Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1. Аминокислоты. Пептиды. Белки 9
2. Типы вторичных структур белков 13
3. Сворачивание белков и пептидов 20
Глава II. Методы 36
Общая характеристика методов компьютерной химии 36
Методы, основанные на представлениях молекулярных орбиталей 38
а) Полуэмпирические методы расчетов 42
б) Неэмпирические {ah initio) методы 46
Методы эмпирического силового поля (ММ и МД) 49
Поверхность потенциальной энергии 51
Детали расчетов. Повышение точности и калибровка 56
Глава III. Пространственная организация и свойства аминокислот 60
1. Общие свойства молекул 20 a-L-аминокислот в газовой фазе 60
2. Основные конформеры молекул аминокислот 69
Глава IV. Особенности электронного строения монопептидов 80
Глава V. Дипептиды, трипептиды и более длинные после довательности 86
Глава VI. «Прямая» спирализация: многостадийность процесса 92
Глава VII. Терминирование «прямой» спирализации и «обратная» спирализация 100
Глава VIII. Оценка влияния воды на процесс спирализации олигопептида 107
1. Влияние молекул связанной воды на структуру цвиттер-иона 108
2. Влияние воды на процесс спирализации олигопептидов 109
Заключение 112
Выводы 113
Список литературы 114
- Типы вторичных структур белков
- Методы, основанные на представлениях молекулярных орбиталей
- Основные конформеры молекул аминокислот
- «Прямая» спирализация: многостадийность процесса
Введение к работе
Одним из важнейших биохимических процессов, на которых базируется жизнь, является синтез белка. Именно протеины определяют структуру и форму клетки, служат инструментами молекулярного узнавания и катализа. Будучи собранными всего из 20 типов аминокислот, каждая из которых обладает ярко выраженной химической индивидуальностью, белки характеризуются чрезвычайным разнообразием пространственной структуры, а также физических и биохимических свойств. Вообще говоря, реализация генетической программы любого организма, во многом, сводится к синтезу полипептидов, контролю этого процесса, сворачиванию и адресной доставке образующихся белков. При этом, для функционирования протеинов крайне важным является приобретение их молекулами определенной, уникальной пространственной организации (вторичной, третичной или даже четвертичной структур). Такой процесс, проходящий при физиологических условиях и характеризующийся переходом «от неупорядоченности - к порядку» называют «сворачиванием» или «фолдингом белка» [1]. С физической точки зрения, самоорганизация белковых структур относится (по классификации Пригожина) к классу явлений «возникновение порядка из порядка», т.е., говоря словами Шредингера, трехмерный «апериодический кристалл» структуры белка образуется в результате реализации заранее фиксированного порядка звеньев в его цепи. В целом, самоорганизация трехмерной структуры белков (и РНК, и кристаллов вообще) возникает из стремления молекул к термодинамическому равновесию и минимуму энергии.
Существующая «проблема фолдинга белка» весьма обширна и не нова - первые гипотезы о сворачивании линейных полипептидов относятся к 50-м годам прошлого века. Начиная с работ Анфинсена по денатурации-ренатурации рибонуклеазы [2], говорят, что все необходимые сведения о физиологически активном пространственном строении белка и его конформационных возможностях заключены в его аминокислотной
последовательности. В процессах свертывания и развертывания полипептидной цепи проявляется непосредственная связь между химическим и пространственным строением молекулы белка. При этом, строго говоря, обратимость сворачивания-разворачивания справедлива не для всех белков, но факты, установленные для некоторых молекул, позволили утвердить тезис о том, что вся необходимая информация для определения нативной формы белка содержится именно в самой последовательности аминокислот. К тому же, трансляция линейного набора звеньев в трехмерную структуру возможна лишь при определенных физиологических условиях.
Несмотря на проведенное детальное рассмотрение отдельных стадий сворачивания молекулы белка, выявление и описание интермедиатов фолдинга, несколько ключевых вопросов остались недостаточно сконкретизированными. В частности, вопрос о том, каким образом на том или ином месте полипептидной цепи формируются участки с альфа- или бета-структурой - этими доминантными способами укладки полипептидного остова в глобулярных белках. Традиционно считается, что данные способы упаковки белка обусловлены не столько специфическими взаимодействиями боковых остатков аминокислот, сколько регулярным формированием водородных связей между пептидными группами внутри самой полипептидной цепи. Однако, при всем многообразии экспериментальных и теоретических данных, свидетельствующих о важной роли стерических факторов, гидрофобности, электростатических потенциалов и других характеристик в организации альфа-спиралей, уникальный, зависящий от аминокислотной последовательности, физический механизм альфа-спиральной нуклеации требует значительного уточнения.
