Содержание к диссертации
Введение
1.1 Введение: классификация клеточных рецепторов, про- и эукариотические рецепторы класса І 13
1.2 Галобактериальный трансдьюсер 2 из Natronobacterium pharaonis 14
1.2.1 Фототаксис в Natronobacterium pharaonis: сенсорный родопсин 2 и трансдьюсер 2 14
1.2.2 Хемотаксис в Escherichia coli и Salmonella typhymurium: аспартатный и сериновый рецепторы 17
1.2.3 Современные представления о механизмах передачи сигнала в системах фото- и хемотаксиса 20
1.3 Рецептор фактора роста эпидермиса человека 24
1.3.1 Физиология и структура рецептора фактора роста эпидермиса человека 24
1.3.2 Современные представления о механизмах передачи сигнала рецептором фактора роста эпидермиса человека 27
1.4 Формулировка целей диссертационной работы 28
Материалы и методы
2.1 Оборудование и материалы 29
2.1.1 Оборудование 29
2.1.2 Материалы и химические реагенты 32
2.1.2.1 Ферменты для генной инженерии 32
2.1.2.2 Праймеры 32
2.1.2.3 Маркеры для гель-электрофореза 34
2.1.2.4 Носители для хроматографических колонок 34
2.1.2.5 Детергенты и липиды 35 2.1.3 Растворы 35
2.1.3.1 Буферные растворы для работы с ДНК 36
2.1.3.2 Буферные растворы для секвенирования 36
2.1.3.3 Буферные растворы для агарозного гель-электрофореза 36
2.1.3.4 Буферные растворы для гель-электрофореза в ДСН 36
2.1.3.5 Буферные растворы для иммунноблоттинга 37
2.2 Клонирование, работа с Exoli и клетками млекопитающих 37
2.2.1 Бактериальные штаммы, клеточные линии и плазмидные векторы
37
2.2.1.1 Бактериальные штаммы и клеточные линии 37
2.2.1.2 Плазмидные векторы 38
2.2.1.3 Питательные среды и пищевые добавки 38
2.2.2 Методы клонирования 42
2.2.2.1 Агарозный гель-электрофорез 42
2.2.2.2 Определение первичной последовательности ДНК 42
2.2.2.3 Полимеразная цепная реакция 42
2.2.2.4 Очистка продуктов полимеразной цепной реакции 43
2.2.2.5 Цитирование вставки в плазмидный вектор 43
2.2.3 Работа с клетками Exoli АА
2.2.4 Работа с клетками линии COS-1 44
2.2.5 Работа с клетками линии НЕК 293S 46
2.3 Очистка и приготовление образцов белков 48
2.3.1 Выделение и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 48
2.3.2 Выделение и очистка цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека 49
2.3.3 Выделение и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 50
2.3.4 Анализ качества рекомбинантных белков 51
2.3.4.1 Полиакриламидный гель-электрофорез в ДСН 51
2.3.4.2 Иммунологический анализ 51
2.3.4.3 Измерение концентрации белков 53 2.4 Биофизические и биохимические методы исследования белков 54
2.4.1 Масс-спектрометрия 54
2.4.2 Круговой дихроизм 54
2.4.3 Ядерный магнитный резонанс 54
2.4.4 Инфракрасная Фурье-спектроскопия 55
2.4.5 Аналитическая гель-фильтрационная хроматография 55
2.4.6 Кросс-линкинг 55
2.4.7 Малоугловое рассеяние нейтронов 56
2.4.8 Атомная силовая микроскопия 56
3. Результаты и их обсуждение: галобактериальныи трансдьюсер 2 из Natronobacterium pharaonis
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 58
3.2 Молекулярная масса и предполагаемые сайты метилирования цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 59
3.3 Вторичная структура и конформационные изменения цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
61
3.3.1 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кругового дихроизма 61
3.3.2 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью ядерного магнитного резонанса 69
3.3.3 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии 72
3.4 Олигомеризация и агрегация цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 73
3.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью аналитической гель-фильтрационной хроматографии 73
3.4.2 Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кросс-линкинга 74
3.5 Структурный анализ цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2 77
3.5.1 Структурный анализ цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью малоуглового рассеяния нейтронов 77
3.5.2 Структурный анализ цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью атомной силовой микроскопии 83
3.6 Предсказания конформационной подвижности и вторичной структуры: сравнительный анализ 84
3.7 Модель передачи сигнала в системе сенсорный родопсин 2-галобактериальный трансдьюсер 2 в Natronobacterium pharaonis
4. Результаты и их обсуждение: фактор роста эпидермиса человека
4.1 Клонирование и экспрессия внеклеточного + трансмембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 89
4.2 Клонирование, экспрессия, очистка и характеризация цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека 91
