Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Физиологическое действие сверхмалых доз 12
1.2. Влияние сверхмалых доз БАВ на растения 18
1.3. Влияние БАВ в СМД на изолированные органы, ткани, клеточные системы и отдельные макромолекулы 19
1.4. Биологические мембраны как мишень действия ультранизких доз 22
1.5. Общие закономерности и механизмы действия биологически активных веществ в СМД 29
1.6. Роль воды в объяснении действия СМД БАВ 33
1.7. Тиреотропин рилизинг гормон 38
ГЛАВА II. Основные материалы и методы 49
2.1. Выделение мембран 49
2.2. Определение концентрации белка в мембранах 50
2.3. Приготовление растворов ТРГ 50
2.4. Изучение изменений микровязкости и параметра упорядоченности мембран при помощи метода спиновых зондов. Определение термоиндуцированный структурных переходов и их эффективной энергии активации 51
2.5. Инфракрасная спектроскопия в средней области водных растворов ТРГ. 59
2.6. Инфракрасная спектроскопия в ближней области водных растворов ТРГ 63
ГЛАВА III. Результаты исследований и их обсуждение 66
3.1. Модификация структуры мембран эндоплазматического ретикулума печени под действием тиролиберина 663.
1.1. Влияние ТРГ в широком спектре концентрациях (10 -10 М) на микровязкость и структурную упорядоченность липидной компоненты мембран эндоплазматического ретикулума 67
3.1.2. Температурные зависимости и термоиндуцированные структурные переходы 73
3.2. Модификация структуры плазматических мембран печени под действием тиролиберина 88
3.2.1. Влияние ТРГ в широком спектре концентрациях (10"4 -10"18 М) на параметр упорядоченности и микровязкость липидной компоненты плазматических мембран печени 88
3.2.2. Температурные зависимости и термоиндуцированные структурные переходы 91
3.3. Модификация структуры мембран головного мозга под действием тиролиберина 101
3.3.1. Влияние ТРГ в широком диапазоне концентраций (10"4 -10"18 М) на
структурные параметры липидной компоненты эндоплазматического
ретикулума, плазматических мембран мозга и синаптосом 101
3.4. Сравнительное изучение структурного состояния мембран головного мозга и печени мышей под действием тиролиберина in vitro 113
3.5. Исследование влияния трг на динамические и статические показатели состояния водных систем методом ик спектроскопии 120
3.5.1. Влияния трг на динамические показатели тонких слоев водных растворов в средней ик области 120
3.5.2. Влияния трг на показатель поглощения водных растворов в ближней ик области 132
Глава IV. Заключение 139
Выводы 152
Список литературы
- Влияние сверхмалых доз БАВ на растения
- Общие закономерности и механизмы действия биологически активных веществ в СМД
- Изучение изменений микровязкости и параметра упорядоченности мембран при помощи метода спиновых зондов. Определение термоиндуцированный структурных переходов и их эффективной энергии активации
- Модификация структуры плазматических мембран печени под действием тиролиберина
Введение к работе
Актуальность исследования.
