Содержание к диссертации
Принятые сокращения: 3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 4
Актуальность проблемы; : 4
Цели и задачи исследования 5
Научная новизна 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
ВВЕДЕНИЕ
Многообразие структурных форм, образуемых липидами
1.1; Фазовые переходы бислойных структур
12. Полиморфные фазовые переходы: бислой - небислойные структуры
1.3. Свойства липидов, определяющие формирование бислойных или небислойных структур 10
л:г. \ юлиморфные фазовые переходы: бислой - небислойные структуры 12
1.3. Свойства липидов, определяющие формирование бислойных или небислойных структур 16
1.4. Механизм трансформации бислоя в небислойные структуры 19
2- Влияние различных веществ на полиморфизм липидов 20
2.1. Биоактивные липиды 20
2.2. Модуляция полиморфизма липидов полипептидами и белками 22
2.2.1. Взаимодействие полипептидов с бислоем 22
2.2.2. Полиморфные фазовые переходы липидов в присутствии полипептидов и белков24
3. Полиморфизм липидов in vivo 26
3.1. Небислойные структуры липидов в цитоплазме 26
3.2. Участие липидов в транслокации молекул через мембраны 28
3.3. Роль полиморфизма липидов в процессах слияния мембран 32
3.3.1. Интермедиа™ слияния ; 33
3.3.2. Участие небислойных структур в процессах слияния мембран 34
4. Полиморфизм липидов в генной терапии 38
4.1. Задачи и методы генной терапии 39
4.2. Методы доставки генетического материала 40
4.3.1. Вирусы в качестве средств доставки генетического материала 41
4.5.1. Искусственные транспортные средства : 43
4.63. Катионные липиды 45
4.7. Структура ДНК-липидных комплексов 47
4.8. Механизмы липофекции 50
4.8.1. Доставка ДНК-липидного комплекса к поверхности клеток. 50
4.8.2.Взаимодействие комплекса с клеточной поверхностью и проникновение в эндосомы,51
4.8.3. Освобождение ДНК в цитоплазму 52
4.8.4. Транспорт ДНК в ядро 55
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 57
Материалы .57
Методы исследования 57
1. Приготовление липосом 57
2. Протеолипидные комплексы 57
3. Приготовление препаратов ДНК 58
4. ДНК-липидные комплексы 58
5. Определение трансфекционной активности ДНК-липидных комплексов 59
6. Бактерии 59
7. Инфицирование клеток бактериофагами • 59
8. Определение выхода калия из цитоплазмы клеток Escherichia со// 60
9. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия 60
10. Э1Р-ЯМР спектроскопия 60
11. Рентгеновская дифракция 61
12. Электронная микросколия 61
а. Метод замораживания-скалывания 61
б. Метод ультратонких срезов 62
в. Метод негативного окрашивания 63
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 64
1. Исследование модельных систем 64
1.1. Электростатические силы в регуляции полиморфного поведения липидов 64
1.1.1. Формирование инвертированной гексагональной Нп фазы в эквимолярных смесях катионных и анионных липидов 65
1.1.2. Кубические фазы образуются в образцах, содержащих двойной избыток анионного или катионного липидов 68
1.1.3. Большой дисбаланс зарядов приводит к исчезновению кубической фазы и появлению губчатой структуры 70
1.1.4. Чистые катионные и анионные липиды образуют ламеллярную фазу 70
1.1.5. Общие закономерности в поведении смесей анионных и катионных липидов 72
1.2. Полиморфизм галактолипидов, инициируемый хлорофиллом 73
1.3. Фазовые переходы в белок-липидных комплексах 81
1.3.1. Роль перекисного окисления в белок-липидных взаимодействиях 81
1.3.2.Латеральная сегрегация белка в мембране при формировании двумерных кристаллов91
1.4. Фазовые переходы в ДНК-липидных комплексах 98
1.4.1. Комплекс AHK-Ca2+-DPPC 98
1.4.2. Комплекс ДНК- Са2+ -лецитин 103
1.5. Стабилизация ДНК в комплексах с катионными липидами 105
1.5.1. Ультрафиолетовая спектроскопия ДНК-липидных комплексов после теплового воздействия 105
1.5.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия ДНК-липидных комплексов после тепловой обработки 107