До недавнего времени в теоретических работах в этой области крайне редко учитывались соотношения энтальпийно-энтропийных вкладов, а также особенности колебательно-вращательной динамики систем такого типа. Поэтому, в целом, исследования влияния состава аминокислотной последовательности на образование того или иного типа вторичной
структуры белка не потеряли своей актуальности и в настоящее время. Поиск ответа на поставленный вопрос: «каков механизм сворачивания белка?» — остается одной из самых любопытных задач как для классической протеомики, так и для современной молекулярной биофизики.
Сегодня, в ходе работ в этой области, наряду с современными прецизионными экспериментальными методиками исследований, широкое применение находят и теоретические (компьютерные, in silico) молекулярно-механические и квантово-химические подходы. При этом, наиболее совершенные теоретические квантово-химические методы расчета характеристик электронной структуры молекул достигают (а подчас и превышают) по точности результаты, полученные при использовании многих экспериментальных методик. Несомненно, важной и привлекательной особенностью квантово-химических подходов является возможность с одинаковым успехом исследовать свойства как экспериментально наблюдаемых структур,- так и по каким-либо причинам ненаблюдаемых, модельных молекулярных систем. При этом изучаемые объекты могут быть легко модифицируемы таким образом, чтобы наиболее четко выявить вклад какого-либо четко детерминированного структурного параметра или взаимодействия в исследуемую характеристику. Вместе с тем, драматизм ситуации заключается в том, что многие энергетические эффекты, лежащие в основе обсуждаемой проблемы, зачастую лежат на грани величин ошибок используемых методов моделирования (~1 ккал/моль), а традиционные экспериментальные техники оказываются неспособными зарегистрировать тонкие молекулярные перестройки даже в максимально «чистых» системах in vitro.
Цель и задачи исследования
ЦЕЛЬ данного исследования заключается в том, чтобы на основе учета особенностей электронного строения аминокислотных остатков детализировать и развить физический механизм сворачивания альфа-спирали.
В рамках поставленной цели представлялось важным решить следующие задачи:
1) Теоретически проанализировать и систематизировать структурные,
энергетические, зарядовые и колебательно-динамические особенности всех
20 протеиногенных L-аминокислот и ряда пептидов. Выделить основные
факторы, которые могут определять существование «внутренней
предрасположенности» аминокислотного остатка к образованию того или
иного типа вторичной структуры олигопептида;
2) На основе полученных результатов дополнить известный
нуклеационный механизм формирования первого витка альфа-спирали, а
именно обосновать ключевую роль кислых и основных аминокислотных
остатков не только в стабилизации спиральных участков, а вообще в
инициировании спиральной структуры; описать возможный механизм такого
процесса;
3) Методами молекулярной динамики исследовать начальную стадию
процесса образования спиралей в олигопептидах разного состава и оценить
термодинамические характеристики отдельных стадий такого процесса;
изучить зависимость процесса спирализации от природы олигопептида и
наличия терминирующих факторов.
Научная новизна
В работе впервые теоретически проведены подробные и последовательные структурные исследования широкого класса молекул - от аминокислот до олигопептидов. Структурные характеристики были оценены в едином квантово-химическом полуэмпирическом (а в ряде случаев - и в неэмпирическом) приближении. Динамическое поведение молекул анализировалось методами молекулярной динамики в силовом поле AMBER и OPLS. Нестандартной и важной особенностью данной работы является одновременный учет поведения большого набора параметров молекулы: не только поведения классических торсионных углов «фи» и «пси», но и термодинамических, спектральных характеристик, дипольных моментов, инерциальных дефектов, химических жесткостей, а также энергетик и локализаций вакантных и заполненных орбиталей молекул при анализе структурной организации аминокислот и олигопептидов.
Анализ полученных нами и известных из литературы данных позволил не только предложить и обосновать новую классификацию всех основных конформеров аминокислот, но и впервые постулировать ключевую роль бифуркационного внутримолекулярного водородного связывания [3] в инициировании альфа-спиральной организации молекул олигопептидов, содержащих заряженные аминокислотные остатки аспартата, глутамата, аргинина, лизина и гистидина.
