с белком р55 [Home et а!, 1988; Husain-Chishti et al, 1989]. Дематин и р55 связаны с актином [Husain-Chishti et al, 1989].
Актин с молекулярным весом 43 кДа мигрирует в составе полосы 5. В эритроцитах присутствует только одна изоформа актина - р-актин [Pinder et al, 1978]. Актин в составе мембранного каркаса олигомеризован и организован в «30000 коротких протофиламентов из 12-14 мономеров длиной 30-40 нм и представлен в количестве 400000-500000 молекул в клетке [Pinder and Gratzer, 1983]. Каждый актиновый олигомер приходится на четыре спектриновых тетрамера, связывая тем самым тетрамеры спектрина в гексагональную сеть.
Тропомиозин в эритроците присутствует в виде димера с молекулярным весом 60 кДа. Субъединицы с молекулярными весами 29 и 27 кДа мигрируют в составе полосы 7. В эритроците насчитывается около 70000-80000 димеров. Основные функции заключаются в связывании с мономерным актином и стабилизации длины актинового филамента, защите от деполимеризующих белков и регуляции взаимодействия актина со спектрином [Bennett, 1989; Bennett, 1990]
Тропомодулин является тропомиозин-связывающим белком с молекулярным весом около 43 кДа. Центр связывания тропомодулина расположен на конце стержня тропомиозина. В эритроците около 30000 копий белка. Тропомодулин связывается на конце тропомиозина, стабилизируя актин-тропомиозиновый комплекс [Fowler, 1987; Fowler, 1990].
Миозин включает в себя комплекс тяжелых цепей с молекулярным весом 200 кДа и легких цепей 25 и 19,5 кДа. Миозин присутствует в количестве около 4000-6000 молекул на клетку [Fowler et al, 1985; Fowler et al, 1986].
Аддуцин присутствует в количестве 30000 копий на клетку. Белок содержит две субъединицы; а- (81 кДа) и р- (80 кДа). В растворе присутствует в виде гетеродимера. При электрофорезе относительный молекулярный вес оказывается выше и составляет 103 и 97 кДа соответственно за счет хвостового домена аддуцина. Аддуцин стимулирует взаимодействие спектрина с актином за счет образования третичного комплекса спектрин-актин-аддуцин [Gardner and Bennett, 1987; Hughes and Bennett, 1995; Kuhlman et al, 1996; Li and Bennett, 1996] Интегральные белки
Область температур ниже 17 С
Исходя из исследований биологической активности, известный российский ученый Брехман определил женьшень, как адаптоген, который увеличивает приспособляемость организма к изменениям в окружающей среде [Brekhman and Dardymov, 1969].
Фулдер назвал его гармоническим веществом, который контролирует организм при стрессе и поддерживает равновесие. Он показал, что кортикостерон, меченный тритием, связывается с ядрами гиппокампа, гипоталамуса и гипофиза более эффективно у крыс, лишенных надпочечников и яичников, при введении сапонинов женьшеня, по сравнению с контрольными животными [Fulder, 1980].
Саито с сотр. показал влияние женьшеневых препаратов на поведенческие реакции и умственные способности экспериментальных животных [Saito et al.,1984]. Так, например, введение экстракта женьшеня препятствовало уменьшению сексуальной активности, улучшало способность к обучению и препятствовало ухудшению памяти у мышей-самцов, подвергнувшихся стрессу. Гликозид Rbt был эффективен в отношении сохранения способности мышей к обучению и памяти, a Rgi был эффективен только в отношении сохранения сексуальной активности.
По мнению многих исследователей, препараты женьшеня и его отдельные компоненты способны лишь нормализовать отклонения в поведенческой реакции и физиологических процессах, вызванных стрессом, но не оказывают лечебного эффекта при специфических заболеваниях. Так например, существует мнение, что сапонины женьшеня не повышают половую потенцию, как это принято считать, они лишь нормализуют ее при отклонениях от нормы.
Экстракты женьшеня или Rgi слабо снимали усталость у нормальных крыс, но в то же время они существенно способствовали восстановлению организма крыс, подвергнувшихся стрессу.
Сапонины японского женьшеня, которые содержат в значительных количествах олеаноловые тритерпеноиды, в отличие от тритерпеноидов корейского женьшеня, не снимают усталость, не проявляют стимулирующее действие, но демонстрируют транквилизирующее и антиязвенное действие при стрессе. Тот факт, что женьшень действует только при стрессе, указывает на связь эффектов с гормональной функцией надпочечников.