Последние два десятилетия 20 века отмечены открытием «эффекта сверхмалых доз» биологически активных веществ (БАВ) - гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов и других агентов [1,7,29,53,89, 112,343]. При сверхмалых концентрациях БАВ (менее 10'13 М) их активность часто возрастает с понижением концентрации, а общая кривая зависимости доза-эффект имеет нелинейную, полиэкстремальную форму. Несмотря на лавинообразное увеличение количества разнообразных фактов о действии БАВ в сверхмалых дозах (СМД), механизм этого явления не установлен. Анализ имеющихся данных позволяет выделить ряд общих особенностей, наблюдающихся при действии СМД БАВ, которые оказались независимыми как от природы действующего агента, так и от объекта исследования [216, 226]:
немонотонная, нелинейная зависимость «доза — эффект». В большинстве случаев максимумы активности наблюдаются в определенных интервалах доз, разделенных между собой так называемой «мертвой зоной»;
изменение чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообразных агентов в СМД, как эндогенных, так и экзогенных (последние могут быть как той же, что в случае воздействия СМД, так и иной природы);
проявление кинетических парадоксов, а именно возможность уловить эффект в СМД биологически активных веществ, когда в клетке или организме имеется то же вещество в дозах на несколько порядков выше. Влияние на рецептор вещества в дозах на порядки более низких, чем константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор;
Зависимость «знака» эффекта от начальных характеристик объекта;
«расслоение» свойств биологически активного вещества по мере уменьшения его концентраций, при котором еще сохраняется активность,
но исчезают побочные эффекты; Для физических , факторов усиление эффекта с понижением его
интенсивности в определенных пределах мощности и доз. Ни одна из сформулированных моделей не объясняет всего многообразия эффектов БАВ в СМД. По мнению ряда авторов [98,229,226,215,210] в качестве общих мишеней действия БАВ в СМД могут выступать клеточные и субклеточные мембраны, с которыми взаимодействует БАВ при попадании в клетку и организм. Это взаимодействие определяет многие жизненно важные процессы на уровне всей клетки и, в конечном счете, определяет реакцию всего организма в целом. В биомембранах локализованы важнейшие системы, регулирующие клеточный метаболизм: системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и вторичных посредников, обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку [344,345,174,346,171,172]. Процесс ПОЛ, который является физиологическим способом модификации липидного бислоя биологических мембран, участвует в разборке мембранных структур и обновлении мембранных фосфолипидов, это универсальный механизм повреждения мембранных структур клетки при различных патологических состояниях [173,174]. Система регуляции ПОЛ зависит от состава липидов, их свойств, вязкости и других структурно-динамических состояний [303-305], окисляемости и антиокислительной активности, содержания природных антиоксидантов, концентрации перекисных радикалов и гидроперекисей [176-179]. Действие БАВ, которое изменяет непосредственно или опосредованно одну из характеристик липидов, приводит к модификации всех параметров системы ПОЛ. Так как режим функционирования мембранных белков, как правило, зависит от каждого из этих параметров, то такие воздействия влекут за собой переход клетки из одного метаболического состояния в другое. Так как между системами вторичных посредников и ПОЛ в связи с их общей локализацией в биомембранах существует тесная связь и взаимное влияние, то ряд веществ,
осуществляющих свое физиологическое воздействие через лиганд-рецепторный путь, могут модифицировать и параметры системы регуляции ПОЛ. К таким агентам относится, например Тиреотропин-рилизинг гормон (ТРГ), эндогенный регуляторный пептид, который выполняет функции нейрогормона [265], принимает участие в регуляции ряда нервных и психических функций (уровень бодрствования, сон, эмоции, обучение, память) [238], обладает способностью ослаблять неврологическую симптоматику при черепно-мозговых травмах и сотрясениях мозга [266]. Известно, что в физиологических концентрациях (10^-10-6^ ТРГ может взаимодействовать с системой ПОЛ через изменение такого ее параметра, как структура липидного бислоя мембраны [229], и, соответственно, вызывать ответ всей клетки. Вместе с тем ТРГ является одним из первых веществ, для которого была установлена возможность проявления эффекта в СМД: ТРГ усиливает сократительную активность лимфатических сосудов [89]; модулирует противосудорожную защиту мозга при эпилептических припадках у животных и человека, эффективно применяется в клинике для лечения эпилепсии [265-285].
В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия ТРГ с различными областями липидного бислоя биологических мембран, отличающихся по своим биохимическим, физико-химическим и регуляторным свойствам, может нас приблизить к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях.
Цель настоящей работы состояла в изучении влияния тиролиберина в широком диапазоне концентраций, в том числе и СМД, на структурные характеристики различных областей липидного бислоя биологических мембран клеток печени и головного мозга в экспериментах in vitro; а также структуру воды, основной среды функционирования и передачи информации в биосистемах, ее статических и динамических характеристик.
Выбор ТРГ обусловлен его хорошей изученностью как нейромедиатора, как лиганда при рецепторном взаимодействии, как агента, действующего в сверхмалых дозах и, главное, применяющегося в этих дозах в клинике.