4.3 Клонирование, экспрессия и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 95
4.4 Олигомеризация и агрегация трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 97
4.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кросс-линкинга 97
4.5 Структура и конформационные изменения трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 99
4.5.1 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кругового дихроизма 99
4.5.2 Исследование структуры и конформационных изменений трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью ядерного магнитного резонанса 102
Выводы 105
Список использованной литературы
- Хемотаксис в Escherichia coli и Salmonella typhymurium: аспартатный и сериновый рецепторы
- Выделение и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
- Молекулярная масса и предполагаемые сайты метилирования цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
- Клонирование, экспрессия и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
Введение к работе
Актуальность проблемы 9
Цели и задачи работы 11
Научная новизна 11
Обзор литературы
Введение: классификация клеточных рецепторов, про- и эукариотические рецепторы класса І 13
Галобактериальный трансдьюсер 2 из Natronobacterium pharaonis
Фототаксис в Natronobacterium pharaonis: сенсорный родопсин 2 и трансдьюсер 2 14
Хемотаксис в Escherichia coli и Salmonella typhymurium: аспартатный и сериновый рецепторы 17
Современные представления о механизмах передачи сигнала в системах фото- и хемотаксиса 20
1.3 Рецептор фактора роста эпидермиса человека 24
Физиология и структура рецептора фактора роста эпидермиса человека 24
Современные представления о механизмах передачи сигнала рецептором фактора роста эпидермиса человека 27
1.4 Формулировка целей диссертационной работы 28
Материалы и методы
2.1 Оборудование и материалы 29
Оборудование 29
Материалы и химические реагенты 32 2.1.2.1 Ферменты для генной инженерии 32
Праймеры 32
Маркеры для гель-электрофореза 34
Носители для хроматографических колонок 34
Детергенты и липиды 35 2.1.3 Растворы 35
Буферные растворы для работы с ДНК 36
Буферные растворы для секвенирования 36
Буферные растворы для агарозного гель-электрофореза 36
Буферные растворы для гель-электрофореза в ДСН 36
Буферные растворы для иммунноблоттинга 37
2.2 Клонирование, работа с Exoli и клетками млекопитающих 37
2.2.1 Бактериальные штаммы, клеточные линии и плазмидные векторы
Бактериальные штаммы и клеточные линии 37
Плазмидные векторы 38
Питательные среды и пищевые добавки 38
2.2.2 Методы клонирования 42
Агарозный гель-электрофорез 42
Определение первичной последовательности ДНК 42
Полимеразная цепная реакция 42
Очистка продуктов полимеразной цепной реакции 43
Цитирование вставки в плазмидный вектор 43
Работа с клетками Exoli АА
Работа с клетками линии COS-1 44
Работа с клетками линии НЕК 293S 46
2.3 Очистка и приготовление образцов белков 48
Выделение и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 48
Выделение и очистка цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека 49
Выделение и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 50
Анализ качества рекомбинантных белков 51
Полиакриламидный гель-электрофорез в ДСН 51
Иммунологический анализ 51
Измерение концентрации белков 53 2.4 Биофизические и биохимические методы исследования белков 54
Масс-спектрометрия 54
Круговой дихроизм 54
Ядерный магнитный резонанс 54
Инфракрасная Фурье-спектроскопия 55
Аналитическая гель-фильтрационная хроматография 55
Кросс-линкинг 55
Малоугловое рассеяние нейтронов 56
Атомная силовая микроскопия 56 3. Результаты и их обсуждение: галобактериальныи трансдьюсер 2 из
Natronobacterium pharaonis
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка цитоплазматического
домена галобактериального трансдьюсера 2 58
3.2 Молекулярная масса и предполагаемые сайты метилирования
цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
3.3 Вторичная структура и конформационные изменения
цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
3.3.1 Исследование вторичной структуры и конформационных
изменений цитоплазматического домена галобактериального
трансдьюсера 2 с помощью кругового дихроизма 61
Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью ядерного магнитного резонанса 69
Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии
3.4 Олигомеризация и агрегация цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2 73
Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью аналитической гель-фильтрационной хроматографии 73
Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кросс-линкинга 74
3.5 Структурный анализ цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2 77
Структурный анализ цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью малоуглового рассеяния нейтронов 77
Структурный анализ цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью атомной силовой микроскопии 83
Предсказания конформационной подвижности и вторичной структуры: сравнительный анализ 84
Модель передачи сигнала в системе сенсорный родопсин 2-галобактериальный трансдьюсер 2 в Natronobacterium pharaonis
87 4. Результаты и их обсуждение: фактор роста эпидермиса человека
Клонирование и экспрессия внеклеточного + трансмембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 89
Клонирование, экспрессия, очистка и характеризация цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека 91
Клонирование, экспрессия и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 95
Олигомеризация и агрегация трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека 97
4.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации трансмембранного +
примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса
человека с помощью кросс-линкинга 97
4.5 Структура и конформационные изменения трансмембранного +
примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса
человека 99
Исследование вторичной структуры и конформационных изменений трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кругового дихроизма 99
Исследование структуры и конформационных изменений трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью ядерного магнитного резонанса 102
Выводы 105
Список использованной литературы 107
Благодарности 119
Хемотаксис в Escherichia coli и Salmonella typhymurium: аспартатный и сериновый рецепторы
Образование комплекса рецептора и гистидин-киназы CheA при участии вспомогательного белка CheW запускает автофосфорилирование CheA, при этом у-фосфатная группа АТФ переносится на остаток гистидина в составе киназы. Следующим шагом является перенос фосфатной группы на остаток аспарагина киназы CheY, являющейся регулятором флагеллярного мотора бактерии. Фосфорилированная форма CheY связывается с флагеллярным мотором и переключает направление вращения жгутика с «против часовой стрелки» на обратное. При этом клетка перестаёт двигаться поступательно и начинает хаотически вращаться на месте (англ. tumbling). При следующем переключении мотора поступательное движение начинается уже в другом направлении. CheZ обеспечивает постепенный гидролиз фосфорилированной формы CheY, возвращая со временем систему в исходное состояние. В отсутствие градиента хемоэффектора постоянный уровень фосфорилированной CheY поддерживает т.н. «случайное блуждание» клетки. Связывание аттрактанта приводит к ингибированию автофосфорилирования гистидин-киназы CheA и уменьшению количества относительно короткоживущего фосфорилированного состояния CheY. Следовательно, клетка дольше двигается прямолинейно, реже изменяя направление своего движения. При репеллентном сигнале наблюдается обратная ситуация.
Связывание хемоэффектора активирует также специальную адаптационную петлю обратной связи. Она нужна для компенсации чрезмерной или недостаточной киназной активности и поддержания частоты переключений флагеллярного мотора в физиологически приемлемых рамках. Для этого рецептор имеет сайты метилирования и постоянно метилируется метилтрансферазой CheR. Метилэстераза СпеВ, напротив, активна только после переноса на неё фосфатной группы с киназы CheA. При высокой концентрации репеллента активность CheA возрастает, и количество метилированных рецепторов уменьшается. Деметилирование рецептора, в свою очередь, уменьшает связывание киназы CheA, активирующей CheB, замыкая тем самым петлю обратной связи.
Хеморецепторы существуют в виде стабильных гомодимеров, причём для передачи сигнала достаточно одного функционального мономера [26;27]. В клетке они расположены в основном на полюсах, где образуют большие кластеры [24;25;28], состоящие из тримеров димеров [22;29] (рис. 1.5).
Предполагаемая структура хеморецептора представлена на рис. 1.5 а. Эта модель основывается на кристаллической структуре цитоплазматического домена серинового рецептора (Тср-цит) из E.coli [20] и структурах периплазматического домена аспартатного рецептора (Тар) из S. typhimurium и E.coli с лигандом и без него [21;30]. Структура трансмембранного домена хеморецептора пока основывается на моделях (см., например [20]).
