Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пероксидное окисление липидов и антиоксидантная система организма человека. 11
1.1. Пероксидное окисление липидов в норме и при развитии патологического процесса 11
1.2. Роль антиоксидантной системы и отдельных ее компонентов в защите организма от активных форм кислорода и продуктов пероксидного окисления липидов 17
Глава 2. Особенности функционального состояния нейтрофилов в норме и при патологии . 34
Глава 3. Объекты и методы исследования 47
3.1. Объекты исследования 47
3.2. Выделение нейтрофилов из крови человека. 47
3.3. Определение качественного и количественного состава суспензии нейтрофильных лейкоцитов 48
3.4. Определение функциональной активности нейтрофилов методом люминол- и люцигенинзависимой хемилюминесценции 48
3.5. Получение супернатанта нейтрофилов 49
3.6. Определение функциональной активности миелопероксидазы; 49
3.7. Нагревание растворов пероксидазы 50
3.8. Облучение исследуемых образцов 50
3.9. Определение пероксидазной активности пероксидазы. 51
3.10. Регистрация спектров поглощения растворов пероксидазы. 52
3.11. Исследование гель - хроматографических свойств пероксидазы 52
3.12. Измерение буферной емкости и анализ кривых титрования 52
3.13. Определение каталазной активности пероксидазы 53
3.14. Определение оксидазнои активности пероксидазы. 54
3 1 5. Метод определения диеновых конъюгатов и кето диенов полиненасыщенных жирных кислот в крови 54
3.16 Метод определения восстановленного глутатиона в крови. 54
3.17. Метод определения активности глутатионпероксидазы в крови. 55
3:18. Метод определения активности глутатионредуктазы в крови. 57
3.19. Метод определения СОД-активности крови 58
3;20. Метод определения каталазной активности крови. 59
3.21. Статистическая обработка результатов экспериментов 60
Глава 4. Влияние температуры и УФ-света на структурно-функциональные свойства пероксидазы. 61
4: 1. Влияние температуры и-УФ-света на структурные свойства- пероксидазы и проявление пероксидазной активности. 63
4.2. Исследование влияния температуры и УФ-света на каталазную; активность пероксидазы 68
4.3. Оксидазная активность термомодифицированной пероксидазы 71
Глава 5. ВлияниеУФ-облученияна функциональную активность нейтрофилов крови доноров, содержание в ней продуктов пероксидного окисления липидов и состояние системы антиоксидантной защиты 74
5.1. Влияние УФ-света на состояние системы антиоксидантной защиты и уровень ПОЛ в крови доноров 76
5: 2. Действие УФ-света на функциональную активность нейтрофилов 84
Глава 6. Влияние гистамина на функциональные свойства нейтрофилов, уровень ПОЛ и состояние АОС в крови доноров 92
6.1". Влияние гистамина на функциональные свойства нейтрофилов крови доноров. 92
6.21 Влияние гистамина на уровень ПОЛ и состояние АОС в крови доноров 100
Глава 7. Влияние УФ-света и кваматела на функциональные свойства нейтрофилов, уровень ПОЛ и состояние антиоксидантной системы крови больных панкреатитом 104
7.1. Роль свободнорадикальных процессов в патогенезе острого панкреатита 104
7.2. Влияние УФ-света на функциональную активность нейтрофилов больных панкреатитом 109
7. 3. Исследование влияния УФ-облучения на показатели ПОЛ-АОС в крови больных панкреатитом 111
7.4. Применение кваматела для лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и панкреатита 117
7. 5. Влияние кваматела на функциональные свойства нейтрофилов в крови больных острым панкреатитом и ЯБ ДНК 119
Заключение 128
Выводы 133
Список литературы 135
- Роль антиоксидантной системы и отдельных ее компонентов в защите организма от активных форм кислорода и продуктов пероксидного окисления липидов
- Особенности функционального состояния нейтрофилов в норме и при патологии
- Определение качественного и количественного состава суспензии нейтрофильных лейкоцитов
- Исследование влияния температуры и УФ-света на каталазную; активность пероксидазы
Введение к работе
Актуальность темы. В изучении биофизико-биохимических механизмов, лежащих в основе сохранения гомеостаза, адаптивных реакций, снижения резистентности и і возникновения^ патологии важное место занимают процессы* пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и состояние антиоксидантной системы (АОС) организма в связи с их решающей ролью в регуляции структурно-функциональных свойств биологических мембран..