Практическая значимость работы
Полученные результаты имеют как фундаментальное значение - для понимания биофизических механизмов ранних стадий сворачивания белков и пептидов - так и прикладное: могут быть использованы в биоинженерии при рациональном дизайне новых биомакромолекул с заданной пространственной структурой или «запрограммированной» кинетикой перехода «клубок-спираль».
Типы вторичных структур белков
При сравнении пространственной структуры различных протеинов выяснилось, что, хотя конформация каждого белка уникальна, определяющим моментом в структурной организации выступает регуляризация полипептидной цепи, которая определенным образом повторяется в различных частях макромолекулы. Особенно часто встречаются два способа регуляризации (укладки), поскольку они обусловлены упорядоченным образованием водородных связей между самими пептидными группами, а не уникальными взаимодействиями боковых цепей. Эти оба способа были правильно предсказаны в серии работ Лайнуса Полинга и Роберта Кори [8, 9, 10] - и имеют теперь общепризнанное определение «альфа-спираль» и «бета-слой».
Сделанные авторами предсказания возможных структур полипептидной цепи основаны на следующих постулатах: 1) полагаются одинаковые значения для длин связей и валентных углов всех пептидных групп полипептидной цепи. В литературе они получили название геометрических параметров Полинга-Кори; 2) пептидная группа считается плоской. Возможны две плоские конфигурации группы, отличающиеся взаимным расположением связей N-H и С=0, цис- и транс- конформационный переход между которыми связан с преодолением высокого потенциального барьера (-20 ккал/моль). При этом, согласно оценке Р.Кори и Дж.Донахью, отклонение от плоского строения группы на 10 вызывает повышение энергии всего лишь на 1.5 ккал/моль, а на 30 — на 6 ккал/моль. В альфа-спиралях и бета-слоях пептидная группа полагается находящейся в транс-конфигурации; 3) предполагается полная насыщенность полипептидной цепи водородными связями. Для водородной связи N-H...O=C были приняты следующие геометрические и энергетические оценки: расстояние N... О считается равным 2,8 А, максимальное отклонение от линейности N—Н...0 не должно превышать 30, энергия связи — 8,0 ккал/моль; 4) при построении моделей пептидной цепи выбираются наиболее благоприятные ориентации пептидных групп, разделенных атомом СО, с учетом потенциалов внутреннего вращения вокруг связей Ca-N и Са-С и ван-дер-ваальсовых контактов между атомами; 5) конформационные состояния всех звеньев пептидной цепи считаются эквивалентными.
Строго говоря, полипептидная цепь способна образовывать несколько типов спиралей, причем все они стабилизируются водородными связями: С=0 группы остова полипептида связаны с H-N группами, лежащими от них в направлении С-конца цепи. Различают следующие спирали, стянутые Н-связями: 27, Зю, 4и (обычно именуемая «альфа-спиралью») и 5іб (она же «пи-спираль»). Расшифровываются типы спиралей следующим образом: «27» — «2» означает связь со 2-м по цепи остатком, а «7» — число атомов в цикле (О H-N-C -Ca-N-C), замыкаемом этой связью. Аналогичный смысл имеют цифры и в названии других спиралей. Резонен вопрос: какие из этих спиральных структур преобладают в белках? Альфа-спирали, и этот ответ кроется в деталях карты Рамачандрана для типичного аминокислотного остатка — аланина, на которой отмечены конформации, периодическое повторение которых приводит к завязыванию вышеперечисленных водородных связей (рис.2). Видно, что локальный энергетический минимум, отвечающий спирали альфа-R (правая альфа-спираль) является наиболее выгодным среди других минимумов, характеризующих спиральные конформации иных типов. Рисунок 2. Конформации различных вторичных структур на фоне карты разрешенных и запрещенных конформации аминокислотных остатков, (взято из [6].) 2iK, 2-jL: правая и левая спираль 2f, ЗкД ЗюЬ: правая и левая спираль Зю; OCR, aL — правая и левая a-спираль; 7tR, 7TL — правая и левая л-спираль. р — Р-структура. Р — спираль Poly(Pro)II. U — конформации, разрешенные для аланина (А1а); і — области, разрешенные лишь для глицина, но не для аланина и других остатков; I — области, запрещенные для всех остатков, фиу - углы внутреннего вращения в белковой цепи.