Объектами изучения явились 5 функционально различных типов биомембран, выделенных из тканей мышей: мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭР) печени и мозга, которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и про-оксидантов; плазматические мембраны (ПМ) печени и мозга, в которых локализованы системы вторичных посредников; синаптосомы; и растворы ТРГ в бидистиллированной воде (в экспериментах по ИК спектроскопии). В задачи работы входило:
исследовать влияние ТРГ в широком спектре концентраций (10"4 - 10"18М) на микровязкость и упорядоченность липидов ЭР и ПМ методом спиновых зондов ЭПР при использовании трех иминоксильных стабильных радикалов, нитроксильные фрагменты которых локализуются в приповерхностных (глубина погружения 4 А0) - 2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоил-1-оксил (зонд С7), средних (8А) - 5-доксилстеариновая кислота (зонд С5) и глубоко лежащих гидрофобных слоях липидов (глубина 22 А0) - 16-доксилстеариновая кислота (зонд С16) при температуре 293 К; получить зависимости доза-эффект.
определить влияние ТРГ в максимально действующих концентрациях на дозовой зависимости на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя изучаемых мембран и эффективную энергию их активации.
конкретизировать механизмы действия различных концентраций ТРГ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ.
исследовать степень влияния ТРГ в широком интервале концентраций (10" 22 -10'3 М) на динамическую и статическую структуру водных растворов:
а) - на основе многомерного критерия Махаланобиса изучить различия флуктуации показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-
спектра: 3500-3200см"\ 3085-2832см"1, 2120-1880см"', 1710-ІбЮсм'1, 1600-1535см"1, 1543-1425СМ"1, 1430,1210см-1, 1127-1057СМ'1, 1067-963СМ-1 в водных растворах ТРГ по сравнению с соответствующими эталонами бидистиллированной деионизованной воды;
б) - с использованием метода главных компонент (PCR анализ) изучить различия в показателях поглощения водных растворов ТРГ в широком диапазоне концентраций (10"2 - 10'20 М) в ближней области ИК спектра (5200-14000 см-1) по сравнению с соответствующими водными эталонами.
Научная новизна.
Впервые показано, что ТРГ в широком диапазоне концентраций (Ю-4-10" 19М) существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных областей биологических мембран, выделенных из печени и головного мозга мышей. При этом обнаружена полимодальность эффектов ТРГ в зависимости от вводимой дозы с классическим для СМД видом концентрационной кривой - экстремумами в областях больших и сверхмалых доз, разделенные «мертвыми зонами» с отсутствием эффекта.
Впервые показано, что ТРГ, в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липиднои компоненты, влияет на количественную и качественную картину термоиндуцированных структурных переходов в липидном слое исследуемых мембран.
Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим механизмом взаимодействия ТРГ с биомембранами: в области концентраций (10' -10" М) - неспецифическим встраиванием в мембрану; в области СМД (10"9-10"пМ) - образованием лиганд-рецепторного комплекса, причем впервые получены экспериментальные данные, косвенно свидетельствующие о наличии рецептора ТРГ на ПМ печени; в интервале концентраций ТРГ (<10'15М) влияние на мембрану осуществляется опосредованно через изменение структурно-динамических свойств воды.
Впервые экспериментально продемонстрировано влияние ТРГ в сверхмалых концентрациях на флуктуации коэффициентов поглощения воды в ближней (5200-14000 см"1) и средней (800-3 500см'1) областях ИК-спектра.
Впервые предложено объяснение механизмов наблюдаемых эффектов действия ТРГ в сверхмалых дозах на основе неравновесных систем.
Научно-прикладное значение работы.
Данная работа является составной частью комплекса научных исследований проблемы действия БАВ в сверхмалых дозах. Полученные в работе выводы и используемые методологические подходы могут быть применены в решении данной задачи. В частности, изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях.
Полученные результаты обосновывают применение подхода минимизации дозы ТРГ вплоть до СМД при использовании в клинике для лечения заболеваний нервной системы.
Апробация диссертационной работы.
Материалы работы докладывались на: ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2001, 2002,2004), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders" (Dijon, France, 2005), конференции "European college of neuropsychopharmacology" (Москва, 2005), конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты», (Москва, 2005), конкурсе научных работ ИБХФ (Москва, 2007).