Периплазматический домен Тар из E.coli является гомодимером, в котором каждый мономер состоит из четырёх а-спиралей, соединённых короткими линкерными участками и образующих сайт связывания лиганда (рис. 1.5 а, слева вверху) [21]. Цитоплазматический домен Тер из E.coli также является гомодимером и представляет собой вытянутую суперспиральную структуру длиной 200 А. Каждый мономер длиной около 70 оборотов а-спирали обёртывается сам вокруг себя, формируя две длинные антипараллельные а-спирали, разделённые коротким U-поворотом. Мономеры также оборачиваются вокруг друг друга, образуя димер в виде четырёхспирального пучка (рис. 1.5 а, слева внизу) [20].
Системы хемотаксиса эубактерий и фототаксиса архебактерий имеют много общего. Эти белки принадлежат к семье т.н. МСР-белков (англ. Methyl-accepting Chemotaxis Proteins), которая насчитывает свыше 2200 членов (на 2006 год). Гомология между цитоплазматическими доменами хеморецепторов и фототранедьюсеров довольно высока [3]. Так, например, первичные структуры цитоплазматического домена Гтр2 из N.pharaonis (Гтр2-цит) и Тср-цит из E.coli идентичны на 24%. Для сравнения, Тср-цит и Тар-цит из Е.соИ идентичны на 71%. Высокая гомология имеет и функциональное подтверждение: единая конструкция из рецептора СР2 N.pharaonis с мутантным Гтр2, у которого почти весь цитоплазматический домен был заменен на Тар- или Тср-цит из E.coli, успешно экспрессировалась, при этом клетки E.coli приобретали способность к фототаксису [31;32].
Выделение и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
Трансфекцию клеток линии НЕК 293S TetR из Homo sapiens вектором pACMVetO [82] проводили по методу Chen & Okayama [83], модифицированному позднее O Mahoney & Adams [84]. Поскольку клетки этой линии уже несли плазмиду pCDNA6R (Invitrogen, США) с геном репрессора оперона tet и геном устойчивости к бластицидину в качестве селективного маркера, к среде DMEM/F-12 добавляли бластицидин до конечной концентрации 5 мкг/мл.
Замороженные в жидком азоте клетки быстро размораживали, помещая в воду при +37С. Все последующие манипуляции проводили в стерильных условиях в ламинарном шкафу, используя только стерильные материалы и реагенты. Оттаявшие клетки переносили в пробирку типа Falcon ёмкостью 15 мл и медленно (в течение 2 мин) добавляли к ним среду DMEM/F-12. Затем клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 200 g, отбирали супернатант и ресуспендировали в свежей среде DMEM/F-12. Клетки переносили на 10 см чашку Петри для клеточных культур и инкубировали при +37С, 5% С02. Питательную среду меняли каждые 3-4 дня, при этом клеткам давали занять не более -90% площади чашки, чтобы избежать их наслоения.
Когда клетки занимали около 80-90% площади чашки, их пересевали с объёмным разведением 1:10. Чашки промывали 10 мл PBS, затем для дезагрегации монослоя добавляли 1 мл раствора трипсина и инкубировали с ним 1-2 мин при +37С. После инкубации клетки отделяли от дна чашки, постукивая по чашке снизу и сбоку и визуально конролируя их отделение. Когда все клетки всплывали, добавляли 9 мл среды DMEM/F-12 и тщательно ресуспендировали. 1 мл получившейся клеточной суспензии добавляли к 9 мл питательной среды DMEM/F-12 в свежих чашках. На следующий день (через 24 ч) смешивали вместе 30 мкг ДНК, 450 мкл стерильной воды, 50 мкл 2,5 М СаС12 и 500 мкл 250 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HP04, 50 мМ BES, причем раствор BES добавляли к смеси последним. После добавления BES смесь инкубировали в течение ровно 1 мин и затем добавляли к культуре клеток НЕК 293S на чашке, добиваясь равномерного распределения трансфекционнои смеси. Чашки инкубировали при +35С, 3% С02 в течение 19 час. После этого чашки дважду промывали 10 мл DMEM/F-12 и оставляли расти в той же среде в течение 23 час при +37С, 5% С02. Затем чашки промывали PBS, пересевали с объемным разведением 1:10 (см. выше) и инкубировали при +37С, 5% С02 в течение 20 час. Селекцию клеток проводили, добавляя в питательную среду генетицин G418 до конечной концентрации 0,5-3 мг/мл. Среду меняли каждые 2-3 дня до тех пор, пока колонии клеток не достигали диаметра 2-4 мм.
