Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 8.
Глава 1. Общие сведения о биологических мембранах и липидах. 8.
Глава 2. Проводящие структуры в липидных мембранах. Липидные поры . 12.
Глава 3. Лизолипиды и холестерин. 28.
Глава 4. Взаимодействие X и Л с макрофагами как пример биологической активности смеси . 30.
Часть 2. Материалы и методы. 33.
Часть 3. Результаты. 51.
Глава 5. Смесь лизолипидов и холестерина, сбалансированная по СК (Л-Х смесь), формирует стабильную БЛМ. 51.
Глава 6. Измерение механических параметров мембран из лизолипидов и холестерина .
Глава 7. Стабильные БЛМ, содержащие Л-Х смесь, способны к спонтанному формированию пор. 55.
Глава 8. Систематическое исследование проницаемости мембран, сформированных из смеси Л-Х плюс базовый липид. Типы активности . 56.
Глава 9. Проверка результатов по порообразованию, полученных на плоской БЛМ, на липосомах. 63.
Глава 10. Поры в липосомах обратимы (могут закрываться), как и в БЛМ. 71.
Глава 11. Теоретические оценки энергии липидной поры в мембране с небислойными компонентами. 74.
Глава 12. Возникновение неоднородностей латерального распределения липидов в мембранах с Л-Х смесью. 79.
Глава 13. Поглощение липосом макрофагами линии IC-21. 82.
Обсуждение. 85.
Выводы. 92.
Список использованной литературы. 94.
- Проводящие структуры в липидных мембранах. Липидные поры
- Взаимодействие X и Л с макрофагами как пример биологической активности смеси
- Измерение механических параметров мембран из лизолипидов и холестерина
- Систематическое исследование проницаемости мембран, сформированных из смеси Л-Х плюс базовый липид. Типы активности
Введение к работе
Лизолипиды и холестерин являются важными и широко распространенными компонентами биологических мембран, они активно участвуют во многих биологических процессах, ключевым этапом которых является изменение проницаемости мембран. Так, холестерин необходим для взаимодействия мембраны с некоторыми токсинами (Rossjohn , 1997; Billington, 2000), лизолипиды участвуют в формировании пор апоптозными белками Всі - семейства (Basanez, 1999; Goonesinghe, 2005). Поэтому исследование механических свойств и механизмов регуляции проницаемости (формирования пор, свойств пор) в мембранах, содержащих лизолипиды и холестерин, является одной из приоритетных задач биофизики мембран. Активность лизолипидов и холестерина связана в первую очередь с их небислойностью. Небислойные липиды - это липиды, имеющие существенно разные площади поперечного сечения на уровне гидрофильных голов и на уровне гидрофобных хвостов - ненулевую спонтанную кривизну (СК). Такие липиды in vitro могут формировать мембранные структуры большой кривизны (например, сферические мицеллы, образуемые лизолипидами, обладающими существенной положительной СК), однако в клетках они упакованы в плоский бислой. Известно, что стабильность такой упаковки обусловлена аддитивностью СК, бислой может быть создан целиком из небислойных компонентов, подобранных так, что средняя СК каждого монослоя близка к нулю. Как холестерин (отрицательная СК) так и лизолипиды (положительная СК) стремятся в области липидного бислоя, обладающие большой геометрической кривизной, а также в области дефектов упаковки липидов. Именно поэтому оба компонента активно участвуют в регуляции внедрения в мембрану белков и формировании белок-липидных пор и комплексов. Одним из важнейших аспектов поведения мембран с холестерином и лизолипидами, остающимся мало изученным, является взаимодействие холестерина и лизолипидов, которые, по сути, являются антагонистами (имеют противоположную по знаку СК). В модельных системах было показано, что они могут взаимно компенсировать свое действие на липидный бислой, а также склонны к образованию бимолекулярного комплекса, формируя водородную связь (Brockerhoff, 1974) (Рис. 1). Как такое сродство влияет на интегральные свойства мембраны (в т.ч. латеральную однородность), и порообразование остается невыясненным.
Рис. 1. Липиды с разной СК. «Циллиндры» - нулевая СК (диолеоилфосфатидилхолин), «обратные конусы» - положительная СК (лизолипиды), «конусы» отрицательная СК (холестерин). Холестерин и лизолипиды могут формировать между собой водородные связи. В соотношении 1:1 формируют стабильные липосомы.