В силу этого обстоятельства можно ожидать, что именно правая альфа-спираль должна быть, как правило, более стабильной, и потому преобладать в белках - что и наблюдается экспериментально. В таком типе вторичной структуры белка все атомы упакованы оптимально: плотно, но без напряжений. Поэтому альфа-спирали очень распространены в глобулярных белках, а в фибриллярных они нередко достигают гигантской длины и включают сотни аминокислотных остатков. Другим следствием продемонстрированной карты Рамачандрана является то, что левых альфа-спиралей в белках практически нет. Нет и спиралей 2-j, которые, мало того что лежат на самом краю разрешенной области, но еще имеют энергетически невыгодный, почти прямой угол схождения N-H и 0=С групп. Практически нет в белках и пи-спиралей - они тоже лежат на самом краю разрешенной области. А вот спирали 3]0 (в основном - правые, - левые пригодны практически лишь для глицинов) в белках есть, правда, в виде коротких (из трех-четырех остатков) и деформированных фрагментов. Важно отметить еще одно важное свойство альфа-спиралей: на их N-конце расположены свободные от внутриспиральных водородных связей Н атомы N-H групп, а на С-конце — свободные от водородных связей О атомы С=0 групп. Так как электронное облако с Н атома частично стянуто электроотрицательным атомом азота, а электроотрицательный атом кислорода сам стягивает электрон с атома углерода основной цепи, то N-конец спирали несет парциальный положительный, а С-конец — парциальный отрицательный заряд. Другими словами, альфа-спираль представляет собой протяженный диполь: величина суммарного (поставляемого тремя NH-группами) частичного положительного заряда на ее N-конце составляет около половины протонного, а величина отрицательного заряда на С-конце альфа-спирали — около половины электронного заряда [6].
Методы, основанные на представлениях молекулярных орбиталей
Квантовая механика, созданная сначала как способ интерпретации атомных спектров, в настоящее время является основой для предсказания и объяснения многих физических свойств молекул, в том числе биомакромолекул. В принципе, любую наблюдаемую физическую величину можно вычислить квантовомеханическим путем, если только удается решить уравнение Шредингера, найти волновую функцию и соответствующую ей энергию.
Однако, практически невозможно найти точные решения этого уравнения, поэтому приходится искать приближенные методы решения уравнения Шредингера. Так, несмотря на то, что атомы ядер молекулы находятся в движении, предполагают, что они неподвижны относительно быстро движущихся в молекуле электронов и поэтому их описывают фиксированными координатами в пространстве (приближение Борна-Оппенгеймера [112]). Энергия системы и оператор Гамильтона в приближении Борна-Оппенгеймера могут быть записаны в следующем виде: Y72 А,І rAi Kj rtJ І 8л- m где А и В - ядерные центры, i,j — электроны, новый гамильтониан Н содержит только электронные члены. Хотя движение каждого электрона влияет на движение остальных электронов (электронная корреляция), прибегают к еще одному приближению и строят полную электронную волновую функцию из индивидуальных электронных волновых функций. При этом, межэлектронное отталкивание учитывается в виде взаимодействия между одним электроном на данной орбитали и усредненным полем остальных электронов молекулы. При таком подходе можно выразить полную электронную волновую функцию молекулы в виде нормированного произведения антисимметризованных одноэлектронных волновых функций.
Для систем с замкнутой электронной оболочкой, где каждая орбиталь занята парой электронов, полная волновая функция обычно записывается в виде одного слейтеровского детерминанта: Т = (п!) ср«(1)ф (2)...ф?(«-1)ф (л)5 где ф" (к) - одноэлектронная молекулярная волновая функция (р-я молекулярная орбиталь), которая описывает к электрон со спином а; ц рр (/) одноэлектронная молекулярная волновая функция (р-я молекулярная орбиталь), которая описывает к электрон со спином Р; (л!) п - нормировочный множитель, в котором п равно числу электронов во всей молекуле.
Таким образом, задача определения волновой функции молекулы свелась к необходимости построения набора молекулярных орбиталей на которых находятся все электроны молекулы. В принципе этот набор можно получить путем комбинирования любого числа функций электронных распределений различного типа или путем составления лишь одной чрезвычайно сложной функции, позволяющей описать электронную плотность на каждой молекулярной орбитали. В применяемом далее приближении молекулярные орбитали представляются в виде нормированной линейной комбинации атомных орбиталей, центрированных на составляющих молекулу атомах. В этом случае, расчет молекулярной орбитали представляет собой поиск комбинаций атомных орбиталей, соответствующих симметрии молекулы и минимальному значению электронной энергии.