Чашки промывали 10 мл PBS, затем колонии (обычно 6-8 на 10 см чашку Петри) изолировали от остальной поверхности чашки с помощью стерильных цилиндров для клонирования соответствующего диаметра, предварительно обмакнутых в стерильную силиконовую ваккумную смазку. Колонии трипсинизировали добавлением 50 мкл раствора трипсина; после 1 мин инкубации с раствором трипсина в той же последовательности добавляли по 50 мкл DMEM/F-12 с генетицином G418. Клетки в цилиндрах тщательно ресуспендировали и переносили в лунки заранее подготовленного 24-луночного планшета, содержащего на лунку по 1 мл среды DMEM/F-12 с соответствующей концентрацией генетицина. Как только клетки полностью покрывали дно лунки, образуя монослой, их пересевали по стандартной методике (см. выше) в 2 лунки 6-луночного планшета. Таким образом, клетки из одной лунки использовали для иммунологического анализа, из второй -для дальнейших экспериментов, если иммунологический анализ подтверждал наличие экспрессии требуемого гена.
Экспрессию индуцировали добавлением свежей питательной среды DME/F-12, содержащей 2 мг/мл тетрациклина гидрохлорида и 5 мМ бутирата натрия. Клетки инкубировали при +37С, 5% С02 в течение 55-60 час, затем лунки/чашки промывали PBS и механически отделяли клетки от чашки, ресуспендируя их в требуемом растворе.
Клеточные осадки после экспрессии растворяли в 300 мМ NaCl, 50 мМ NaP рН 6 в отношении 1:2-1:3 (вес/об). После того, как раствор становился визуально гомогенным, его дополнительно пропускали 3-5 раз через гомогенизатор Даунса. Затем клетки разрушали трехкратным пропусканием через пресс Френча под давлением 75 атм. Полученную суспензию мембран подвергали ультрацентрифугированию (130.000 g) в течение часа при +4С. Для осаждения белка к супернатанту постепенно добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. После замутнения смесь в течение часа выдерживали на холоду при постоянном перемешивании, затем центрифугировали (75.600 g, 30 мин, +4С). Полученный супернатант использовали для следующего шага высаливания. После центрифугирования все осадки, содержащий Гтр2-цит, растворяли в 50 мМ NaP рН 6,7. Раствор белка наносили на колонку с HiTrap Butyl FF, уравновешенную тем же буфером. Белок элюировали с колонки линейным градиентом концентрации сульфата аммония (от 750 до 0 мМ). Белок сходил с колонки при концентрации сульфата аммония между 270 и 150 мМ. Все фракции анализировали с помощью гель-электрофореза в ДСН. Фракции, содержащие Гтр2-цит, объединяли, концентрировали и наносили на гель-фильтрационную колонку HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade, заранее уравновешенную элюционным буфером. Фракции также анализировали с помощью гель-электрофореза в ДСН. В случае Гтр2-цит-НІ8 фракции, содержащие белок после очистки на НІТгар Butyl FF, медленно наносили на заранее уравновешенную 300 мМ NaCl, 50 мМ NaP рН 8 (8-Ю объёмов смолы) хроматографическую колонку со Ni2+-NTA агарозой в качестве носителя. Затем ее промывали тем же буфером, но с добавлением 15 мМ имидазола, (10-15 объёмов смолы) для избавления от примесей. Для смыва Гтр2-цит-Ніз с колонки использовали тот же буфер с концентрацией имидазола 200 мМ. В качестве последнего шага очистки использовали колонку HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade, как было описано выше. После анализа качества полученного белка его фракционировали и хранили при +4С. При необходимости его концентрировали, используя концентраторы.
Молекулярная масса и предполагаемые сайты метилирования цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
Содержание различных элементов вторичной структуры оценивали с помощью программного пакета CDPro [88]: -77% неструктурных элементов, 7% поворотов, -13% р-листов и 3% а-спиралей. Полученные цифры могут неточно отражать реальный процентный состав из-за погрешностей определения различных типов вторичной структуры, поэтому приводимые значения не следует рассматривать как абсолютно точные. Скорее, они отражают тенденции изменений вторичной структуры белка. Приведённые величины ошибок рассчитаны на основе ошибки в определении концентрации белка (до 10%), а не на погрешности моделирования спектров КД, которая существенно ниже. Кроме того, следует отметить, что степень неупорядоченности белка, получаемая на основании расшифровки спектров КД, может быть сильно завышена: гибкие а-спирали в конформационно подвижных белках имеют спектры КД, схожие с таковыми для неупорядоченных белков [103]. Учитывая высокую конформационную подвижность и гибкость Гтр2-цит (см. ниже), приводимые ниже предсказания содержания элементов вторичной структуры не следует трактовать прямо. Изменение спектров КД в присутствии различных веществ может быть как следствием индуцирования новых элементов вторичной структуры, так и стабилизации уже существующих в смысле ограничения их конформационного пространства, т.е. уменьшения их динамики. Полностью разделить оба эффекта экспериментально в рамках данной работы не представлялось возможным, но данные, полученные с помощью других методов, говорят о преимущественной стабилизации уже существующих, но сильно конформационно подвижных а-спиралей Гтр2-цит, т.е. изменении в динамике белка.