Это особенно актуально для оценки поведения лизолипидов в биологических мембранах, где лизолипиды зачастую функционируют в присутствии большого количества холестерина. В последнее время наметилась тенденция к переоценке роли липидного бислоя в биологических процессах в рамках концепции активных мембран (Manneville; Ramaswamy, 2000). Ученые склоняются к тому, что липидная мембрана может быть не просто пассивным механическим барьером, а сложноорганизаванной многокомпонентной структурой, способной принимать непосредственное участие в регуляции различных процессов. Активные мембраны (в отличие от активного ионного транспорта) определяются как мембраны, не находящиеся в положении термодинамического равновесия, например, содержащие источник внешнего неравновесного шума (Ramaswamy, 2000). Активная мембрана кроме минимума энергии соответствующего состоянию «однородный плоский равновесный бислой» имеет и другие, которые соответствуют состояниям «мембрана с порой», «мембрана с кластерами», и др. Возможность переходов из плоского однородного состояния в одно из других и обратно, с сохранением структурной целостности и служит критерием активности мембраны. Другим существенным свойством активных (как, впрочем, и неактивных) мембран является их стабильность во времени. Под стабильностью понимается сохранение некоторых свойств, таких как - структурная устойчивость, целостность липидного бислоя. В биологических системах мембраны далеки от равновесия т.к. содержат большое количество активных элементов и обмениваются содержимым. Присутствие небислойных липидов является практически необходимым условием активности: любая модификация плоского равновесного бислоя (добавка белка, формирование поры), значительно облегчена при соответствующей подстройке локальной кривизны мембраны. Моделирование активных, неравновесных мембран в искусственных системах началось сравнительно недавно, при этом в качестве неравновесного элемента используется белковая добавка. Таким образом, липидному бислою (как обычно, и при описании клеточных процессов) отводится пассивная роль (матрицы). Однако и чисто липидные мембраны «активны», например, вблизи точки фазового nepexofla(Antonov, 1980). Активность мембран может быть (по крайней мере, феноменологически) связана с обратимой порацией мембран. Ранее, для осуществления обратимой порации использовалось сильное-кратковременное внешнее воздействие (такое, как импульс электрического потенциала, повышение концентрации Са , и т.д.) поскольку даже у метастабильных мембран под натяжением, БЛМ, энергетический минимум достаточно глубок. Использовались также и небислойные компоненты, однако, их использование часто приводило к потере стабильности. Так, при добавлении в фосфолипидную мембрану более 5% лизолипидов они(мембраны) теряют стабильность(СІіегпотогсІік, 1985). Обратимое порообразование в модельных системах наблюдалось редко и контролируется плохо. Тем не менее,использование небислойных липидов остается наиболее перспективным подходом т.к. именно они являются строительным материалом для стабильной поры. Мембраны, содержащие холестерин и лизолипиды в больших количествах, представляют собой идеальную модель для реализации различных типов активности. Противоположная спонтанная кривизна и существование молекулярного взаимодействия может содействовать стабилизации мембраны, а высокая степень небислойности поможет реализации активных свойств.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Проводящие структуры в липидных мембранах. Липидные поры
Другие механизмы обмена веществом между клеткой и внешней средой предусматривают образование в мембране проводящих структур. К таковым относятся ионные каналы и поры, образованные комплексами белков (таких, как аквапорин) (Agre, 2002). При различных клеточных патологиях поры образуются токсинами, апоптозными белками. Поры могут отличаться по строению проводящего канала. Он может быть чисто белковым - отверстие в трансмембранной молекуле белка, образующего канал или полость образованная несколькими молекулами белка, белок-липидным — если внутренняя поверхность поры образована как белковыми молекулами, так и молекулами липида (Billington, 2000; Bonnafous, 2000; Mancheno, 2003; Anderluh, 2003;Goonesinghe, 2005), и чисто липидным (если канал поры образован лишь липидными молекулами (Рис. 4). Белковыми порами являются, например, различные ионные каналы (они являются наиболее изученным примером). Некоторые природные токсины и антибиотики тоже формируют белковую пору (грамицидин). Про белок-липидные поры известно меньше, тем не менее существуют доказательства их существования в живых клетках. При взаимодействии мембраны с цитолизином происходит образование таких пор (Rossjohn, 1997). На электронной микрофотографии видна структура кромки. Она состоит из комплекса белковых и липидных молекул. Существование чисто липидных пор до сих пор не было показано ни в одной из природных систем. Существует большое число процессов в живой клетке, связанных с увеличением проницаемости мембран. Для некоторых из них установлен механизм таких изменений, а для некоторых механизм не известен. К числу последних относятся взаимодействия с мембраной различных токсинов, апоптозных белков BCL-2 семейства, пептида слияния вируса гриппа. Вирус гриппа содержит на поверхности своей мембраны особый белок - гемагглютинин, который отвечает за распознание, адсорбцию и слияние с мембраной клетки-мишени. Было показано, что при слиянии вируса с клеткой, проницаемость клеточной мембраны возрастает.
