Введение к работе
Актуальность проблемы. Кровь является уникальной биологической средой, способной обеспечивать и поддерживать гомеостаз организма человека.
В настоящее время в связи с увеличением частоты возникновения чрезвычайных ситуаций: природных катаклизмов (землетрясения, цунами), террористических актов, автомобильных катастроф, а также ростом числа операций по пересадке органов и тканей, постоянно возрастает потребность в трансфузии цельной крови и её отдельных компонентов (Б.А. Барышев, 2005). Недостаток донорской крови и наличие ряда ограничений по её использованию: опасность передачи при переливании бактериальных и вирусных инфекций (S.M. Fakhry, G.F. Sheldon, 1995; G.B. Schreiber et al, 1996), возможность несовместимости донорской крови и крови реципиента по антигенному составу, короткие сроки хранения, требуют создания искусственных кровезаменителей (M.G. Scott et al., 1997; R.M. Winslow, 2002).
Важнейшим компонентом крови является гемоглобин, который обеспечивает полноценное снабжение организма человека кислородом, что приобретает особую значимость при развитии различных патологических состояний.
В связи с этим весьма актуальным является разработка кислородпере-носящих растворов на основе гемоглобина, химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий (Н.П. Кузнецова и соавт., 2002; С. Jin et al., 2004; P.W. Buehler et al., 2006). Несмотря на определенные успехи в этой области, необходимо продолжать поиск химических соединений и способов модификации молекул гемоглобина с целью эффективной регуляции свойств гемопротеида и снижения степени отрицательных эффектов введения растворов гембелка в организм человека.
В качестве таких веществ нами были выбраны представители высокомолекулярных полианионов, производные декстрана - реополиглюкин (РП) и диальдегиддекстран (ДАД), а также полиэтиленгликоль (ПЭГ), нашедшие применение в молекулярной биологии и медицине (И.П. Гладышева и соавт., 2001; А.В. Максименко и соавт., 2001; И.Н. Топчиева и соавт., 1998; A.S. Morar et al, 2006).
Таким образом, проведение экспериментов по поиску соединений, эффективно модулирующих функциональную активность гемоглобина, и изучение влияния данных веществ на структурно-функциональные свойства молекул гембелка имеют важное теоретическое и практическое значение.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось исследование структурно-функциональных свойств гемоглобина человека, модифицированного препаратами на основе нативного декстрана (реополиглюкин), его окисленного производного (диальдегиддекстран) и поли-этиленгликолем.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
Исследовать физико-химические характеристики молекул гемоглобина человека, модифицированных ПЭГ и препаратами на основе декст-рана.
Изучить механизмы взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином, диальдегиддекстраном и полиэтиленгликолем.
Исследовать термостабильность и химическую устойчивость молекул модифицированного гемоглобина человека.
Построить и проанализировать компьютерные модели диальде-гиддекстрана и его комплексов с гемоглобином человека.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния реополиглюкина, диальдегиддекстрана и поли-этиленгликоля на структурно-функциональные свойства интактных, термостатированных и модифицированных гуанидин-гидрохлоридом (ГГХ) молекул гемоглобина человека.
Выявлены оптимальные условия для связывания гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами. Изучены механизмы взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином и ДАД.
Установлена возможность формирования комплекса гемоглобина человека с ПЭГ при создании повышенного давления в реакционной среде.
Обнаружено, что производные декстрана повышают устойчивость белковых молекул к денатурирующим факторам, что позволяет относить данные соединения к весьма перспективным агентам для модификации гемопротеида с целью создания искусственных кровезаменителей.
Созданы пространственные модели молекулы ДАД, комплексов гемоглобин-ДАД I и II типов. Установлены номера аминокислотных остатков глобина, с наибольшей вероятностью участвующих в формировании связей с полисахаридом. Методом молекулярной динамики показано сохранение конформационной лабильности гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга, что свидетельствует о способности конъюгатов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации.
Разработана схема процессов, протекающих в растворах интактных и модифицированных РП, ДАД и ПЭГ молекул гемоглобина человека при воздействии температуры и ГГХ, позволяющая проследить взаимосвязь между изменениями в структуре гемопротеида и проявлением его физико-химических свойств.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях структурно-функционального состояния гемоглобина человека в условиях различного микроокружения.
Результаты изучения физико-химических свойств препаратов гемоглобина в присутствии РП, в комплексах с ПЭГ и химически модифицированного гембелка (различные комплексы гемоглобин-ДАД) необходимо принимать во внимание при рассмотрении вопросов, связанных с созданием искусст-
венных кровезаменителей.
Экспериментальные данные по исследованию механизмов взаимодействия молекул гемоглобина человека с РП, ДАД и ПЭГ могут быть использованы специалистами, работающими в области молекулярной биологии и биофизики, а также лицами, занимающимися синтезом новых лекарственных средств и биологически активных молекул, что позволит более успешно решать проблемы стабилизации биологических свойств и функций изучаемых соединений.
Материалы работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета при проведении практикумов, выполнении дипломных и магистерских работ студентами.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 8 Международной конференции по химии и физикохимии оли-гомеров «Олигомеры - 2002» (Черноголовка, 2002); VII Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); XIX Съезде физиологов России (Екатеринбург, 2004); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); VIII Международной научно-экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); научно-практической конференции «Скорая медицинская помощь: реальность и перспективы» (Воронеж, 2006); Научных сессиях сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
Диальдегиддекстран является эффективным модулятором структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека и способен значительно повышать устойчивость гемопротеида к действию физических и химических денатурирующих факторов.
Полиэтиленгликоль при высоком давлении в растворе образует комплексы с гемоглобином человека, увеличивает компактность белковой глобулы и понижает термочувствительность молекул гемопротеида.
Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекстран I и II типов.
Схема процессов, протекающих в растворах интактных, термостатированных и модифицированных гуанидин-гидрохлоридом молекул гемоглобина человека в присутствии реополиглюкина, диальдегиддекстрана и полиэтиленгликоля.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 151 страницу машинописного текста, 9 таблиц, 45 рисунков. Состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения» и «Выводов». В списке цитируемой литературы 155 работ, из них 78 отечественных и 77 зарубежных.
