Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Структура и функция тилакоидных мембран хлоропластов 8
1.2. Структурам функция пигмент-белковых комплексов хлоропластов 16
1.3. Реконструкция мембранных систем, содержащих пигмент-белковые комплексы 28
1.4. Свойства пбк, встроенных в искусственные липидные мембраны 31
1.5. Роль ионогенных групп на поверхности пбк в формировании поверхностных свойств мембран хлоропластов 35
Глава 2. Задачи исследования и методы их решения препаративные методы 40
2.1. Выделение хлоропластов 40
2.2. Использование аналитического дсн-электрофореза в полиакриламидном геле 40
2.3. Методика выделения пбк фотосистемы i и светособирающего ПБК 41
2.4. Встраивание пбк в липосомальные мембраны 43
2.5. Спектры поглощения 44
2.6. Спектры флуоресценции и ее возбуждения 45
2.7. Методы измерения кинетики тушения флуоресценции светособирающего пбк в присутствии пбк фотосистемы I . 46
2.8. Измерение спектров и кинетики светоиндуцированных измерений поглощения 47
2.9. Исследование поверхностных ионогенных групп пбк методом рн-зависимого изменения светорассеяния 47
2.10. Методы регистрации фотоиндуцированных изменений трансмембранного электрического потенциала 48
Глава 3. Свойства пигмент-белковых комплексов фотосистемы i /пбкі/ и светособирающего пигмент-белкового комплекса /ССК/ 52
3.1. Свойства светособирающего пигмент-белкового комплекса 53
3.2. Свойства пигмент-белкового комплекса фотосистемы 62
Глава 4. Исследование взаимодействия пбк и сск в безмембран ных ассоциатах 73
4.1. Исследование флуоресцентных свойств пбк в ассоциатах 74
4.2. Изучение ионогенных груш на поверхности пбк и их ассоциатов методом рн-индуцированного изменения светорассеяния 78
Глава 5. Исследование свойств пбк, встроенных в липосомальные мембраны 93
5.1. Встраивание светособирающего пигмент-белкового комплекса в липосомальную мембрану 94
5.2. Исследование свойств протеолипосом со встроенным пбкі 98
5.3. Исследование электрогенных свойств протеолипосом, содержащих совместно встроенные ПБКІ и сск И 7
Глава 6. Обсуждение результатов и заключение 123
Выводы 142
Список цитируемой литературы 144
- Реконструкция мембранных систем, содержащих пигмент-белковые комплексы
- Роль ионогенных групп на поверхности пбк в формировании поверхностных свойств мембран хлоропластов
- Использование аналитического дсн-электрофореза в полиакриламидном геле
- Свойства пигмент-белкового комплекса фотосистемы
Введение к работе
В последние десятилетия достигнуты существенные успехи в исследовании различных аспектов фотосинтеза, что позволило выяснить как в фотосинтезирующих организмах световая энергия последовательно поглощается пигментами, транспортируется к реакционным центрам, преобразуется в энергию разделенных зарядов и стабилизируется во времени для эффективного сопряжения с медленными биохимическими стадиями. Успехи препаративной биохимии в выделении ' макромолекулярных комплексов из фотосинтетических мембран хлоро-пластов и хроматофоров и в реконструкции отдельных участков исходных фотосинтетических мембран, позволили глубже понять молекулярную структуру тех образований, в которых протекают эти процессы, проследить тесные связи их с функцией фотосинтетического аппарата. В настоящее время известно, что в структуру мембран хлороплас-тов растений включены, по крайней мере, три основных пигмент-белковых комплекса: комплекс, содержащий реакционный центр фотосистемы I; комплекс, содержащий реакционный центр фотосистемы 2 и главный светособирающий комплекс
Непременным условием успешной реконструкции особенностей и отдельных свойств тилакоидных мембран является выделение пигмент-белковых комплексов в состоянии, максимально приближенном к их нативному состоянию. Таким образом, возможность получения модельных реконструированных систем тесным образом связана с исследованием специфических особенностей и характеристик ПБК. Воспроизведение определенных -свойств нативных фотосинтетических мембран позволяет получить новые данные о взаимодействии отдельных ПБК и миграции энергии электронного возбуждения между ними, о генерации трансмембранного потенциала и других особенностях организации и функционирования фотосинтетического аппарата.