Бомбарделли с соавт., исследуя защитное действие гликозидов против холодового шока, обнаружили, что при этом происходят гистологические изменения, вызванные гиперфункцией гипоталамуса [Bombardelli et al., 1980].
Антитромботнчсскос действие
Медицинская практика показывает, что препараты женьшеня обладают антитромботическим действием. Механизм антитромботического действия был детально изучен Тамура и его группой (Chiba University Medical School). Известно, что тромбогенез тесно связан с увеличением образования тромбоксана Аг (ТХА) и гиперагрегируемостью кровяных пластинок (тромбоцитов). ТХА оказывает мощное агрегирующее действие на тромбоциты и играет важную роль в агрегации тромбоцитов, стимулированной арахидоновой кислотой (АА) или коллагеном. Известно, что ингибирование синтеза ТХА снижает агрегацию тромбоцитов.
Четырехнедельное введение препаратов женьшеня значительно снижало агрегацию тромбоцитов, вызванную коллагеном, ТХА у пациентов с разными сердечно-сосудистыми тромботическими нарушениями [Kumagai, 1993]. При исследовании in vitro было показано, что как Rgi, так и Rg2 оказывают мощное антиагрегирующее действие при стимуляции тромбоцитов коллагеном, АА или U-46619 (стабильный аналог ТХА). С другой стороны, Rg1 не оказывает антагонистического действия на рецептор ТХА. Интересно отметить, что в экспериментах in vitro увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме тромбоцитов, стимулированное U-46619, снижалось при добавлении Rgi в зависимости от его концентрации. При этом наблюдалось соответствующее уменьшение агрегации тромбоцитов. Данный результат свидетельствует о том, что сапонины женьшеня могут нарушать транспорт в клетку ионов Са2+ и тем самым подавлять процессы агрегации тромбоцитов. Отсюда делается заключение о том, что Rgi может снижать стимулированное коллагеном или АА или U-46619 производство ТХА посредством ингибирования входа Са2+.
Гликозиды Rbi, RM, Re и Ra in vitro не оказывали антиагрегирующего действия, однако эти сапонины в кислой среде (например, в желудочном соке) могут превращаться в гликозид R93 и оказывать антитромботическое действие.
Что касается действия препаратов женьшеня на биосинтез PGI2, мощного сосудорасширяющего и антитромботического эйкозаноида, было установлено, что Rc усиливал синтез PGI2 в культуре гладкомышечных клеток. Эндотоксин-индуцированный тромбоз использовался как модель тромбогенеза. Предварительное введение экстракта женьшеня значительно снижало число смертельных случаев.
Сапонины женьшеня Rc (0,1 мкг/мл) и Rb2 (10 мкг/мл) ингибировали атероматозные поражения соответственно на 20% и 60%. Пролиферация гладкомышечных клеток, также дающая вклад в атероматозное поражение, ингибировалась на 50% при введении R0 (5 мкг/мл), причем другие гликозиды не оказывали действия.
Сыворотка крови пациентов, которым в течение 4-х недель вводили препараты женьшеня (2,7 г/день), также ингибировала пролиферацию гладкомышечных клеток на 30% по сравнению с контролем. Сапонины женьшеня увеличивали гидролиз эфиров холестерина. Сильнее всего проявлял зффект гликозид Re - на 30% выше контроля. Ингибирующая способность сапонинов изменялась в следующем порядке: Re Rg2 R0 Rb2. В целом, данные указывают на то, что женьшень нормализует метаболизм липидов и препятствует их аккумуляции.
Антитромботическое действие
Джу, исследуя действие чистых гликозидов или фракции сапонинов женьшеня на различные ферменты - дегидрогеназы, трансаминазы, липазы -обнаружили, что при концентрациях (1-100 мкМ) сапонины стимулируют активность ферментов in vitro. Однако при больших концентрациях сапонины ингибируют ферментативную активность [Joo, 1990]. Авторы считают, что двухфазное и неспецифическое действие сапонинов является следствием их поверхностной активности. На основании этого они предположили, что поверхностная активность сапонинов играет важную роль в активации ферментов.