По мнению большинства исследователей, такая структура наиболее полно отражает строение гидрофильной (инвертированной) липидной поры. экспрессирующих гемагглютинин клеток с эритроцитами было показано так же при помощи измерений её электрической проводимости. При этом изменение проницаемости происходило даже в отсутствии полного слияния (т.е. объединения водных объемов), а лишь при полуслиянии (объединении липидных мембран). Предполагается, что в образовании проводящих дефектов в мембране клетки мишени происходит с участием гидрофобного пептида слияния - малого участка белка слияния гемагглютинина, а так же липидов мембраны. Показано, что скорость формирования поры в мембране, взаимодействующей с апоптозным белком BCL-семейства, может зависеть от липидного состава мембраны, а точнее, от молекулярной геометрии липидов, формирующих мембрану. Небислойные липиды, имеющие положительную СК (лизолипиды), увеличивают вероятность формирования и проводимость поры, индуцированной про-апоптозными белками. Механизм формирования дефектов в мембране при взаимодействии с вирусными пептидами слияния, токсинами и апоптозными белками до сих пор не ясен. Однако ясно, что роль липида в этих процессах велика. Поэтому изучение липидных пор поможет лучше понять механизм возникновения проводящих структур в мембране. Проводящая пора в мембране представляет собой сквозной канал с гидрофильными стенками, заполненный молекулами воды с растворенными в ней веществами. В зависимости от свойств поры те или иные растворенные в цитоплазме или в межклеточной жидкости вещества с различной скоростью проникают через пору в мембране клетки, или не проникают совсем. Проницаемость поры для разных веществ определяется различными факторами, хорошо изучеными на примере белковых каналов - размерами поры и молекулы вещества (стерический фактор), зарядом молекулы вещества и зарядом, сосредоточенным в канале поры и на поверхности мембраны (электростатические взаимодействия), специфическими взаимодействиями молекулы (или нескольких молекул) вещества с определенным участком канала, отвечающим за распознавание и пропускание (селективная проницаемость). Кроме того, каналы могут иметь несколько состояний, в которых их проницаемость существенно различается. Простейший пример - два состояния «канал открыт» и «канал закрыт», когда проводимость не отличается от фоновой проводимости мембраны. На сегодняшний день существует ряд работ как теоретических, так и экспериментальных, посвященных изучению липидных пор. Одно из центральных мест в области исследования проводящих пор в липидной мембране занимают работы, посвященные электропорации. Известно, что сильное увеличение проводимости клеточных и искусственных мембран может быть вызвано действием достаточно высоких потенциалов, что свидетельствует об увеличении проницаемости мембраны для растворенных ионов (Chang, 1992; Dressier, 1983). В случае если амплитуда или длительность импульса внешнего напряжения достаточно велики, происходит необратимое разрушение мембраны. Этот феномен носит название электропорации или электрического пробоя.
Поры, получаемые электропорацией - наиболее изученный тип липидных пор. Исследование таких пор долгое время являлось основным источником информации о свойствах липидных пор. Поэтому стоит подробнее на электропорации.