Публикации.
Основные положения диссертационной работы опубликованы в 21 печатных работах (8 журнальных статьях и 13 тезисах докладов).
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 175 страницах, иллюстрирована 43 рисунком и 6 таблицами. Библиография включает список из 353 работ.
Влияние сверхмалых доз БАВ на растения
Многими исследователями зафиксированы аналогичные эффекты действия сверхмалых доз БАВ на растения. Например, была изучена ростостимулирующая активность антиоксидантов амбиола и феноксана в СМД - от 10 6 до 10"18 М на зерновых, бобовых и зеленых культурах. Полученные результаты показали, что любая из изученных концентраций может вызвать статистически достоверный эффект стимуляции роста растений, однако с разной степенью воспроизводимости [86].
Показана принципиальная возможность использования ультранизких доз аскорбиновой кислоты для ускорения роста растительной массы. Например, Кукленко Е.А., с сотрудниками установили, что наиболее эффективной для процесса регенерации томата in vitro наряду с дозой 10 4 М аскорбиновой кислоты является доза 10"12 М [87].
Исследовано влияние органических пероксидов на рост клеток табака. При уменьшении концентрации пероксидов достоверный эффект наблюдается вплоть до сверхнизких концентраций 10",5-10"17М. Зависимость величины эффекта от дозы неоднократно меняет знак (ингибирование роста -стимуляция роста) [96].
Бимодальная зависимость с максимумом в области СМД зарегистрирована и при исследовании физиологического действия производных пиколиновой кислоты в концентрациях 10"4 - 10"14 М на скорость прорастания семян пшеницы и гороха [88].
В работе Богатыренко и др. [96] приведены данные для гербицидов из класса органических пероксидов, а также для лонтрела. Исследования показали, что возможны новые режимы применения пестицидов в значительно меньших дозах, что наличие их в низких дозах в воде и почве (ниже ПДК) не гарантирует их безопасности для человека и других объектов окружающей среды.
Таким образом, разработка новых подходов и применение БАВ в сверхмалых дозах как ингибиторов роста или ядов является одним из возможных развитии агропромышленных комплексов. Это позволит сократить случаи «множественной химической чувствительности» у людей, повысить эффективнойсть использования пестицидов. Такие подходы должны эффективно работать как в экологическом, так и в экономическом аспектах.
Следует подчеркнуть, что организм в целом отличается сложной организацией, его реакция на БАВ является комплексной и определяется процессами, запускаемыми на более низких уровнях. Поэтому представляется важным рассмотрение имеющихся в литературе данных о действии СМД БАВ на более низких ступенях иерархической лестницы по степени организации живых систем. Переходя на следующий ее уровень, обобщим материалы о влиянии БАВ в СМД на изолированные органы, ткани и клеточные системы. Наиболее удачной моделью для изучения эффектов СМД пептидов является система мезентериальных лимфатических сосудов in vivo, когда расворы пептидов наносятся непосредственно на брыжейку [89,276]. Характерным эффектом является стимулирующее влияние на амплитуду и частоту сокращений в минимально действующих концентрациях порядка 10 -10" моль/литр, в то время как известные константы диссоциации комплексов нейропептидов с их рецепторами равны 10 -10" М [89,276]:
Найдена сложная зависимость эффекта от дозы при изучении влияния феромона на поведение бактерий. Сообщается, что "феромон может быть разбавлен до 6 х 10" М (36 молекул в мкл.) при полном сохранении биологического эффекта [93].
Была определена степень процесса агрегации тромбоцитов в крови in vitro под действием разных доз ацетилсалициловой кислоты (аспирина) [94]. Показано, что концентрация 10 2 М полностью подавляет агрегацию, дозы от 10"4 до 10"10 M не оказывают на этот процесс статистически достоверного влияния и, наконец, 10" ,10" и 10 М препарата статистически значимо увеличивают степень агрегации тромбоцитов.
Исследование бласт - трансформации спленоцитов мышей под воздействием мет-энкефалина выявило полимодальную зависимость масштаба данного процесса от его концентрации с пиками при 10"13 и 10"10 М [95].