Форма спектра КД была неизменной при рН 5, при этом белок оставался почти полностью неупорядоченным. При более низких значениях рН, вплоть до рН 2, происходило постепенное упорядочивание Гтр2-цит (в смысле появления спиральных элементов вторичной структуры) Глицерин и сахароза стабилизировали а-спиральную конформацию Гтр2-цит предположительно за счёт упорядочивания гидратационной оболочки вокруг белка, уменьшающей энтропию растворителя [104; 105].
При низких концентрациях глицерин предпочтительней стабилизирует Р-структуры, с незначительным увеличением доли а-спиралей в белке (рис. 3.6). Напротив, при концентрации глицерина в растворе 60%о (об/об) и выше количество предсказанных спиральных элементов вторичной структуры в белке увеличивается с 25% (при 60% (об/об) глицерина) до -70% (при 90% (об/об) глицерина). Вместе с этим уменьшается содержание неструктурных элементов до 18%о в 90%) (об/об) глицерине. Вклады Р-структур и поворотоэлементов вторичной структуры (б) Гтр2-цит от концентрации сахарозы. На (б) синий цвет соответствует неструктурным элементам, красный - Р-листам, зелёный - поворотам, чёрный - а-спиралям.
Вплоть до 50% насыщенного раствора сахарозы Гтр2-цит сохранял исходную конформацию. Затем наблюдаемое содержание а-спиралей росло с -5% до -43%, а вклад неструктурных элементов уменьшался с -82% до -31%. В 90% насыщенном растворе сахарозы содержание Р-элементов и поворотов составляло -7% и -19%, соответственно.
ТФЭ, обладающий способностью индуцировать в белке а-спирали, был использован для контрольного эксперимента. В присутствии ТФЭ спектр КД Гтр2-цит постепенно изменяется вплоть до соответствующего почти полностью а-спиральной конформации: от -4% при 10% (об/об) ТФЭ и до -77% при 98,5% (об/об) ТФЭ (рис. 3.8). Содержание неструктурных элементов уменьшается соответственно. Вклад остальных элементов вторичной структуры минимален.
Вплоть до 30% насыщения сульфата аммония, сильного высаливающего агента, Гтр2-цит имел спектр КД, соответствующий в основном неупорядоченной конформации (рис. 3.9). Между 30% и 60% насыщения спектры КД характеризовались предсказанным содержанием а-спиралей -60-64%. При концентрации более 60% насыщения сульфата аммония, наблюдали следующие изменения: содержание спиральных элементов уменьшалось, доля неструктурных элементов увеличивалась, так же как и вклад поворотов. Плато при достижении 80% насыщения сульфата аммония и выше характеризовалось -50% а-спиралей, -4% Р-складчатых листов, -19% поворотов и -27% неструктурных элементов.
В присутствии хлоридов одновалентных металлов Гтр2-цит имел спектр КД, соответствующий неупорядоченному состоянию, вплоть до концентрации соли 3 М. С увеличением концентрации соли до 4 М быстро увеличивалась наблюдаемая доля а-спиралей и уменьшалось количество неструктурных элементов. Однако содержание а-спиралей различалось при одинаковой ионной силе разных солей (рис. 3.10): сильнее всего было выражено влияние хлорида натрия (содержание а-спиралей -41%), слабее всего - хлорида цезия (содержание а-спиралей -7%). Хлориды щелочноземельных металлов (кальция и магния) при этом практически не влияли на форму спектра КД.