Познание структуры и функций фотосинтетического аппарата имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
Работы в направлении создания модельных систем, способных к трансформации солнечной энергии являются необходимым этапом в разработке искусственных биотехнических систем, трансформирующих энергию света в энергию электрического трансмембранного потенциала.
Реконструкция мембранных систем, содержащих пигмент-белковые комплексы
Для создания искусственных мембранных систем, способных к генерации трасмембранного потенциала, необходимо соблюдение следующих условий: а) выделение внутримембранных комплексов в состоянии по возможнос ти близком к нативному. б) встраивание выделенных комплексов в искусственную мембрану бещ повреждения функциональных свойств белка. в) наличие методов регистрации трансмембранной разности потенциалов. Быделение ПБК хлоропластов высших растений в нативной конформа-ции - процесс достаточно сложный и пока еще полностью не отработанный, что в особенности, касается выделения ПБК ФС2 (Щутилова, Кутю-рип 1976, sat oh 1979, Гуляев, Тетенькин 1983). Однако для выделения ПЕКІ и CGK в последнее время разработаны ряд методик, позволяющих получать эти комплексы в состоянии близком к их состоянию в на-тивных фотосинтетических мембранах. Были предложены также критерии для оценки степени нативности таких комплексов (Гуляев, Тетенькин 1983). За последние несколькол лет были достигнуты также значительные успехи и в моделировании отдельных свойств тилакоидных мембран хлоропластов при встраивании ПБК в липосомальные мембраны. Используемые методы приготовления протеолипосом достаточно разнообразны: это удаление детергента из белок-липидной смеси даилизом через полупроницаемую целлофановую мембрану ( Kagawa Racicer 1971), инкубация при температуре превышающую температуру фазового перехода липида ( Hunter,Jones 1979, Eytan et ai 1976), обработка смеси ультразвуком ( Racicer 1975), замораживание - оттаивание ( vniegas et dI977), продавливание смеси через Френч пресс ( van Ginkei 1978), впрыскивание липидного раствора, в среду с белком featzri Кот 1973), сильное разбавление белок-липидной смеси, содержащей детергент, (Racker et al 1975), гель-фильтрация (вгштег et al I976,inoch,strittmater 1979), адсорбция детергента из смеси на колонке (Арчаков и др.1979, Ритов и др.1982). По-видимому, большая часть из перечисленных выше методов может быть пршенена для экспериментов по реконструкции и при встраивании ПЕК в липосошальную мембрану. Следует, однако, отметить, что опыт последних лет указывает на определенные преимущества в использовании собственных липидов хлоропластов для получения протеолипосом Larcura Anderson 1982;. Методы регистрации электрохимического потенциала на искусственных липидных мембранах были разработаны применительно к сопрягающшл мембранам митохондрии, хроматофоров и хлоропластов.
Так, фотоинду-цированное поглощение Н+ хроматофорами и хлоропластами было регистрировано ПО изменению ГН НезабуфереННЫХ Сред (Fowler , Кок 1976). Для доказательства существования трансмембранного элетрического поля, Либерманом Е.А. было предложено использование проникающих синтетических ионов (Либерман, Топалы 1969). Было показано, что освещение хроматофоров и субхлоропластных частиц сопровождается поглощением проникающих анионов, а выключение света вызывает их обратный выход (Grinius et ail972,isaev etai 1970). Наибольшей прони-кающей способностью обладают анионы тетрафенилбората (ТБ )} фенил-дикарба ндекаборана (ЖБ ) и катион трифенилметилфосфония (ТФФ+). Ионизированные группы в этих соединениях экранированы от взаимодействия с растворителями и противоионами, гидрофобными заместителями, благодаря чему такие вещества характеризуются высокой липофилъ-ностью. Кроме названных ионизированных соединений, для измерения разности электрических потенциалов широко применяются также флуоресцирующие соединения: анионы тиоционата (schuidiner,Avron 1974), анионы 8-анилинонафталин-1-сулъфоната (АНСГ ) (Кулене и др.1971). Применение таких флуорецентных зондов основано на изменении квантового выхода.флуоресценции при их переносе из водной среды в гидрофобную, что отчетливо регистрируется при накоплении красителя в толще сопрягающей мембраны при энергизации {ЫщщцрА Ъёрщм) 1980). К флуоресцентным зондам также относятся оксолоновые и циа-ниновые красители, которые несут заряд и изменяют параметры своей флуоресценции при высоких концентрациях вследствие образования агрегатов.