Аномальная дозовая зависимость эффекта в области СМД БАВ зафиксирована на уровне ответа не только целого организма или клетки, но и на уровне биомакромолекул. Так, обнаружена бимодальная зависимость эффекта от дозы при изучении ингибирующего действия природного антиоксиданта токоферола на фермент протеинкиназу-С, предварительно активированную форболовым эфиром. Токоферол ингибирует протеинкиназу при концентрациях 10 16 -10 12 М и 10"4 -10"5 М. В промежуточном интервале концентраций активность его существенно ниже [209]. Сверхмалые дозы токоферола увеличивают чувствительность фермента к субстрату. Была выявлена также однонаправленность эффекта влияния токоферола в сверхмалой и обычной дозах.
Как активатор протеинкиназы-С действует и синтетический антиоксидант фенозан калия. Зависимость изменения активности фермента от концентрации фенозана, носит ярко выраженный бимодальный характер, два острых максимума соответствуют концентрациям 10" и 10 М[101, 209].
Общие закономерности и механизмы действия биологически активных веществ в СМД
В последнее время сразу несколькими авторами была высказана гипотеза о возможной роли структурных изменений в растворителях, в частности в воде для объяснения эффекта СМД [112 -155].
Исследования структуры воды [133-144, 170] начались еще в середине 19-го века, и на сегодняшний день существует несколько ее моделей: континуальные (непрерывный каркас из молекул, соединенных Н-связями), клатратные (непрерывный каркас молекул воды, соединенных Н-связями, содержащий пустоты с дополнительными молекулами воды), кластерная (предполагает существование в воде двух микрофаз, в которых молекулы воды связаны водородными связями). [133-144].
Континуальная или модель непрерывной сетки водородных связей [131], существующих в воде, заключается в том, что существуют непрерывные, изогнутые и разупорядоченные цепи водородных связей, проходящие через всю жидкость. Модель хорошо согласуется с экспериментальными данными. Так авторы из американской национальной лаборатории Беркли [157-165], в том числе с помощью Раман-спектроскопии, показали, что при переходе изо льда в жидкость вода не разрывает водородные связи между соседними молекулами, они становятся изменчивыми и подвижными. Скорость их образования-распада- 10"12 секунд. В 1959 году Полингом была предложена так называемая клатратная модель структуры воды. Клатраты или ассоциаты - это объединения молекул воды в объёмные многогранники, внутренняя полость которых сравнима по величине как с молекулами воды, так и с молекулами некоторых газообразных веществ, например, метана. Кроме этих, объединившихся в многограннике молекул воды в ней находятся и одиночные молекулы, которые могут либо входить во внутреннюю полость клатратов или находиться в пространстве между ними. Есть предположение [132], что от того, какое количество одиночных молекул будет находиться в том или ином состоянии, зависят свойства воды - ее вязкость, удельный вес и способность растворять другие вещества, а также взаимодействовать с молекулами, входящими в состав живых организмов.
Наиболее разработанной считается модель мерцающих (короткоживущих) кластеров [136], предложенная G. Nemethy и Н. Scheraga. Она построена на основании данных протонного магнитного резонанса воды, согласно которой водородная связь иногда становится частично ковалентной. Благодаря этому возникает относительно устойчивое соединение молекул воды, которые с помощью водородных связей образуют кластеры, окруженные водными мономерами. Образование водородной связи способствует образованию других водородных связей около молекулы, и, наоборот, их разрыв благоприятствует разрыву соседних водородных связей. Таким образом, их образование и разрыв является кооперативным процессом, что привело к предположению о существовании «мерцающих кластеров» молекул воды.
Помимо нейтральных кластеров, в ряде работ показано существование заряженных молекулярных структур в воде. Доказано, что формированию ионных водных кластеров способствует процесс диссоциации воды и наличие в ней примесей [142-150].
В тонких водных слоях, соприкасающиеся с твёрдой поверхностью, в данном случае с кварцем [156], с помощью методики «phase-sensitive sum frequency vibrational spectroscopy» была определена пространственная ориентация отдельных молекул воды. Показано, что в пограничном слое некоторая часть молекул бразует подобные льду жёсткие структуры, причем их ориентация зависит от кислотности среды.