Экспериментальные данные по электропорации мембран. Еще в середине девятнадцатого века было установлено, что при действии сильного электрического поля возбудимые ткани необратимо повреждаются (Pfluger, 1859), а в 1936 году такое повреждение тканей было связано с разрушением клеточных мембран (Hill, 1936). В конце 50-х годов 20-го века было начато систематическое изучение влияния сильных электрических полей на биологические мембраны. Было показано, что при сильной гиперполяризации перехватов Ранвье (до 150-200 мВ) наблюдается рост электрической проводимости мембраны (Stampfli, 1957). Барьерные свойства мембраны восстанавливались после возвращения потенциала к нормальному значению. Но если гиперполяризация достигала потенциалов порядка 350-400 мВ, происходило необратимое разрушение мембран. Исследования влияния высокого электрического потенциала на клеточные мембраны проводилось на множестве разнообразных биологических объектов. В работах на эритроцитах Кинозита показал, что в ходе электрического пробоя увеличивается проницаемость мембран эритроцитов для молекул большого размера (Kinozita, 1977).
Наряду с плазматическими мембранами живых клеток электрическое напряжение вызывает пробой модельных мембран - БЛМ (Chernomordik, 1987). При этом различают обратимый (Benz, 1979) и необратимый электрический пробой мембран (Tien, 1974).
Необратимый электрический пробой наблюдается на искусственных мембранах разных составов: азолектин, общие липиды мозга, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и т.д. (Абидор, 1978; Чизмаджев, 1982). Индивидуальные реализации необратимого электрического пробоя БЛМ отличаются друг от друга, однако картина поведения мембран имеет ряд характерных черт. После приложения напряжения происходит зарядка мембраны при которой устанавливается стационарная проводимость, соответствующая фоновой проводимости мембраны. Через некоторое время (зависящее от состава и напряжения) возникают так называемые предпробойные флуктуации проводимости, после чего мембрана разрушается (Рис. 5). Основным наблюдаемым показателем является время жизни мембраны под действием напряжения. Это величина промежутка между моментом подачи напряжения и моментом разрушения мембраны. Время жизни зависит от величины приложенного напряжения и от липидного состава мембраны. Например, для мембран из ксилана-О и общих липидов мозга быка время жизни при 300 мВ составляет 19 и 2211 мс соответственно.
Взаимодействие X и Л с макрофагами как пример биологической активности смеси
Известно, что макрофаги в неограниченных количествах поглощают окисленный липопротеид низкой плотности (ЛНП) (Steinberg, 1997; Tabas, 2002). Он содержит специальный протеин, холестерин, фосфолипиды (в том числе значительное количество лизолипидов). Наличие лизолипидов - одно из основных отличий окисленного ЛНП от неокисленного. Неокисленный ЛНП в норме поглощается и перерабатывается макрофагами в небольших количествах — это нормальный физиологический процесс. При этом все поглощенные вещества после переработки выводятся из макрофагов (нет накопления какого-либо из компонентов ЛНП). Неограниченное поглощение окисленного ЛНП приводит к отложению в макрофагах большого количества xoлecтepинa(Kritharides, 1998; Tall, 2002). Холестерин накапливается в специальных депозитах - липидных каплях (lipid droplets). Такое накопление ведет к деградации макрофагов - превращению их в так называемые «пенные клетки» (foam cells), и последующей гибели (Kroth, 2001). Большое количество окисленного ЛНП наблюдается в местах воспалений (как результат воздействия свободных радикалов при окислительном взрыве). Массовая деградация и гибель макрофагов с отложением холестерина является причиной зарождения и роста холестериновых бляшек в стенках кровеносных сосудов (Glass, 2001). Это одно из основных проявлений атеросклероза (Libby, 2002; Linton, 2003; Colley, 2004). Исходя из этого, можно предположить влияние лизолипида на метаболизм холестерина в макрофагах. Исследование этого влияния позволит продвинуться в понимании причин такого заболевания, как атеросклероз, и помочь разработать перспективные методы лечения. Кроме того, за последнее время появилось множество работ, посвященных различным липосомальным системам доставки лекарств (Chonn, 1998; Hafez, 2000; Fattal, 2004). Липосомы, содержащие лизолипиды и холестерин могут оказаться перспективными для разработок подобных систем.
В заключении обзора литературы можно сделать следующие заключения. К настоящему времени формирование стабильной липидной поры показано только для специального случая мембран (заданной липидной композиции, сформированных методом Монтала), содержащих церамиды. Стабилизация кромки поры (обуславливающая длительное время жизни поры) происходит из-за кластеризации церамидов, формирующих особую структуру. Тем не менее, остается невыясненым, как церамиды индуцируют структурные преобразования мембраны, приводящие к формированию поры.