Гидрофобные диаониновые ("ваггонеровские") красители имеют делокализованный заряд, что позволяет им легко проникать через липидные мембраны (Sims,Waggoner 1974). Одним из лучших цианино-вых флуресцентных зондов является положительно заряженный Dis-C3-5 (Rethal.Lanji 1976), флуоресценция КОТОрОГО При взаимодействии с энергизованными мембранами тушится на 90$. Оксолоновые красители, также являются,., хорошими индикаторами мембранного потенциала, однако, в отличие от цианинов они изменяют свой коэффициент поглощения ( Bashford et ai 1979). При исследовании генерации АрН как в хлоропластах, так и в протеолипосомах, содержащих ПЕКІ, в качестве индикатора часто используются 9-аминоакри-дин и атебрин chuldiner eb a5972Fiolet et al 1974, Hauska 1980, Кузнецов; Кукушкин 1981).
Роль ионогенных групп на поверхности пбк в формировании поверхностных свойств мембран хлоропластов
В разделе I.I. литературного обзора уже указывалось на участие электрического заряда мембранных компонентов в ряде морфофизиоло-гических функций фотосгштетического аппарата (перераспределение поглощенной энергии мецду фотосистемами,катион зависимое слипание мембран). В последнее время появились работы, посвященные исследо-ванию связи мевду плотностью поверхностного заряда и величиной генерируемого на свету t±u Н+(Barber 1980,1981,1983). имеются указания на то, что определенную роль в стабилизации градиента рН играют протонные буферные системы тилакоидных мембран, которые могут быть представлены белковыми компонентами, прочно связанными с мембраной (Опанасенко и др.1880,1981). Кроме того, поверхностные заряды сильно влияют на взаимодействие белков внутри мембраны ( ВагЪег 1980).
При изучении электрических поверхностных свойств как целых тилакоидных мембран, хпоропластов нормальных мутантних растений, или химически модифицированных хлоропластов, так и отдельных белковых комплексов, обычно используют методы определения изоэлектрической точки (изофокусировка, Ш-зависимое светорассеяние), измерения плотности поверхностного заряда (микроэлектрофорез, светорассеяние) и ТИТрОВаНИЯ буферной еМКОСТИ. ( Yamamoto,Ke КЕ 1981, Nakatany et al 1978 akatany, Barber 1980, Berg et al 1974, Mercer et al 1955). В качестве модификаторов поверхностных свойств мембран используются карбодиимиды (связывающие различные белковые группы) лектины (связывающие углеводные компоненты), неорганические и органические катионы (якранирующие или нейтрализующие поверхностные заряды) (Ва вег 1980, 1982, Berg 1974,Mercer et al 1978, 1980).
Довольно многочисленными исследованиями показано, что при рН 4.3 внешняя поверхность мембран хлоропластов несет отрицательный заряд, плотность которого по расчетам Вагвег (1980а,б) составляет 2,5 мкК/cwr. Этот заряд принадлежит главным образом, поверхностно расположенным белковым участкам, а не липидным или углеводным компонентам мембран (Prohaska , Gross I975;DavisPross 1976, Nakatany БагЬеї980). Доказательством этому служат, в частности, данные по рН-зависимости электрофоретической подвижности, а также результаты по действию различных химических агентов (лектинов, зо-дорасстворимых карбодиимидов ) (Merc.gr et- aii955,Berg а1 1974, Nakatany et ai 1978) и относительно небольшое количество заряженных липидов в- составе фотосинтетических мембран ( Leech,Murphy 1976).