Другими авторами, также, в тонких слоях воды обнаружены кластеры, размеры которых достигают 1 мм. Показана структурная модификация белковых макромолекул, по-видимому, связанная с изменением свойств водной фазы вблизи их поляризованных сайтов [146-149].
Влияние поверхности твердого вещества на воду заключается в упорядочивании структуры жидкости. Толщина поверхностного упорядоченного слоя воды, по разным данным, составляет 10-100 нм [166]. Показано, что свойства воды на границе с поверхностью изменяются. Например, граничная зона воды обладает такими особенностями, как повышенная сдвиговая упругость, повышенная теплопроводность, аномальная температурная зависимость коэффициента теплового расширения [167-169].
На сегодняшний день нет единой точки зрения по структуре воды, но наиболее реальное представление - это смешанная модель, которая описывает структуру воды как смесь различных типов структур. Молекулы воды соединены между собой неупорядоченной сетью водородных связей, которые могут быть деформированы, разорваны или подвергаются спонтанной перестройке. В стандартных условиях, согласно статическим расчетам [145] около 30% всех молекул воды находятся в виде отдельных молекул, 40% входят в состав кластеров, а 30% приходятся на случайные ассоциаты не имеющие определенной структуры. Таким образом, нестабильность, которую обычно фиксируют физическими методами исследования воды, объясняется постоянным колебанием различных параметров, обусловленных трансформацией различных типов структур.
Изучение изменений микровязкости и параметра упорядоченности мембран при помощи метода спиновых зондов. Определение термоиндуцированный структурных переходов и их эффективной энергии активации
Мембраны ЭР получали по методу [221], ПМ по методу [222], выделяя из печени и мозга мышей линии Fl (С57 х DBA2). В основе этих методов выделения лежат принципы центрифугирования, основанные на разном поведении частиц в центробежном поле, на различии в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью.
Животных забивали методом декапитации. Ткани помещали в охлажденную среду выделения SET (0,25 М сахароза + 1мМ ЭДТА + ЮмМ трис - НС1, рН=7,4) и измельчали в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (зазор между ним и стенкой гомогенизатора 0,2-0,3 мм). Полученный гомогенат фильтровали через двойной слой марли и центрифугировали при 2000 об/мин 10 минут на центрифуге К-24.
Супернатант использовали для выделения микросомальных мембран, центрифугируя его 15 минут при 12000 об/мин для удаления тяжелых фракций клеточных органелл. Супернатант разбавляли раствором трис-ЭДТА (трис - 0,1 М, ЭДТА - 0,001 М) и центрифугировали в течение 90 минут при 30800 об/мин на центрифуге BECKMAN. Осадок ресуспендировали в растворе трис - ЭДТА и полученную суспензию микросом разливали в эпиндорфы, хранили при температуре -40С.
Осадок, полученный на этапе центрифугирования при 2000 об/мин при 10 минут на центрифуге К-24, использовали для выделения ПМ, ресуспендируя его в SET. Для более эффективного разделения органелл далее центрифугировали в растворах со ступенчатым градиентом плотности, для этого к полученному гомогенату добавляли Percol (ICN Biomedicals), 2М сахарозу и центрифугировали при 35000g 20 минут. Плазматические мембраны и ДНК при этом образовывались плотным кольцом в верхней части пробирки, которые отбирались пипеткой.
Для осаждения ДНК к полученному раствору добавляли Percol, 2М сахарозу и СаС12 и центрифугировали при 45000g 30 минут. Добавление ионов кальция позволило отделить ПМ от ядерной фракции. ПМ собирали пипеткой и затем промывали в среде выделения SET на 15 000g 15 минут. Полученную суспензию ПМ разливали в эпиндорфы, хранили при температуре -40С.
Определение концентрации белка в мембранах. Содержание белка в полученном препарате оценивалось по методу Лоури [58]: растворы А (2% Na2C03 в 0.4% NaOH), В (1% CuS04 в воде), С (2% Na-K-тартрат) смешивали в день определения в следующей пропорции: 10А+0.1В+0.1С. Реактив Фолина добавляли до нормальности 1.0 дистиллированной водой.