Важным также является и то обстоятельство, что сами по себе отдельные молекулярные орбитали непосредственного физического смысла не имеют - по той простой причине, что полная (многоэлектронная) волновая функция не меняется, если набор молекулярных орбиталей, из которых она составлена, заменить на другой набор орбиталей, представляющих собой линейные комбинации исходных. Именно на этой возможности линейного преобразования орбиталей основаны построения, сводящиеся к переходу к эквивалентным молекулярным орбиталям, гибридным орбиталям и тому подобным конструкциям, широко используемым в современной теоретической химии и позволяющим с различных сторон взглянуть на то, что происходит при образовании химической связи.
Для того чтобы преодолеть трудности связанные с вычислением полной энергии молекулы и молекулярных орбиталей используют подход Хартри [113], который предложил исходя из некоторого первоначального распределения заряда, определить волновые функции и вычислить значения энергий орбиталей Ер в начальном (первом) приближении. Затем полученные результаты можно использовать для получения энергий и волновых функций в следующем приближении. Такую процедуру можно повторять до тех пор, пока разность значений энергий на двух последовательных итерациях не станет меньше какой-либо наперед заданной величины, т.е. система достигнет самосогласования. Такой подход получил название метода самосогласованного поля (ССП) Хартри-Фока-Рутана.
Необходимо также отметить, что даже если проведены вычисления по методу самосогласованного поля с наибольшей доступной точностью, остается различие между полученной энергией и реальной электронной энергией молекулы, т.к. в уравнениях не учитываются электронная корреляция и релятивистские эффекты Еэл=ЕхФ+Екорр+Ера1. Конфигурационное взаимодействие т.е. взаимодействие между разными состояниями, отвечающих разным распределениям электронов, может быть внесено в теорию на более поздних этапах, например, с помощью теории возмущений (Moller-Plesset perturbation theory [114]).
Суммируя вышесказанное, при построении теории МО ЛКАО прибегают к следующим приближениям в решении уравнения Шредингера: Адиабатическое приближение (Борна-Оппенгеймера); Одноэлектронное приближение (отказ от электронной корреляции); Однодетерминантное приближение; Приближение молекулярной орбитали в виде линейной комбинации атомных орбиталей; Вычисления по методу ССП. Вместе с тем, реализованные на МО ЛКАО теории квантово-химические методики расчетов достигают и подчас превышают по точности многие наиболее точные экспериментальные методики.
Основные конформеры молекул аминокислот
Как известно, в формировании пептидных связей в олигопептидах принимают участие карбоксильные и аминогруппы при Са-атоме связывающихся аминокислот. Поэтому представлялось важным изучить исходную конформационную лабильность разных типов аминокислот и выделить у них наиболее устойчивые локальные формы (конформеры).
Как показал расчет, из полученных восьми устойчивых изомерных форм одиночных аминокислот наибольшее внимание обращают на себя два типа конформеров. Один из них отвечает изомеру глобального минимума потенциальной энергии молекулы. Во всех аминокислотах это примерно однотипные структуры с z/ис-одинаковой ориентацией связей с тяжелыми атомами. Так, в аланиноподобных эта форма близка к структуре 1, (Рис. 7). В аминокислотах, имеющих боковой радикал с разветвленной системой валентных связей, глобальному минимуму энергии соответствует вторая форма (структура 2, рис. 7). В кислых и основных аминокислотах — это третья форма. Все они, тем не менее, по геометрическим параметрам, оказываются далекими от структуры аминокислот в сс-спиралях. Другой тип конформеров, принадлежащих виду трянс-конформеров, хотя пространственно довольно значительно отличается от первого, однако термодинамически он оказывается всего на 1—2 ккал/моль менее стабильным. На рис. 2. это структуры 5 и 6. В тоже время структура этих конформеров уже хорошо согласуется с наблюдаемой геометрией остатков аминокислот в а-спиральных участках. Вполне возможно, что при определенных внешних условиях (т.е. начиная с некоторого размера удлиняющейся пептидной цепи и при наличии некоторого количества молекул связанной воды) энергетика, этого типа конформеров может стать доминирующей.