Исследование влияния сапонинов женьшеня на активность аденилатциклазы плазматической мембраны клеток печени крыс, а также действия на этот фермент известных детергентов - Тритон Х-100, додеци л сульфата натрия позволили также предположить, что поверхностная активность сапонинов играет важную роль в их физиологических эффектах на клеточном уровне [Oh and Joo, 1989].
В последнее время особую актуальность приобретают исследования проблемы повышения уровня холестерина в организме. Известно, что более 93% холестерина содержится в плазматических мембранах клеток, где он выполняет важную структурную функцию, в то время как, только 7% циркулирует в крови. Холестерин транспортируется в плазме в составе макромолекул, названных липопротеинами, которые состоят из специфических белков, холестерина, холестеринэстеразы, триглицеридов и фосфолипидов. При исследовании наследственной гиперхолестеринемии было установлено важное значение так называемых рецепторов липопротеина низкой плотности (LDP). Обнаружено, что это заболевание, связанное с генетическими нарушениями, сопровождается значительным повышением уровня холестерина и LDP. Холестерин начинает откладываться в различных тканях из-за высокого содержания в крови LDP. Наиболее вредным для организма является отложение холестерина в артериальных сосудах, которое приводит к известному заболеванию -32 атеросклерозу. Молекулярные дефекты при гиперхолестеринемии приводят к отсутствию или дефициту LDP -рецепторов [Brown and Goldstein, 1986].
В ряде исследований удалось установить, что сапонины женьшеня обладают способностью предотвращать увеличение уровня холестерина в организме крыс и кроликов при их длительном вскармливании пищей, содержащей значительное количество этого липида [Joo et al., 1980, 1990]. При анализе липидного состава печени крыс было обнаружено, что длительное вскармливание пищей, богатой по содержанию холестерином, приводит к значительному повышению уровня холестерина в печени (в 3 раза выше, чем в контроле). В то же время, если в рацион, богатый холестерином, добавлять гликозиды женьшеня, то уровень отложения холестерина в печени животных снижался почти в два раза. Биохимические исследования позволили установить, что данное явление связано с различными эффектами, которые сапонины индуцируют в организме. В частности, установлено, что гликозиды активируют рецептор LDP, увеличивают сродство рецепторов гепатоцитов к LPD-комплексу.
В клетках яичника китайского хомяка фракция сапонинов, а также отдельные гликозиды Rjst и Rb2 активировали биосинтез рецептора LDP. Исследования позволили установить, что гликозиды снижают уровень холестерина, стимулируя, с одной стороны, его превращение в желчную кислоту, а, с другой, биосинтез стероидных гормонов, что приводит в конечном итоге к снижению ингибирующего действия холестерина на синтез рецептора LDP.
Имеются данные о том, что сапонины женьшеня стимулируют и ряд других ферментных систем. Так, в работах Ли с сотр. сообщается, что сапонины женьшеня существенно повышают биосинтез фосфолипидов в организме крыс [Lee et alM 1981]. Предполагается, что при этом происходит активирование нескольких ферментных систем, ответственных за синтез липидов.
Хун и др. показали, что панаксадиол также снижает уровень холестерина в сыворотке крови и в печени крыс, содержащихся на диете, богатой холестерином [Hyun et al., 1993]. Предполагается, что механизм действия панаксадиола на метаболизм холестерина в сыворотке и в печени несколько отличается от механизма действия RM или клофибрата. Для выявления гиполипидемических свойств панаксадиола было изучено его действие на биосинтез и поглощение холестерина. Панаксадиол проявил концентрационно-зависимое ингибирующее действие на включение меченного ацетата в стеролы печени. В концентрации 0,5 мМ панаксадиол значительно ингибировал синтез стерола из ацетата. Ингибирование увеличивалось с повышением уровня [14С]ланостерина.
С другой стороны, включение [14С]мевалоната в холестерин ингибировалось при добавлении панаксадиола. Стадии трансформации ланостерина в холестерин ингибируются панаксадиолом на стадии биосинтеза холестерина. Абсорбция холестерина ингибировалась на 30% после скармливания панаксадиолом. Панаксадиол может снижать содержание сывороточных липидов и холестерина посредством ингибирования абсорбции холестерина.
Тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда способны индуцировать экспрессию генов в гепатоцитах [Kang et al., 1994]. Было показано, что гликозид Rg1 стимулирует синтез тирозинаминотрансферазы (ТАТ), специфичного фермента гепатоцитов, активность которого ингибируется RU486, антагонистом глюкокортикоидов. Было установлено, что уровень ТАТ-мРНК увеличивался в 9 раза в ответ на стимуляцию Rgi. И наоборот, эффект Ra1 ингибировался с помощью RU488 на 50%. Таким образом, Rgi модулирует ТАТ-транскрипцию через влияние на рецептор глюкокортикоида.
Известно, что ксенобиотики, гормоны и нейромедиаторы вызывают синтез диацилглицерола (ДАГ) и активируют протеинкиназу С (С-киназа) в клетках печени и эти сигнальные молекулы вовлечены в синтез гликогена. В работе Пака с сотр. было обнаружено, что Rbi в зависимости от дозы в культуре гепатоцитов значительно подавляет С-киназу, индуцированную четыреххлористым углеродом и форболовым эфиром [Hwa-Jin Park, 1995]. Включение [ ф-глюкозы и синтез [14СНликогена увеличивалось при введении в культуру Rbt, в то же время выход [иС]-глюкозы из гепатоцитов, который был вызван четыреххлористым углеродом или нифедипином, ингибировался в присутствии Rbi. Введение RM in vivo также приводило к стимуляции синтеза гликогена и ингибированию гипергликемии. Если принять во внимание тот факт, что инициирование синтеза гликогена тесно связана с генезисом опухолей через активацию С-киназы, можно предположить, что Ры стимулирует синтез гликогена и ингибирует генезис опухолей,
Приготовление многослойных везикул
Эксперименты проводились на эритроцитах из свежей крови доноров. Свежую донорскую кровь, консервированную в растворе глюгицира в соответствии с ГОСТ 10782-77, получали на городской станции переливания крови в г.Серпухов Московской области. Кровь транспортировали в контейнерах со льдом.
Цельную кровь разбавляли фосфатно-солевым буфером (ФСБ): 150 мМ NaCI, 5 mM фосфата натрия, рН 7,4 и фильтровали через смесь микрокристаллической и волокнистой целлюлозы (1:1 v/v) для удаления лейкоцитов, лимфоцитов и тромбоцитов согласно [Beutler and West, 1976].
Эритроциты осаждали центрифугированием (5 минут, ЮООд, 0-4 С) и промывали осадок - эритроцитарную массу в ФСБ трижды при тех же условиях центрифугирования. Полученные таким образом эритроциты (гематокрит 50%) хранили на льду при температуре 2 - 4 С.
Мембраны теней эритроцитов получали с помощью гемолиза плотного осадка эритроцитов в 20 объемах 5 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 8,0 (5Р8), 4 С, согласно [Dodge et al,, 1963, Акоев и др., 1991]. Гемолизат центрифугировали 15 минут при 13000д (4 С), осадок мембран промывали в 5Р8 при тех же условиях центрифугирования до полного удаления гемоглобина, дважды промывали средой, в которой проводили экспериментальные измерения. Концентрацию мембран определяли по сухому весу (св.) в миллиграммах после высушивания суспензии мембран в специальных алюминиевых контейнерах в 5 порциях по 200 мкл при 105 С в течение 30 минут. Концентрация теней в эксперименте была 6-7мг/мл. Образцы теней хранили во льду.
Приготовление многослойных везикул
Для приготовления водной дисперсии многослойных везикул из ДПФХ (0,2-0,3 мМ) с холестерином (до 3% по отношению к ДПФХ) и без него использовали фосфолипид и ХЛ без дополнительной очистки согласно методу, описанному в [McMullen et al., 1993]. Гликозиды (1-10% водный раствор) добавляли в приготовленную дисперсию ДПФХ до необходимого весового (в случае ФС) или молярного отношений. Для сравнения взаимодействия препаратов с Lp -фазой геля и жидкокристаллической /.« -фазой суспензию везикул инкубировали соответственно при 20 или 50 С, не менее 30 минут при сильном перемешивании. Данного времени инкубации было достаточно для достижения равновесного распределения гликозидов и получения хорошо воспроизводимых термограмм (среднеквадратичные отклонения (а) величин АН, A7t/2 и Ттзх не превышали соответствующие величины и в контроле).