Удаление CFj С поверхности тилакоидной мембраны и исследование мутантних хлоропластов, лишенных ССК, показали, что эти два белковых комплекса практически не участвуют в формировании поверхностного заряда (Nakatany et ai ; 1978). Неучастие ССК в образовании отрицательного суммарного поверхностного заряда особенно удивительно, т.к. этот комплекс включает до 50/ мембранного белка хлоропластов (Гуляев и др.1979) и содержит также, как и другие внутритилакоидные белки? заряженные аминокислоты (Thombsr 1975). Таким образом, по-видимому,поверхностный , заряд хлоропластов в основном, формируется белковьми компонентами комплексов, участвующих в электронном транспорте - ІШКІ, ПЕК2 и цитохромным комплексом. К сожалению, в настоящее время в литературе отсутствуют сведения о поверхностных свойствах цитохромного комплекса.
Было показано, что относительная плотность электрических зарядов на поверхности различных ПЕК распределяется ТЕШІМ рбразом, что количество зарядов на поверхности ІІВК2 оказывается больше, чем на ПЕКІ (Mansfield et ai I982;Yamamoto Ke 1981). Однако установлено, что ассоциат комплексов, состоящий из ПЕК-2, связанного с ССК имеет на поверхности меньше отрицательных зарядов, чем ІЇЕКІ, т.е. наблюдается следующая закономерность распределения плотности Ke 1981). Эти данные хорошо согласуются с выводами из работы Chow et ai (1982) о том, агранальные участки тилакоидов, содержащие преимущественно ІШСІ, и имеют более высокую плотность зарядов в нейтральных рН, чем гранальные области, содержащие ПБК-2 и GCK. Исследование поверхностных свойств выделенных ПЕК позволило определить значения изоэлектрических точек (Таблица I): Таблица I: Значения изоэлектрических точек ПЕК-І и ПЕК-2.
Использование аналитического дсн-электрофореза в полиакриламидном геле
Аналитический ДСН-электрофорез в полігакриламидном геле использовали для определения кажущихся молекулярных весов и субьединич-ноії структуры ПЕК хлоропластов. Субъединичная структура ПЕК определялась после обработки исследуемых образцов 1% ДСП; О.Ш - меркаптоэтанолом и дальнейшего прогревания на водяной бане при температуре 80С в течение 4 минут. Молекулярные веса полипептидов определялись по методу Вебера и Осборна (Weber ,Osborn 1969). Для калибровки ДСН-полиакриламидного геля использовались следующие белковые "метчики": бычий сывороточный альбумин (дилер М.в.=136 кД), бычий сывороточный альбумин (мономер,L1.в. =68кД), яичный аяьбумин (М.в.=43 кД), химотрипсиноген (М.В.=25.7кД), трипсин (М.в.=23 кД), цитохром "с" (М.в.=12.4кД). В связи с чем, что хлорофилл-содерншщие электрофоретические зоны являются окрашенными, мы использовали для определения кажущихся молекулярных весов ПЕК калибровочные "метчики", предварительно окрашенные римазолом по Грифитцу (Griffith 1972).Белковые "метчики" (2мг в 0.2мл 0.І5Л хлористого натрия) смешивались с 0.05мл Ш Na2HP0 ,pH=9.2 и 0.05$ раствора римазола (10мг /мл в 10% (в/в ДСП). Образцы прогревались в течение Юмин. при 56С. Суммарная концентрация хлорофилла в образцах определялась по формуле: Судa+vjjB =27.8Dgg2» ГДЄ 652" оптическая плотность образца в 85$ ацетоне при Д = 652нм, концентрация белка в образцах определялась с использованием раствора Фолина по методу Лоури ( Lowry et al 1951). ПБК-І и ССК.