Окислительный гомеостаз - поддержание прооксидантно - антиоксидантного равновесия — является важным звеном гомеостаза вообще. К числу окислительных компонентов равновесия относятся Ог, 'Ог, Ог~, ОН, Н2О2, гидроперок-сиды, органические пероксиды, эпоксиды, легкоокисляющиеся субстраты (ненасыщенные липиды), окислительные ферменты и свободные ионы металлов с переменной валентностью. Антиоксидантными компонентами > равновесия -. являются ферменты AOG, жирорастворимые компоненты мембран (токоферолы, уби-хиноны, ретиноиды, фенольные соединения), водорастворимые низкомолекулярные антиоксиданты (тиоловые соединения, аскорбат, водорастворимые фенолы), ионы селена - свободные и в составе антиоксидантных ферментов.
В системе сохранения окислительно-восстановительного равновесия крови важную роль играют полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ), способные генерировать активные формы кислорода (АФК). Активация, фагоцитов и интенсификация ПОЛ—процессы, между которыми существует определенная і взаимосвязь, а именно: активация фагоцитоза, сопровождающаяся увеличением образования АФК, приводит к усилению ПОЛ, и, наоборот, продукты ПОЛ способны сенсибилизировать нейтрофилы (Ю.А. Владимиров с соавт., 1988; Г.И: Клебанов с соавт., .1988; Т.И. Клебанов с соавт., 1990). Активность ферментов АОС зависит как от уровня АФК, так и от содержания в крови продуктов ПОЛ (Н.Б. Поберезкина; Л.Ф. Осинская, 1989).
Известно, что в условиях воздействия различных физических и химических факторов наблюдаются изменения, как в активности нейтрофилов,\так и в интенсивности ПОЛ, которые определяют структурные перестройки мембран, и, еле-
довательно, переход клетки и организма из одного метаболического состояния в другое (Е.Б. Бурлакова, 1985, МИ. Рецкий; 1997 и др.).
Гистамин является ключевым медиатором воспалительного процесса, а УФ-свет находит в настоящее время широкое применение в лечении патологий различного генеза, несмотря на это, в литературе практически отсутствуют сведения о влиянии указанных факторов на такие ферментные системы ней-трофилов как НАДФН-оксидазная и миелопероксидазная, а также на уровень ПОЛ и состояние АОС в крови доноров.
Исследование участия і гистамина в биофизических и биохимических процессах важно для понимания гомеостатической природы воспаления, а, следовательно, для профилактики воспалительных заболеваний.
Изучение индуцированных УФ-светом изменений в активности нейтрофи-лов, уровне ПОЛ и состоянии АОС позволит выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе эффектов биологического действия УФ-излучения на ор-ганизменном уровне. Решение указанной проблемы является теоретической основой применения АУФОК в терапии ряда заболеваний и, таким образом, имеет большое значение для медицины.
Подобные исследования необходимы для разработки научно. обоснованных методов управления процессами j лежащими- в основе сохранения гомео-стаза, повышения резистентности щ на основе этого, профилактики и терапии наиболее распространенных заболеваний.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение биофизических механизмов поддержания окислительно-восстановительного го-меостаза в системе "активированные неитрофилы — уровень ПОЛ — состояние AOG крови" в норме и при действии УФ-света и химических факторов (гистамин; квамател).
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
1. Оценить вклад пероксидазы как отдельного компонента АОС в общую антиоксидантную защиту при поддержании окислительно- восстановительного гомеостаза организма.
Исследовать влияние УФ-света в диапазоне доз 75,5-7-1510 Дж/м на функциональную активность нейтрофилов, уровень ПОЛ и состояние АОС в крови доноров и больных острым панкреатитом.