Хотя важная роль "церамидных" пор в процессе апоптоза не вызывает сомнения, в общем случае (т.е. произвольная липидная композиция) остается открытым вопрос о закономерностях (спонтанного) поророждения - иначе, насколько специфичен церамид, могут ли другие липиды (их комбинации), и при каких условиях, формировать поры спонтанно, без внешнего стимула.
Известно, что формирование пор в мембране возможно индуцировать латеральной перестройкой мембраны (например, при кластеризации липидов в процессе фазового перехода). Возникновение латеральных неоднородностей является одним из немногих, если не единственным, экспериментально подтвержденным событием, ведущим к формированию пор.
Небислойные липиды, в особенности смесь лизолипидов и холестерина, являющиеся стимуляторами структурных перестроек мембраны, представляются перспективной моделью, могущей связать формирование латеральных неоднородностей (кластеризацию лизолипидов и холестерина), формирование поры и стабилизацию кромки поры. Распространенность лизолипидов и холестерина в биологических мембранах, их биологическая активность, делает исследование мембран, содержащих лизолипиды и холестерин достаточно перспективным.
Постановка задачи. Таким образом, возникает следующая постановка задачи: исследовать (активные) свойства мембран, содержащих лизолипиды и холестерин; разработать общую модель активной мембраны на основе липидов с противоположной СК (с управляемой проницаемостью), исследовать механизмы образования поры, стабильности ее кромки, определить возможности практического использования таких мембран.
Необходимо сразу определить, что далее под активностью будем понимать увеличение ионной проницаемости мембраны (связанное с формированием пор). Исследования мембранной активности будут ограничены классом мембран, содержащих лизолипид-холестериновые смеси.
Измерение механических параметров мембран из лизолипидов и холестерина
Как описано в Материалах и методах, для получения значаний В необходимо было провести два эксперимента — с выдуванием исходно плоской БЛМ до полусферы и с вытягиванием из плоской БЛМ мембранной нанотрубки. Первая эксперимент позволял определить латеральное натяжение а, второй -стационарный диаметр нанотрубки, находящейся под натяжением с. Затем по формуле =2o-/(l/(R+a)2+l/(R+a+h)2 (см. Материалы и Методы) определялся модуль изгиба. Измерения были сопряжены с некоторыми сложностями: для большинства составов, содержащих смесь Л-Х и базовый липид, не удалось измерить натяжение из-за больших флуктуации при выдувании. Тем не менее, удалось измерить значения а для чистой Х-Л смеси и для чистого базового липида (Рис. 14). В обоих случаях натяжение составляло 1 10"3±0.1 10 3 Н/м. В экспериментах с вытягиванием мембранной нанотрубки наблюдалась следующая тенденция: с ростом содержания лизолипидов и холестерина в мембране, растет равновесный радиус нанотрубки (Рис. 14). Так как радиус растет как квадратный корень из модуля изгиба, значения модуля изгиба для мембран из чистой Л-Х смеси (50-50) получились большие: 160±30Г. Таким образом, данные свидетельствуют об особом фазовом состоянии - похожем на L0 фазу.
Отметим, что хотя модуль изгиба не был определен для состава 40-40, равновесные значения радиуса липидных нанотрубок такого состава значительно выше радиусов нанотрубок, содержащих 40 мол% холестерина в базово липиде. Это еще раз свидетельствует о специфическом взаимодействии (кластеризации) холестерина и лизолипида.
Из мембран, содержащих большое (30мол% и более) количество лизолипида, только мембраны, содержащие 25% ОФХ, 25% ОФЭ и 50% X имели удельную проводимость не отличающуюся от таковой, характерной для БЛМ, сформированных из базового липида. Проводимости составляла менее 0,4 мкС/см2 - при напряжении на мембране 50 мВ ток не превышал предела разрешения установки - 5 пА. Изменение соотношения ОФХ: ОФЭ вызывает флуктуации проводимости БЛМ, активность «канального типа» при сохранении общей стабильности БЛМ.