К образцу белка приливали 1мл смеси ABC, перемешивали, после 10 мин инкубации добавляли 0.1 мл разбавленного реактива Фолина и через 30 мин измеряли коэффициент экстинкции на 750 нм против контрольной слепой пробы на спектрофотометре "Specol". По калибровочной кривой с бычьим сывороточным альбумином (Serva) определяли концентрацию белка в пробе.
В работе был использован ТРГ фирмы Sigma; растворы ТРГ были получены методом последовательного разведения через один порядок его исходного 10" М раствора дистиллированной водой. Приготовление растворов ТРГ осуществляли по следующей схеме: полуавтоматической пипеткой из объема исходного раствора бралось 500 мкл ТРГ и разбавлялось 4500 мкл дистиллированной воды. Полученный раствор перемешивали в шейкере в течение 1 минуты. Дальнейшие разведения делали по той же схеме, таким образом, при каждом разведении исходная концентрация раствора понижалась на один порядок. Существенным условием было использование одноразовых эпиндорфов и сменных наконечников пипетки для каждого этапа разведения.
2.4. Изучение изменений микровязкости и параметра упорядоченности мембран при помощи метода спиновых зондов. Определение термоиндуцированный структурных переходов и их эффективной энергии активации.
Изменения в структуре липидного компонента мембран определяли методом спиновых зондов. Зондами служили стабильные свободные радикалы: 2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоилоксипиперидин-1-оксил (зонд С7), синтезированный в ИХФ РАН, и 5- и 16-доксилстеариновые кислоты (зонды С5 и С16) компании "Sigma" (США), локализующиеся в поверхностных (2-4 А) [198, 225], средних (8А) [198,223] и глубоко лежащих (20-22 А) [198, 223] областях мембраны соответственно.
Спектры регистрировали на ЭПР-спектрометре "BRUKER 200D" (модифицированном компьютерным интерфейсом) и Bruker ЕМХ при следующих параметрах: время сканирования, сек количество накоплений 3
Оптимальная концентрация зонда для введения в суспензию мембран определялась на основе работы, проделанной А. Конюховым, где была изучена зависимость времени вращательной корреляции, тс, вычисляемой из спектра по формуле (1), от концентрации зонда (І) в среде выделения мембран [219]. При концентрации зонда превышающей 5 х 10"4 М тс перестает быть корректной характеристикой вязкости самой среды из-за нарастающей роли концентрационных эффектов [198]. Согласно этим данным было признано целесообразным выбрать окончательную концентрацию зонда в суспензии мембран не более 5 10"5 М.
Характер количественного равновесного распределения зонда между окружающим мембраны буфером и собственно мембранами существенно зависит от концентрации мембран в суспензии. В связи с этим для каждого типа мембран и зонда исследовали кинетику релаксации системы "суспензия мембран + зонд" после введения зонда в суспензию с разной концентрацией белка при концентрации зонда 5 х 10"5 М. Выбирались те значения хс или S, начиная с которых равновесные значения этих параметров выходили на плато. Это свидетельствует о том, что, начиная с этой концентрации, вклад в величину тс или S от зонда, находящегося в среде выделения становится несущественным. Оценивая по данной схеме для каждого типа мембран, была выбрана оптимальная концентрация белка в суспензии мембран 3 - 3,5 мг/мл.
Контрольные эксперименты по определению кинетики встраивания зондов в мембрану показали, что через 20-25 мин. после введения зондов значения тс и S достигают постоянного уровня, таким образом, время инкубации проб было выбрано 30 мин.