1.5.3. Анализ нативных ДНК-липидных комплексов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии 108
1.5.4. Разделение и анализ термостабильного и термолабильного комплексов 112
1.5.5. Структурные основы термостабильности ДНК 113
2. Полиморфизм липидов в клетке ^ 119
2.1. Фазовые переходы в мембранах грамотрицательных бактерий 119
2.1.1. Динамика структурных преобразований мембран Escherichia coli в средах с высоким
осмотическим давлением 121
2.1.1. Полиморфное поведение мембран грамотрицательных бактерий в присутствии двухвалентных
катионов 125
2.2. Транслокация ДНК через мембраны при инфицировании клеток Escherichia со//фагом Т4 133
2.2.1. Электронно-микроскопический анализ взаимодействия фага с клеткой 134
2.2.2. Температурная зависимость процессов инфицирования 136
2.2.3. Инфицирование деэнергизованньгх клеток 141
2.2.4. Последовательные стадии структурных изменений в системе бактериофаг-бактериальная клетка в процессе инфицирования 142
2.2.5.Слияние мембран при лизисе клеток Escherichia coli, индуцированном фагом Т4143
2.3. Взаимодействие катионных липосом с мембраной эритроцитов 147
2.3.1. Способность липосом к полиморфным превращениям 149
2.3.2. Адсорбция липосом на поверхности эритроцитов 150
2.3.3. Процессы эндоцитоза и экзоциттоза липосом 154
2.3.4. Возможное значение и механизмы наблюдаемых структурных изменений 155
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 157
ВЫВОДЫ 159
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 162
Введение к работе
Актуальность проблемы
Природные липиды способны образовывать разнообразные структуры в зависимости от рН, ионной силы, температуры и других факторов (Gruner S.M. и др., 1985) (Tilcock СР., 1986;Gruner S.M., 1985;Hyde S.T. и др., 1997;Lewis R.NA и др., 1997;Luzzati V. и др., 1993;Luzzati V., 1997;Luzzati V., 1997;Cribier S. и др., 1993). При этом липидный бислой, наиболее хорошо изученная составляющая биологических мембран, является лишь одной из известных фаз - а именно, ламеллярной фазой, наиболее полно отражающей наши представления о барьерных свойствах мембран. Однако все разнообразие функций биологических мембран связано с процессами временного и локального разрушения-восстановления бислоя в таких явлениях, как: трансмембранный перенос метаболитов, секреция белков, обмен генетической информацией между клетками, внутриклеточная доставка различных компонентов, эндоцитоз и экзоцитоз, клеточное деление, слияние клеток, бактериальная инвазия, вирусная инфекция и многие другие. Все эти процессы сопровождаются разнообразными видами межмембранного взаимодействия и слияния мембран при которых происходят изменения фазового состояния липидов. Такие кооперативные структурные перестройки в мембранах называются фазовыми переходами (Ивков В.Г., Берестовский Г.Н., 1982).
Два обширных и сильно отличающихся по физической природе типа фазовых переходов липидов привлекают особое внимание исследователей. Во-первых, это процессы плавления липидов, способные вызывать разделение твёрдых и жидких фаз, приводящее к латеральной сегрегации компонентов в плоскости мембраны. Во-вторых, это полиморфные фазовые переходы липидов, в результате которых могут образовываться такие небислоиные структуры, как кубические или гексагональные фазы. Биологическое значение обоих явлений чрезвычайно велико. В живых клетках гомеостатически поддерживается такой состав липидов, при котором, в интервале температур, характерных для жизнедеятельности данного организма, липиды находятся в расплавленном состоянии, при этом существует возможность возникновения полиморфных фазовых переходов (Albers S.V. и др., 2000;Epand R.M., 1990;Epand R.M., 1998;CuIlis P.R. и др., 1986;De Kruijff В и др., 1985;de Kruijff, 1997;Raetz C.R., 1978).