Рассчитанные величины инерциальных дефектов и дипольных моментов всех рассмотренных конформеров оказались изменяющимися в довольно значительных пределах. Это вполне ожидаемый результат, вследствие различий в пространственной ориентации целых групп атомов в молекуле каждой аминокислоты. Наблюдается также и заметные различия значений абсолютных энтропии для различных структурных изомеров, что связано с частотными изменениями колебательно-вращательных степеней свободы молекулы при таких конформационных перестройках (Табл. 6). У большинства молекул обращает на себя внимание явно пониженные (у конформеров 1 и 5) значения «химического потенциала», величину которого часто используют в качестве меры химической активности соединений.
Мы также оценили изменение энергии Гиббса для различных конформационных состояний аминокислот (Табл. 6). Важно отметить, что в данном контексте AAG следует понимать не в традиционном смысле, а как некоторую характеристику, включающую энтропийный фактор и описывающую энергетику переходов между разными конформерами. В результирующих сечениях этой поверхности свободной энергии молекул аминокислот тоже получены дополнительные локальные минимумы, отвечающие все тому же выделенному устойчивому второму типу конформеров, а именно, структурам 5 и 6 (Рис. 7). Поскольку ряд конформеров аминокислот (по два у глицина и у цистеина) в рамках выбранной схемы расчета воспроизводились нестабильно, представляло интерес оценить энергетику и дипольные моменты (как весьма чувствительную к конформации характеристику) в рамках более точного, ab initio подхода (в базисе MP2/6-311++G ). Результаты выполненных расчетов для молекулы глицина приведены в таблице 7. Для сравнения там указаны геометрические параметры восьми конформеров молекулы, а также величины их дипольных моментов (ц, дебай), инерциальные дефекты и некоторые термодинамические характеристики. Для конформера №1 приведены данные расчетов, взятые из литературы [150], а также экспериментальные данные [150]. Отмеченные особенности молекул аспартата и глутамата, а именно, образование внутримолекулярных водородных связей между «остовом» молекулы и ее боковой группой, подтверждаются и точными расчетами ab initio (MP2/6-311++G ): энергетические характеристики трех основных конформеров аспартата (структуры без водородных связей в боковой группе и с водородными связями, причем образованными двумя возможными способами) приведены в таблице 8. Стоит отметить, что наличие внутримолекулярной водородной связи в молекуле кислой аминокислоты подтверждается точными расчетами с учетом многоэлектронных корреляционных поправок; явная же энергетическая выгодность структуры такого типа позволяет считать вероятность заселения конформации такого типа довольно высокой. Таким образом, в результате проведенного большого объема расчетов, выполненных различными методами, нами подтверждено существование двух особых конформации каждой аминокислоты. Одна из них отвечает глобальному минимуму полной энергии молекулы и соответствует z/z/c-ориентации С=0 и CaN групп.
«Прямая» спирализация: многостадийность процесса
С целью более наглядного представления процесса спирализации длинных олигопептидных цепочек в работе были выполнены молекулярно-динамические (МД) расчеты различных вариантов аминокислотных последовательностей. Были использовали популярные пакеты программ Hyperchem [176] и TINKER [177], в вариантах наиболее востребованных потенциалов валентно-силовых полей: AMBER, CHARMM, OPLS. Изучалась спирализация олигопептидов, состоящих из восьми-, двенадцати- и шестнадцати остатков глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, цистеина, с различным местоположением аспартатного или глутаматного остатка. Также нами были рассмотрены гетероаминокислотные последовательности включающие как спиралеобразующие, так и спиралеразрушающие остатки (8-EAAAVWG, 8-DSVASVAS, 8-ECSAILAL и 12-DAGAGAGAGAGA), а также цепочки, на N-конце которых отсутствовали кислые аминокислоты Asp и Glu (например, полиаланин) и цепочки состоящие из чередующихся остатков аланина и валина.