Для выделения ССК и ПЕКІ использовали проростки гороха сорта "Победитель", выращенного на простой воде в люминостате. Навеску листьев (примерно 100г) оставляли на ночь на холоду. Листья растирали пестиком в фарфоровой ступке в присутствии 25мМ натрий-калий- " " у фосфатного буфера (рН=7.0), содержащего 0,41/1 сахарозу, О.Ш хлористого натрия, ЗмМ хлористого магния. Полученный гомогенат затем фильтровали через 4 слоя капроновой ткани и последовательно центрифугировали при 1200 об/мин в течение 3 минут и при 5500 об/мин в течение 20 минут. Осадок, представляющий собой хло опласты и их фрагменты, суспендировали в МЛ растворе хлористого магния (концентрация хлорофилла составляла примерно 0.1 мг/мл) и оставляли перемешиваться на холоду на магнитной мешалке в течение 30 минут. Полученные таким образом шокированные хлоропласти осаждали центрифугированием при 5500 об/мин в течение 30 минут. Фрагменты мембран хлоропластоз растворяли на ледяной бане в течение 60 минут в Среде, содержащей 4.5% тритона Х-100. О.Ш хлористого натрия, 0.00Ш хлористого магния, 2СМЛ трис-НСІ буфера (рН=8.0). Смесь центрифугировали при 5000& в течение 20 минут, а затем при I44000g в течение 60 минут. Супернатаыт диализовали на колонке с Сеарозой 6В, уравновешенной 5омМ трис-НСІ буфера (рН=8.0), содержащим О.Ш хлристого натрия и 0.05% тритона Х-100. Затем отбирались высокомолекулярные фракции, максимально свободные от солтобилизированного хлорофилла, что контролировалось спектрально по положению главного красного максимума поглощения. К полученным препаратам добавляли сухой хлористый натрий до конечной концентрации 0.4М и оставляли на ночь в холодильнике (+4С) для преципитации. ССК осаждался центрифугированием при 5000с? в течение 20 минут, а супернатант пропускали через колонку (20x80мм) с гидрокснлаппатитом ( v колонки около 20мл), уравновешенной 50мМ трис-НСІ буфером (рН=8), содержащим О.БЛ хлористого натрия и 0,05% тритона Х-100 и промывали большим количеством того же буфера. ПБКІ снимали с колонки 0.0Ш калий фосфатным буфером в присутствии 0.05% тритона Х-100. Элюат ПЕКІ диализовали вновь на колонке с Сефарозой 6В. Высокомолекулярную фракцию, содержащую остаточные количества ХЛв, что -контролировалось спектрально, и низкомолекулярную фракцию, содержащую солюбилизированный хлорофилл, отбрасывали. Собранную после диализа на Сефарозе 6В фракцию пропускали через колонку (10x40мм) с гидрокснлаппатитом (объем колошш около 4мл) уравновешенную 5бмЭД трис-НСІ (рН=8.0),водеркащим О.Ш хлористого натрия и 0.05% тритона Х-100. После промывания колошей двумя объемами этого буферного раствора снимали фракцию, обогащенную Р700, с помощью 0.0Ш калий фосфатного буфера в присутствии 0.05% тритона Х-100. Для выделения большего количества ССК, наряду с вышеописанной использовали следующую методику:
Осадок после высокоскоростного центрифугирования (I44000g) промывали 5мМ раствором ЭДТА и растворяли в течение 90 минут в среде, состоящей из 0.4М сахарозы, 0.02М трис-НСІ (рН=8.0), О.ІмМ ЭДТА и 1% тритона Х-100 (концентрация хлорофилла I мг/мл). Далее суспензию центрифугировали 60 минут при I44000g , а полученный су-пернатант разбавляли в 10 раз О.ЗМ раствором хлористого натрия и оставляли на ночь для преципитации. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 2000g в течение 20 минут и суспендировали в среде с 20мМ трис-НСІ (рЫ=7.8), 0.02$ тритона Х-100. Денатурированные белки удаляли центрифугированием при 5000g в течение 60 минут, а к суперыатанту добавляли сухой хлорид натрия до О.ЗМ. Образующийся при этом осадок отделяли центрифугированием в течение 20 минут при 2000g ; переосаядение повторяли 2-3 раза. Полученный таким образом препарат представлял собой светособирающип пигмент-белковый комплекс. 2.4. ВСТРАИВАНИЕ ПЕК В ЛИПОСОМАЛЪНЫЕ МЕМБРАНЫ Для формирования искусственной липидной мембраны мы использовали азолектин - смесь фосфолипидов соевых бобов. Главными составляющими такой смеси фосфолипидов являются фосфатидилхолин и фосфа-тидил э таноламин.