Флуктуации проводимости также наблюдаются в мембранах с высоким содержанием Л-Х смеси и малым содержанием базового липида. При этом появление активности коррелировало с дестабилизацией мембраны (см. ниже). По всей видимости, роль стимулятора активности играет либо разбаланс СК, либо взаимодействие Л-Х смеси с другими компонентами смеси, формирующей стабильную мембрану. Далее приведены подробные данные об изменениях проводимости и устойчивости мембран, содержащих Л-Х смеси.
Была исследована активность (изменения проводимости) мембран, сформированных из смесей базового липида с Л-Х. Было проведено несколько серий экспериментов, с целью изучить закономерности порообразования в мембранах, содержащих различное количество Л-Х смеси.
Диаграмма на Рис. 12 суммирует проведенные эксперименты. Основную часть составляют эксперименты, в которых использовались БЛМ с равным содержанием лизолипида и холестерина (группы А, Б и В). Таких экспериментов было проведено 128. Контрольная серия (группа Г) состояла из экспериментов на мембранах не содержащих ни лизолипида, ни холестерина. Всего было проведено десять контрольных опытов. Небольшая серия экспериментов (4 регистрации) проводилась с мембранами, содержащими 15 мольных процента лизолипида и 30 мольных процентов холестерина (на рисунке не представлено). Далее описаны результаты, характеризующие качественное изменение поведения проводимости БЛМ, содерхащей Л-Х смесь, полученные при варьировании содержания Л-Х (движении по биссектрисе - Рис. 12). В подзаголовках отражено процентное (мол%) содержание X и Л в БЛМ, остаток составляет базовый липид.
Состав 40-40. В мембранах, сформированных из 40% ОФХ, 40% X, 13% ДОФХ и 7% ДОФЭ проявлялась электрическая активность канального типа -похожая на активность ионных каналов. При этом сразу после формирования мембраны, проводимость была на уровне фоновой. Через некоторое время происходил резкий скачок проводимости на уровень 500-1500 пСм. На фоне этого уровня проводимость начинала скачкообразно меняться. После каждого скачка проводимость выходила на стационар - формировала новый стабильный уровень. Это похоже на работу ионных каналов - акты открытия и закрытия, разделенные некоторым временем жизни в открытом состоянии. Через некоторое время (около 3-5 мин) проводимость снижалась, постепенно возвращаясь к нулевой. Характерный пример регистрации показан на Рис. 15. Для статистической обработки электрическая активность мембран регистрировалась в течение 5 мин после формирования (чтобы не захватывать зону снижения активности). Всего проведено 64 эксперимента. В 35 экспериментах наблюдалась активность канального типа. Длина регистрации с «канальной» активностью 152 мин. Несколько отрезков регистрации изображены на Рис. 16. Видно, что существуют стационарные уровни с резкими переходами между ними. Такую картину можно наблюдать в широком диапазоне временных разрешений. Эти данные обрабатывались при помощи специального программного обеспечения. Рис. 17 иллюстрирует этот процесс. Выделялись последовательные скачки проводимости вверх и вниз одинаковой амплитуды, разделенные стабильным уровнем проводимости. Такие события трактовались как открытие липидной поры, её жизнь в открытом состоянии и её закрытие. При этом определялась амплитуда скачка, пропорциональная размеру поры, и время жизни поры в открытом состоянии. Электрическая активность канального типа коррелировала с некоторой дестабилизацией БЛМ: 15 из 35 мембран с активностью имели время жизни меньшее 10 мин., в то время как для неактивных мембран соотношение было 4:29.
Систематическое исследование проницаемости мембран, сформированных из смеси Л-Х плюс базовый липид. Типы активности
Состав 30-30. Мембраны, сформированные из смеси, содержащей 30% ОФХ, 30% X, 27% ДОФХ и 13% ДОФЭ, так же самопроизвольно меняли проводимость в ходе эксперимента. Протокол был такой же как и в случае мембран с 40% лизолипида и 40% холестерина. Проведен 51 эксперимент. В 25 случаях наблюдалась активность канального типа, суммарное время таких регистрации 64 мин. Однако в этих регистрациях активность канального типа встречается обнаружила в таких мембранах очень мало сигналов, соответствующих одиночным липидным порам. Это иллюстрируется Рис. 18. Видно, что события «канального типа» гораздо более редки чем для мембран состава 40-40 (Рис. 16). Напротив, мембраны, проявляющие активность были менее стабильными, чем активные мембраны группы 40-40: 15 из 25 «активных» мембран имели время жизни меньшее 10 мин., в то время как для мембран без детектируемой канальной активности, только 7 из 26 разрушились за время меньшее 10 мин.