Перед началом расчета МД-траектории структуру каждой молекулы оптимизировали в том силовом поле, с помощью которого предполагалось вести дальнейшую работу. Время рассмотрения процесса динамики ограничивалось 100 ps, шаг равнялся 0.001 ps. Рабочая температура и давление были взяты, соответственно, 310К и 1 атм. Выбор указанного промежутка времени основан на том, что в 16-членной цепочке из аспартата и аланинов (калибровочный расчет) первые витки спирали образовывались уже через 60-70 ps, а регуляризация всей структуры закачивалась к 100 ps. В случае октапептидов (а также 12-членных цепочек) первые витки образовывались уже за 45-50 ps, а спирализация заканчивалась примерно через 80 ps. В последующие времена в молекулах наблюдались небольшие флуктуации структуры по углам р и у/, что проявлялось во вращательных подвижках межвитковых водородных связей около положений равновесия. Важно отметить, что наиболее стабильное воспроизведение «сворачивания» указанных молекул в спирали происходит при использовании силового поля OPLS. Хотя эмпирические поля типа AMBER, CHARMM и OPLS были созданы специально для работы с белками и нуклеиновыми кислотами, однако, только параметризация OPLS оказалась более надежной в оценке вкладов нековалентных взаимодействий и потому более адекватной в описании динамики пептидов в газовой фазе [139]. Полученные результаты в иллюстративной форме представлены на рисунке 12. Анализ МД-траекторий всех указанных соединений выявил следующие общие закономерности: 1) Процесс «сворачивания» аминокислотной последовательности в спиральную форму, согласно расчетам, происходит в несколько стадий. Сначала боковая группа кислого остатка (Asp или Glu) «находит» ближайший к ней атом азота основной цепи и, «подтягивается» к нему через водородную связь. После этого, остов цепи, изгибаясь, формирует дополнительные Н-связи. Очень скоро боковая группа Asp или Glu окружает себя сетью водородных связей, а сам остов оказывается свернутым в своеобразный «завиток» (Рис.13). Дальнейшее развитие процесса идет путем достаточно быстрого достраивания и наращивания числа регулярных межвитковых пептидных водородных связей либо до конца цепочки, либо до начала действия какого-нибудь структурного фактора, терминирующего спирализацию. 2) Точка спирализации линейной цепочки определяется местом положения в ней остатка Asp или Glu. Расчет показал, что начало искривления молекулярного остова и образование регулярных межвитковых водородных связей происходят только на остатках, следующих за Asp или Glu в направлении от N- к С-концу.
Энергетика процесса спирализации тоже имеет свои особенности. В то время как динамика конфомационных превращений исследуемых молекул была хорошо видна и могла быть проанализирована, энергетическая сторона данного вопроса оставалась не совсем ясной. В процессе 100-пс МД-расчета аланинового октапептида с аспартатом в начале последовательности, полная энергия системы ожидаемо уменьшалась, что отражено на рисунке 15. Отметим, что величина полной энергии здесь отражает сумму потенциальной и кинетической энергий молекулы, рассчитанных в приближении ньютоновской механики и характеризует положение системы относительно минимума на гиперповерхности потенциальной энергии молекулы. Для того, чтобы детализировать процесс спирализации с точки зрения изменения свойств электронной структуры молекулы, мы разделили всю траекторию динамики на участки по 10 пс, после чего выделили конформеры, соответствующие этим точкам, и провели для них необходимые квантово-химические расчеты.
Дальнейший выход энтальпийной кривой 2 в затухающую колебательную фазу отражает процесс завершения регуляризации межвитковых пептидных Н-связей с небольшими флуктуациями геометрии спирализованного остова олигопептида около положения равновесия.
При этом, как показал РМЗ-расчет, разные стадии процесса «закручивания» пептида оказывается характеризуются и разным видом спектра нормальных колебаний соответствующих конформеров. Особенно это касается низкочастотных мод. Так, если для начального состояния олигопептида - состояния вытянутой цепочки, длинноволновая граница спектра нормальных колебаний лежит в области очень низких частот, порядка 5 см"1, то для конформера 20 пикосекундной молекулярной динамики, где начинают формироваться внутримолекулярные Н-связи, эта граница мод уже сдвигается в область 10 см"1. Для полностью организованной спиральной структуры с формировавшейся сеткой водородных связей граница спектра перемещается еще дальше в высокочастотную область и лежит уже в районе 20 см" .
Поскольку наибольший вклад в термодинамику колебательных процессов вносят, как известно, самые низкочастотные моды, то согласно полученным данным ясно, что в рассматриваемой кинетике спирализации олигопептида состояние колебательной энтропии должно играть значительную роль. Из графика 1 (Рис.16) видно, что энтропийный вклад в суммарную энергетику процесса действительно оказывается не малым. При этом, хотя изменение гиббсовой энергии и остается симбатными изменению энтальпии, отражающая его кривая имеет более пологий характер, что свидетельствует о важном вкладе энтропийного фактора в процессе организации альфа-спиралей.