Изучить влияние гистамина в концентрациях 10" -т-10" моль/л на окислительно-восстановительный гомеостаз крови доноров.
Изучить влияние кваматела* - блокатора Нг-рецепторов гистамина - на функциональную активность нейтрофилов, уровень ПОЛ и состояние АОС в крови больных острым панкреатитом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки.
Научная новизна. Впервые на примере системы "активированные нейтро-филы — уровень ПОЛ — состояние АОС" проведено комплексное исследование механизмов окислительно-восстановительного гомеостаза крови..
Установлена взаимосвязь. между термоиндуцированными структурными изменениями и проявлением пероксидазнои; каталазной; и оксидазнои видов; активности пероксидазы.
Исследовано влияние УФ-облучения в диапазоне доз 75,5 4-1510 Дж/м. на функциональную активность нейтрофилов, уровень ПОЛ и состояние АОС в крови доноров. Показана возможность взаимной функциональной компенсации НАДФН-оксидазы; и миелопероксидазы нейтрофилов доноров под влиянием УФ-света.
Обнаружена активация і НАДФН-оксидазы нейтрофилов доноров под влия-нием УФ-облучения терапевтического диапазона (75,5 Дж/м ), а также выявлено корригирующее действие УФ-света на* содержание; продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и кетодиенов), на каталазную и СОД-активность, активностьглута-тионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и - содержание; восстановленного глутатиона в крови доноров. Показано, что изменения в состоянии окислительно-восстановительного^ равновесия, возникающие под воздействием; УФ-облучения < крови при патологии (острый панкреатит), не приводят к нормализации изучаемых параметров, что обусловлено исходным дисбалансом между про-и антиоксидантными факторами в крови больных.
На основании полученных и литературных данных предложена схема процессов влияния г УФ-света1 на окислительно-восстановительное равновесие крови : и обсуждается возможный механизм терапевтического действия АУФОК.
Исследовано . влияние гистамина на функциональную і активность ней-трофилов, уровень ПОЛіи состояние; АОЄві крови доноров. Показана возможность взаимной функциональной компенсации -НАДФН-оксидазы и мие-лопероксидазы нейтрофилов доноров под действием гистамина.
Разработана схема; процессов участиям активированных нейтрофилов, ПОЛ и ферментов АОС в патогенезе острого; панкреатита; на основании которой можно судить об их роли в воспалении в целом.
Впервые проведено ? комплексное исследование: влияния ; кваматела s на ан-тиоксидантныш статус больных острым? панкреатитом; и язвенной: болезнью-двенадцатиперстнош кишки; Установлено, что эффективность препарата при указанных заболеваниях может быть. обусловлена; его влиянием' наї процессы элиминации АФК.
Практическая значимость. Научные; положения диссертационной! работы расширяют и? углубляют современные: представления; о биофизико-биохимических механизмах поддержания; окислительно-восстановительного равновесия крови в условиях воздействия физических и химических факторов.
Фотоиндуцированные изменения < в функциональном статусе нейтрофилов,. уровне ПОЛ; и активности ферментов АОС в крови доноров и больных острым \ панкреатитом: необходимо: учитывать, при обсуждению вопросов, касающихся і выяснения механизмов действия *УФ-света на уровне целого организма.
Разработанная схемаь событий; возникающих при УФ-облучении: крови и позволяющих поддерживать в ней окислительно-восстановительный гомеостаз, может быть,-полезна для\ понимания?молекулярных аспектов ^терапевтического действия метода АУФОК..
Материалы < исследований; с: использованием, гистамина ? и блокаторов: его рецепторов; вносят вклад в; понимание гомеостатическои і природы воспаления s и раскрывают, механизмы тонкой-регуляции организма в норме и;при патологии в ходе проведения фармакотерапии.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на VI Международной конференции "Циклы природы и общества" (Ставрополь, 1998), VII Международной конференции "Циклы природы и общества" (Ставрополь, 1999), III; Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (2003), 7-й Пу-щинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003), Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (2004)
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 8 печатных работах.
На защиту выносятся следующие положения: Г. Схема термоиндуцированных структурно-функциональных превращений; пероксидазы.