В последние годы интерес к исследованию свойств липидов особенно возрос в связи с широким использованием липосомальных препаратов в медицине и, прежде всего, в генной терапии (Гинтер Е.К., 2000;Горбунова В.Н., Баранов B.C., 1997;Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986;Hug P., Sleight R.G., 1991;Lasic D.D., Templeton N.S., 1996;Fe!gner P.L
и др., 1987;Lasic D.D., 1997;Engstrom и др., 1999;Lasic D.D., 1997;Harrison G.S. и др., 1995). Возникла практическая необходимость создания липосом, содержащих генетический материал или лекарственные вещества и способных активно и избирательно взаимодействовать с поверхностью определённых клеток-мишеней, проникать в цитоплазму и там освобождать биологически активный агент. Создание молекулярных машин, способных выполнять столь сложные и многостадийные операции, моделирующие явления живой природы, невозможно без глубокого и всестороннего изучения всего разнообразия физико-химических свойств липидов, которые, наряду с белками, полинуклеотидами и полисахаридами являются венцом биологической эволюции молекул.
Цели и задачи исследования
Целью представленной работы было изучение структурной организации различных фаз липидов, как в модельных системах, так и в живой клетке. Мы ставили следующие задачи исследования фазового поведения модельных систем:
Роль электростатических взаимодействий в регуляции полиморфного поведения липидов.
• Влияние больших амфипатических молекул, например молекулы хлорофилла, на полиморфное поведение различных липидов.
? Роль процессов перекисного окисления липидов в регуляции фазового поведения мембран. Структурные изменения в комплексах цитохром с - кардиолипин.
? Физико-химические свойства комплексов белков или ДНК с различными липидами.
Закономерности, обнаруженные в модельных системах, были рассмотрены также на примере клеточных мембран. При этом ставились задачи исследовать:
• Структуру и динамику изменений межмембранных контактов в зонах адгезии внешней и внутренней мембран грамотрицательных бактерий.
• Влияние двухвалентных катионов на полиморфизм мембран грамотрицательных бактерий и проникновение ДНК в цитоплазму.
Роль мембранных процессов в инфекции клеток Escherichia coli фагом Т4.
Научная новизна
Впервые обнаружена возможность контроля полиморфного поведения липидов основанная на регуляции электростатических взаимодействий между противоположно заряженными полярными головами молекул. Было показано, что, изменяя соотношение зарядов липида, мы можем получать определённые полиморфные кубические или гексагональные фазы.
? Впервые показано, что амфипатические молекулы, имеющие большой объем в полярной области, например молекулы хлорофилла, способны инициировать полиморфные переходы липидов благодаря изменению соотношения размеров полярной и гидрофобной поверхностей мембраны.
? Проведен анализ влияния перекисного окисления липидов на фазовое состояние и структурную организацию мембран, образованных кардиолипином и цитохромом с. Показано, что наблюдаемые структурные изменения мембран связаны с образованием олигомеров белка и продуктов перекисного окисления липидов.
? Впервые обнаружено стабилизирующее воздействие катионных липидов, используемых в генной терапии, на молекулу ДНК. Благодаря формированию специфической мультиламеллярной фазы ДНК-липидного комплекса, в которой молекула ДНК оказывается «зажатой» между мембранами, температура плавления ДНК повышается до 105-115 С.
? Проведен детальный анализ структурных изменений мембран в условиях трансформации клеток фамотрицательных бактерий экзогенной ДНК. Показано сходство механизмов полиморфных изменений мембран бактерий, ответственных за трансмембранный перенос ДНК, и полиморфизма липидов, наблюдаемого в модельных системах.
? Исследованы структурные изменения мембран Escherichia coli при инфицировании бактериофагом Т4. Впервые показана роль межмембранных взаимодействий и процессов слияния мембран в инфицировании бактериальных клеток. Обнаружена специфическая структура, названная «тоннелем», ответственная за перенос молекулы ДНК через мембраны бактериальной клетки.