Гиперосмотнческий гемолиз
Из суспензии эритроцитов брали 50 мкл и переносили в 0,5 мл ФСБ и инкубировали 5 мин при температуре 37 С, затем из этой пробы брали 50 мкл и переносили в 1 мл раствора NaCI заданной молярности и инкубировали 5 мин при 37 С (10s клеток/мл). Далее суспензию эритроцитов осаждали. Уровень гемолиза определяли по оптическому поглощению супернатанта на длине волны 540 нм. За 100% уровень гемолиза выбрано поглощение супернатанта после гемолиза, вызванного 0,1% тритоном Х-100 или сапонином («Sigma»).
Кинетику гемолиза эритроцитов в 4 М NaCI регистрировали на спектрофотометре «Specord - М40» (ГДР) в спецотсеке для мутных образцов по уменьшению оптической плотности раствора на длине волны 720 нм после введения эритроцитов при постоянном перемешивании. Поскольку оптическая плотность суспензии эритроцитов пропорциональна количеству целых клеток в суспензии (105-109 клеток/мл) [Yong et al., 1986], следовательно, измеряемая скорость уменьшения оптической плотности пропорциональна скорости гемолиза эритроцитов [Yong et al., 1986; Руденко и др., 1995]. Гликозиды добавляли в гиперосмотический раствор как до, так и после помещения в него эритроцитов.
Электронно-микроскопическое исследование Образцы для сканирующей электронной микроскопии готовили следующим образом. Эритроциты переносили в растворы NaCI заданной молярности при температуре 37 С, инкубировали в течение 5 мин и добавляли фиксатор - 25% раствор глютаральдегида, из расчета 1,5% его объемной концентрации в конечном растворе. После перемешивания легким встряхиванием суспензию инкубировали в течение 3 ч при температуре 4 С, затем клетки осаждали. Каплю суспензии объемом 2 мкл наносили на покровное стекло и замораживали в жидком азоте с последующей лиофилизацией в высоком вакууме при температуре 100 С. После низкотемпературной дегидратации образец напыляли слоем золота толщиной 200 А. Для лиофилизации и вакуумного напыления использовали высоковакуумную установку Balzers МКЗ. Фиксированные, высушенные, напыленные золотом образцы клеток исследовали в сканирующем электронном микроскопе JSM-U3 («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.
Электронно-микроскопическое исследование мембран многослойных везикул из ДПФХ осуществляли методом замораживания-скалывания как описано в [Borovyagin et al., 1977]. Образцы исследовали в электронном микроскопе JEM-100В («JEOL», Япония) при напряжении 80 кВ и увеличении 20000.
Электронно-микроскопическое исследование выполнено в сотрудничестве с Погореловым А.Г. (в.н.с, д.б.н. ИТЭБ РАН). Микрокалориметрическое исследование
Температурную зависимость избыточного удельного теплопоглощения (далее - термограмму) суспензии мембран эритроцитов и водной дисперсии многослойных везикул из ДПФХ регистрировали на дифференциальном адиабатном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (Специальное Конструкторское Бюро АН СССР, г.Пущино). Устройство, принцип работы и основные характеристики ДАСМ-4 описаны в работах [Privalov and Potechin, 1986; Privalov and Plotnikov, 1989]. Измерительная и сравнительная ячейки выполнены из платины и имеют объем 0,47 мл. Все измерения проведены в 310 мОсм натрий-фосфатном буфере, рН 7,4 (310Р7) при скорости прогрева 1 К/мин. Уровень шума не превышал 30 мкДж/К, воспроизводимость базовой линии не хуже 160 мкДж/К.
Температурную зависимость избыточного молярного теплопоглощения (термограммы) каждого образца водной суспензии многослойных везикул из ДПФХ в смеси с гликозидами регистрировали в режиме цикла не менее трех раз-Анализ термограмм проводили с помощью программного пакета MicroCal Origin 5 («Microcal Software», США). Относительную удельную энтальпию денатурации мембран (ДЯсаі) определяли после вычитания базовой линии путем сравнения нормированной на концентрацию мембран площади под термограммой образца (от 35 до 85 С) с площадью электрической калибровочной метки прибора. Для получения базовой линии обе ячейки (измерительную и сравнительную) заполняли раствором, в котором в дальнейшем проводили измерение мембран, и проводили запись.
Похожие диссертации на Структурные изменения эритроцитарных и липидных мембран при действии тритерпеновых гликозидов женьшеня C.A. Meyer