2. УФ-облучение крови; доноров (75,5 и 151 Дж/м) вызьшает активацию*
НАДФН-оксидазы нейтрофилов и оказывает корригирующее действие на дру
гие процессы генерации и элиминации активных метаболитов і кислорода; а,
следовательно, на окислительно-восстановительный гомеостаз крови в целом.
3. Схема процессов, происходящих в крови под действием УФ-облучения (75,5
и 151 Дж/м) и направленных на сохранение в ней окислительно-
восстановительного равновесия.
4. Эффект действия гистамина; (10" -МО" моль/л) на активность НАДФН-
оксидазы, миелопероксидазы нейтрофилов, показатели уровня ПОЛ и ак
тивности АОС в крови зависит от концентрации биогенного амина и инди
видуальных особенностей доноров.
5. Одной из важных составляющих гомеостатической природы воспаления яв
ляется способность гистамина путем регулирования содержания АФК корри
гировать в крови уровень ПОЛ.
Структура* диссертации. Диссертационная работа включает 158 страниц машинописного текста, 5 таблиц,' 47 рис. Состоит из введения, 7 глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 264 источника, из них 146 - отечественных и 118 - зарубежных.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль антиоксидантной системы и отдельных ее компонентов в защите организма от активных форм кислорода и продуктов пероксидного окисления липидов
Регулирование: уровня АФК и t свободнорадикальных продуктов ПОЛ і в \ организме осуществляется: сложной многокомпонентной саморегулирующейся антиоксидантной: системой (АОС), представленной ферментами: и низкомолекулярными антиоксидантами; осуществляющими связывание и; модифика-циюАФК, экранирование функциональных групп белков идругих биомолекул (Н.Н: Корниенко, Н.М; Титова и др., 2001; К.М. Oldham, Р.Е. Bowen, 1998). Ферментативные антиоксиданты характеризуются: высокой: специфичностью действия, а также клеточной и органной локализации. Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.11) - один; из важнейших ферментов АОС - катализирует реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала (J: McCord, I. Fridovich, 1969): У эукариот обнаружено несколько типов этого белка, различающихся локализацией, строением активного центра и некоторыми физико-химическими свойствами (S.V. Reddy, В. Venkaiah, 1988; I.N. Zelko et al., 2002). В цитозоле и примембранном пространстве клеток эукариот содержится чувствительная к цианиду Си, Zn-содержащая СОД: Молекула фермента, состоит из двух идентичных субъединиц с: молекулярной массой 16,3- кДа. На каждую молекулу белка приходится по два иона меди и цинка (J. McCord, .1:. Fridovich, 1969; А.Ф: Протас, П.П. Чаяло, 1993). Цианидрезистентная Мп-СОД локализована в митохондриях эукариот и найдена у прокариот. В плазме содержится цианидчувствительная экстрацеллюлярная СОД, представляющая собой Си, Zn-содержащую тетрамерную молекулу с Мг« 135 кДа,.состоящую из четырех гликопротеиновых субъединиц (Е.Е. Дубинина с соавт.,. 1986; I.N. Zelko et al., 2002). Субъединицы связаны нековалентно. При определенных условиях возможна диссоциация СОД на отдельные субъединицы, затем следует агрегация и повышение лабильности образовавшихся агрегационных комплексов, что сопровождается изменением биологической активности фермента (Е.Е. Дубинина с соавт., 1986).