Модификация структуры плазматических мембран печени под действием тиролиберина
Совокупность представленных результатов, позволяет с определенностью говорить о том, что ТРГ существенно изменяет "портрет" термоиндуцированных структурных переходов в мембранах ЭР: во всех изученных концентрациях (Ю-4, 10"10, 10"16 М) ТРГ вызывает сдвиг этих переходов и/или изменение их количества. Следует отметить, что высокая доза ТРГ (10"4 М) не влияет на число структурных переходов во всех изученных областях мембраны. ТРГ в физиологической концентрации (10"10 М) снижает число структурных переходов в области локализации зонда С7, не изменяет его в области локализации зонда С5 и в глубоколежащих областях липидов индуцирует появление нового перехода при физиологических температурах. ТРГ в СМД 10"16 М уменьшает количество структурных переходов в области локализации зонда С7 и не изменяет их в более глубоких областях. Таким образом, можно отметить следующую тенденцию: число структурных переходов в области локализации зонда С7 уменьшается по мере снижения концентрации ТРГ; в области локализации зонда С5 ТРГ вызывает только качественные изменения (некоторые из переходов сдвигаются по температурной шкале) сохраняя их количество, а в глубоколежащих областях высокая активность обнаружена для дозы ТРГ 10" 10М, когда появлялся новый переход, сопровождающийся достаточно сильными изменеениями в эффективной энергии активации.
Представляет интерес сравнить величины эффективной энергии активации для выделенных переходами различных фазовых состояний приповерхностных (зонд С7) и глубоко лежащих (зонд С16) слоев липидов в контроле и после воздействия ТРГ в концентрации 10 4, 10 10, 10"16 М. На рис.3.1.9 приведены результаты для физиологических областей температур (условно мы принимали за них интервал 35-41С). Видно, что практически все изученные нами дозы ТРГ вызывали снижение эффективной энергии активации термоиндуцированных структурных переходов как в области локализации С7, так и С16. Причем наибольшее влияние на эту величину оказывали: в области локализации С7 - концентрации ТРГ lO Vl, а в области локализации С16 - низкая 10"10 М, когда (ДЕакт)Эфф уменьшалась до отрицательных значений, и СМД 10"16М ТРГ. Снижение эффективной энергии активации свидетельствует об облегчении структурных перестроек в биомембране после введения ТРГ. 40
Изменение эффективной энергии активации термоиндуцированных структурных переходов для приповерхностных (незаштрихованная область диаграммы) и глубоко лежащих (заштрихованная область) слоев липидов в контроле и после действия ТРГ в концентрации 10"4 М, 10" М и 10"16М, t=308-314K.
Таким образом, на основании совокупности полученных данных о структурных характеристиках мембран ЭР мы можем заключить, что в экспериментах in vitro ТРГ вызывает концентрационно-зависимые изменения всех изученных структурных параметров, причем в области СМД наблюдаются даже более значимые эффекты, чем при стандартных концентрациях. Кроме того, мы можем с большой долей уверенности говорить о наличии в действии ТРГ на мембрану 3-х разных механизмов, зависящих от концентрации пептида - неспецифическое взаимодействие в больших дозах, рецепторное и СМД. Тиролиберин является гидрофильным препаратом, соответственно, без специальных транспортных белков, о которых нет данных в литературе, он не может проникать через плазматическую мембрану. Но в то же время, в работах Hinkle [327] с соавторами показана колокализация рецептора ТРГ с ЭР на культурах клеток НЕК293. Таким образом, на основании опубликованных данных, вполне можно предположить его наличие в мембранах ЭР печени мышей и объяснить уменьшение структурированности во всех исследованных областях липидов при введении ТРГ в концентрации 10 9-10"10 М конформационными изменениями рецептора ТРГ и последующим взаимодействием образующегося лиганд-рецепторного комплекса с липидами. Поэтому имеет смысл сравнить взаимодействие ТРГ другими типами мембран, особенно с плазматическими мембранами мозга, в которых показано наличие рецепторов ТРГ.
Относительно 3-го типа механизма, сверхмалых доз, существует несколько гипотез о возможных механизмах действия биологически активных веществ в СМД, которые изложены в «Обзоре литературы»: концепция параметрического резонанса Блюменфельда, представления об аллостерическом взаимодействии каталитических центров в молекуле фермента, о супераффинных рецепторах, о роли воды и ее структуры. Но в настоящее время нет достаточно строгих экспериментальные подтверждений этих предположений, поэтому для выяснения этого вопроса мы провели дополнительные исследования взаимодействия ТРГ с водными растворами (III глава, раздел 3.5).