Составы с суммарным содержанием X и Л менее 60 мол%. Мембраны, сформированные из смеси, содержащей 20% ОФХ, 20% X, 40% ДОФХ и 20% ДОФЭ так же демонстрировали изменения проводимости. Однако, такие изменения наблюдались лишь в небольшом проценте мембран (около 20%), и интегральная проводимость не превышала ЮнСм. Событий, соответствующих одиночным липидным порам в таких мембранах не наблюдалось. Изменения проводимости имели вид хаотичного дрейфа (Рис. 19). То есть, проводящие дефекты не имели четко определенного размера, либо обладали очень коротким (менее 10 мкс) временем жизни.
При полном отсутствии лизолипидов и холестерина в мембранах, так же как и в случае когда мембрана сформирована только из них, проводимость не меняется, остается на уровне фона в течении всего эксперимента (30 мин.). Были построены гистограммы распределения пор по проводимости для составов, в которых они наблюдались (Рис.20). Видно, что вне зависимости от состава мембран,, поры имеют схожее распределение по проводимости с пиком в районе 0,6 нСм. Время жизни липидных пор в обоих случаях (30-30, 40-40) изменялось в широких пределах - от миллисекунд до десятков секунд. Среднее время жизни липидных пор составило 1,2±0,4 с и 7,0±1,8 с для смесей 30-30 и 40-40 соответственно. Частота формирования одиночных долгоживущих липидных пор в смесях 30-30 и 40-40 отличается незначительно и составляет 1,9 10"2 с"1 и 3 10"2 с 1 соответственно. Проводились так же эксперименты на мембранах с различным содержанием лизолипидов (15%) и холестерина (30%). Изменения проводимости, которые наблюдались в таких мембранах, не содержат событий, похожих на работу одиночных каналов.
Затухание активности со временем. Через 3-5 мин после начала регистрации ( то же время после формирования БЛМ) активности постепенно затухает, возвращаясь к фоновому уровню (Рис 15). В среднем, активность исчезает спустя 250с. Осно ным фактором, по всей видимости, является обмен с мениском - система мембрана-мениск находит более стабильное состояние. Однако, известно, что БЛМ могут проявлять активные свойства в течение длительного времени.
Таким образом, добавка базового липида к Л-Х смеси действительно приводит к активности - спонтанному формированию липидных пор. Активность связана с некоторой дестабилизацией БЛМ, по-видимому, за счет присутствия в мембране избытка свободного лизолипида (нескомпенсированного холестерином).
Как было показано ранее, из чистой Л-Х смеси (аналогичной используемой для формирования стабильной БЛМ) формируются стабильные липосомы. Однако, при добавлении фонового липида, липосомы не теряют содержимое, чего можно было бы ожидать, учитывая, что оценочный размер поры, наблюдаемой в БЛМ, достаточен для обеспечения выхода зонда. Таким образом, то, что содержимое липосом не выходит наружу может означать, что липидные поры не формируются, хотя липидный состав должен этому способствовать. Тем не менее, сравнение по площади липосом и БЛМ показывает, что ожидаемое количество липосом с порами крайне мало: БЛМ 1010 липидов, 10 пор на это кол-во липида; липосомы - 174нм, 3 1016 липидов, 5 104 липида на липосому, т.е. очень мало липосом с порой в единицу времени.
Для стимуляции порообразования решено было варьировать липидный состав липосом, так чтобы создать избыток липидов с ненулевой СК (дисбаланс СК). Как известно, такие липиды увеличивают вероятность формирования пор, но и дестабилизируют мембрану в целом. Однако, для липосом, имеющих меньшее чем у БЛМ латеральное натяжение мембраны, эффект дистабилизации должен быть выражен слабее. Для вариации липидного состава использовали метил-Р-циклодекстрин (ЦД) и бычий сывороточный альбумин (А). Циклодекстрин имеет циклическую структуру («бочонок» с полостью). Размер полости р-циклодекстрина таков, что он может образовывать водорастворимый комплекс с холестерином или жирными кислотами.