Свойства пигмент-белкового комплекса фотосистемы
Из хлоропластов с помощью детергента тритона Х-100 с последующим за инкубацией высокоскоростными центрифугированием и хроматографией супернатанта на колонке с Сефарозой 6В и гидроксилаппатитом был выделен пигмент-белковый комплекс, характеризующийся фотохимической активностью фотосистемы I /см.методы/. На Рис.6 показан спектр фотоиндуцированнных изменений поглощения выделенного комплекса, который оказался аналогичным спектру нативнои фотосистемы I, Кинетика фотоиндуцированных изменений поглощения комплекса /Рис.7/ в отсутствии экзогенного донора электронов характеризуется быстрым выцветанием на свету и медленным восстановлением поглощения в темноте за время около минуты.
Присутствие донора электронов /восстановленного аскорбатом натрия ДХФШ/ увеличивало амплитуду фотовыцветания и скорость темнового восстановления Р+700. Увеличение сигнала свидетельствует о неполной восстановленности реакционных центров в выделенном ПБК-І, что может быть связано с частичным отсутствием компонентов донорного участка комплекса.
Комплекс обладал также характерным для Р+700 сигналом ЭПР, представленном на Рис.8. Зная концентрацию хлорофилла в образце и определяя с помощью фотоиндуцированного сигнала ЭПР концентрацию Р+700, мы рассчитали соотношение ХЛ/Р700,.которое оказалось равным 60-65. В присутствии восстановленного аскорбатом ФМС в суспензии ПБК регистрируются фотоиндуцированные изменения потенциала среды /Рис.9/. Эти редокс-изменения, как следует из ряда работ, например Верховский и др. /1980/, по-видимому, связаны с обратимым взаимодействием медиатора с реакционным центром ПБКІ. Как видно из Рис.8, на свету происходит быстрое окисление ФМС и, следовательно, увеличение редокс-по-тенциала среды, определяемое уровнем восстановленности медиатора. Выключение света приводит к уменьшению потенциала среды до исходного уровня вследствие восстановления редокс-медиатора /ШС/ от вторичных акцепторов фотосистемы I.
На следующей схеме представлено описанное выше редокс-взаимодействие ПБКІ с ФМС в окисленном и восстановленном состоянии:
Таким образом, выделенный нами ПБКІ обладал отчетливо выраженной фотохимической активностью. Исследование спектральных свойств ПБКІ показало, что максимум спектра поглощения комплекса при комнатной температуре в красной области локализуется около 681нм /Рис.Ю/. Положение главной полосы поглощения, а также характер ее длинноволнового склона свидетельствует об обогащении такого комплекса наиболее длинноволновыми формами ХЛа. Это особенно отчетливо проявляется в низкотемпературном спектре поглощения ПБКІ, структура которого в длинноволновой области /А 680нм/ совпадает со структурой спектра поглощения целых хлоропластов, измеренных при тех же условиях /Рис.Ю/. Инвертированная вторая производная низкотемпературного спектра поглощения /Рис.11/ позволяет более точно определить положение этих полос ХЛа и выяснить дополнительные минорные компоненты.
Сопоставление низкотемпературного спектра поглощения и его второй производной позволяет выявить следующие полосы поглощения, характерные для ПБКІ: 665нм, 671нм, 678нм, 682нм, 690нм, 702нм и 712нм. Следует подчеркнуть, что наиболее длинноволновые полосы поглощения 702нм и 712нм, характерные для целых систем, обычно не сохраняются в комплексе при других, относительно более "жестких методах выделения, .например, при ДСН-электрофорезе.
Таким образом, структура спектров поглощения, наличие лабильных длинноволновых компонентов, совпадающих по своим спектральным параметрам с аналогичными компонентами фотосинтетических мембран, характерные сигналы фотоиндуцированных изменений поглощения и сигналов ЭПР указывают на то, что выделенный ПБКІ находится в состоянии близком к его нативной конформации. На это указывают также и спектры флуоресценции ПБКІ, зарегистрированные при комнатной температуре и при температуре жидкого азота /77К/, которые представлены на Рис.12. При 293К основной в спектре флуоресценции комплекса является полоса около 694нм, с относительно низким квантовым выходом, составляющим