Клонирование, экспрессия и очистка трансмембранного + примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
Ранее с помощью ЯМР была определена структура примембранного домена РФРЭ в мицеллах ДФХ [58]. Кроме того, имеются убедительные доказательства того, что трансмембранный домен РФРЭ преимущественно а-спирален как в мицеллах детергента, так и в липидных мембранах [64; 140]. До сих пор неизвестно, каковы конформация и структура обоих доменов в составе единой полипептидной цепи, поэтому His-тмп-РФРЭ-Strep исследовали с помощью ЯМР в растворах различных детергентов.
При сравнении спектров ЯМР РКэ-тмп-РФРЭ-Зггер в 10% D20, 50 мМ NaP рН 6, 100 мМ ОГ, в 10% D20, 50 мМ NaP рН 6, 100 мМ ДСН и в 10% D20, 103 50 мМ NaP рН 6, 100 мМ ДФХ обнаружились значительные различия (рис. Так, в мицеллах нейтрального детергента ОГ разброс резонансов довольно мал (рис. 4.14 а), что свидетельствует о значительной неупорядоченности HisMn-P 3 P3-Strep. Однако в мицеллах заряженного (ДСН, рис. 4.14 б) или цвиттерионного детергента (ДФХ, рис. 4.14 в) спектр His-тмп-РФРЭ-Strep выглядит иначе: разброс резонансов существенно увеличивается, следовательно, белок становится более упорядоченным. Исходя из данных КД, можно предположить, что наличие отрицательно заряженной группы у молекул детергента необходимо для взаимной укладки элементов вторичной структуры в стабильную третичную структуру: например, путём взаимодействия многочисленных положительно заряженных боковых групп аргининов и лизинов в примембранной области с противоположно заряженными головными группами детергента. При этом петлевые участки сохраняют высокую подвижность: резонансы, относимые к ним, узкие и находятся в районе 8,3 ppm по оси химических сдвигов протонов. Таким образом, спиральные элементы в составе His-тмп-РФРЭ-Strep, скорее всего, соединены гибкими петлями, обеспечивающими большую подвижность спиралей относительно друг друга, как было показано ранее для примембранного домена [58;69]. На основании вышесказанного можно заключить, что трансмембранный домен РФРЭ не влияет на структуру гибких петель в прилегающей к нему цитоплазматическои области.
1. Создана плазмидная конструкция, соответствующая цитоплазматическому домену галобактериального трансдьюсера 2 (Гтр2-цит, аминокислотные остатки 234-504 Гтр2) из Natwnobacterium pharaonis, осуществлена успешная экспрессия мутантного гена в Escherichia coli, разработана система очистки рекомбинантного Гтр2-цит с выходом около 10 мг/л клеточной культуры.
2. В разбавленных водных растворах Гтр2-цит обладает высокой конформационной подвижностью. Спирты, сахара, соли и свободные протоны индуцируют и/или стабилизируют вторичную структуру Гтр2-цит; в случае солей количество а-спиральной вторичной структуры и её устойчивость к тепловой денатурации, а также склонность Гтр2-цит к агрегации зависят от природы соли. В частности, в растворах 4 М хлоридов щелочных металлов наблюдаемое количество а-спиральных элементов вторичной структуры убывает в ряду Na+ Li+ К+ Rb+ Cs+, а температура денатурации - в ряду Li+ Na+ К+ Rb+.
3. В разбавленных водных растворах Гтр2-цит мономерен и имеет цилиндрическую форму с характерными размерами 202±5 А в длину и 14,4±0,6 А в диаметре. При условиях, близким к физиологическим (4 М КС1), Гтр2-цит преимущественно димерен, характерные размеры при сохранении общей формы увеличиваются до 248±7 А и 18,2±0,8 А, соответственно.
4. Создана плазмидная конструкция, соответствующая трансмембранному + примембранному доменам рецептора фактора роста эпидермиса (тмп-РФРЭ, аминокислотные остатки 615-686 РФРЭ) из Homo sapiens, осуществлена успешная экспрессия мутантного гена в Escherichia coli, разработана система очистки рекомбинантного тмп-РФРЭ с выходом около 5 мг/л клеточной культуры.
5. Тмп-РФРЭ имеет схожее содержание элементов вторичной структуры в мицеллах различных детергентов, существенно отличное от такового в липидном окружении. Третичная структура тмп-РФРЭ различна в разных детергентах даже при количественном совпадении элементов вторичной структуры.
6. Данные настоящей работы указывают на то, что конформационная динамика является общим свойством отдельных областей белков, осуществляющих трансмембранную передачу сигнала.