Активность СОД плазмы крови намного ниже, чем у цитозольного фермента. По-видимому, это связано с накоплением в плазме конечного продукта? реакции — пероксида водорода, являющегося ингибитором фермента (S.L. Marklund,, 1985; В; Halliwellj J.M.C. Guttendge, 1986), а также с присутствием низкомолекулярных полипептидных соединений; подавляющих активность СОД (Е.Е. Дубинина; 1992). В ходе окислительного стресса наряду с конфор-мационными перестройками возможно также отщепление ингибиторных фрагментов от молекулы фермента и повышение его активности (Е.Е. Дубинина, 1993). Несмотря на высокую специфичность фермента, в определенных условиях (например, при; значительном повышении; рН) Cu,Zn-COfl может взаимодействовать с пероксидом водорода. и выступать в качестве: проокси-данта, инициируя образование радикалов 02 и ОН(МіА. Симонян, 1984; О.В: Kwon, ЛИ; Kang, 1999). Ионы Си в молекуле белка играют важную роль при катализе реакции дисмутации; a Zn имеет отношение к сохранению определенной конформации белка, необходимой для формирования реактивного медьсвязывающего участка (R.J; Carrico, H.F: Deutsch, 1970; L. Calabrese et al;, 1972). В J настоящее время постулируется многоцентровая модель; функционирования СОД (Б.С. Маринов с соавт., 1987; Н.В. Гуляева с соавт., 1989). Одновременное образование пероксида на внешнею поверхности молекулы, фермента и кислорода в активном центре осуществляется в результате дистанционного переноса электрона по белку от его активного центра к периферии. Наиболее вероятной представляется концепция эстафетной передачи электрона между боковыми; цепями: аминокислотных остатков (А.Б. Рубин, В.П. Шинкарев, 1984).
Величина активности ЄОД во многих случаях зависит от концентрации в тканях супероксидного радикала; который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора (М;А. Mishelson et al., 1983). Фермент проявляет активность в широком диапазоне рН: от 4,8 до 10,2 (Н.Б. Поберезкина, Л.Ф. Осинская, 1989). Активность супероксиддисмутазы ингибируется в присутствии высоких концентраций пероксида водорода (Е.А. Горбатенкова с соавт., 1988), гидро-пероксидных анионов (G. Whiteside, H.U. Hassan, 1988) и ионов гипохлорита (Б.П. Шаронов, И.В. Чурилова, 1990, 1992). В то же время многие соединения, содержащие сульфгидрильные группы (глутатион, цистеин и др.) способствуют повышению активности СОД (Н:Б. Поберезкина; Л.Ф. Осинская, 1989; Т. Hoshino et al., 1985). Супероксиддисмутазной активностью\ обладают также: железопор-фиринсодержащие белки (пероксидаза, каталаза, цитохромоксидаза, гемоглобин), некоторые медьсодержащие белки, участвующие в транспорте и утилизации ионов меди (церулоплазмин, трансферрин), а также соединения, содержа щие ионы меди и і других металлов (Н.Б. Поберезкина, Л.Ф. Осинская, 1989). Имеются также данные о том, что белки плазмы крови (альбумины, глобулины, гистоны) могут вызывать неферментативную дисмутацию супероксидного анион-радикала (Daisuke А., 1975) и торможение процесса образования иона гидро-ксила (В. Halliweli; J.M. Gutteridge, 1990). Наиболее важным высокоактивным метаболитом реакции- дисмутации супероксидных радикалов является пероксид водорода, образующийся помимо этого в больших количествах в результате биохимических реакций; протекающих в митохондриях, ЭПР, пероксисомах и в цитозоле клеток. В результате этих реакций в организме в целом образуется около 65% общего количества пероксида водорода,, который рассматривается в настоящее время как нормальный необходимый метаболит, участвующий в реализации различных физиологических функций организма (Л.Д; Лукьянова с со-авт., 1982). Наряду с этим пероксид водорода как сильный окислитель способен оказывать токсическое действие на клетки. Основную роль в предотвращении накопления пероксида водорода в организме играют ферменты, в первую очередь каталаза и различные пероксидазы.
Особенности функционального состояния нейтрофилов в норме и при патологии
Нейтрофилы составляют 65-70 % общего числа лейкоцитов. Клетки имеют диаметр 9-15 мкм. Форма живых нейтрофилов изменчива, т.к. они способны к амебоидному движению. Основные морфоструктурные характеристики; нейтрофилов - наличие в них цитоплазматических гранул и сегментарность ядра (А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский, 1983).
По современными представлениям, нейтрофильная зернистость состоит из гранул четырех основных типов: первичных (азурофильных), содержащих гидролитические ферменты, нейтральные протеиназы, миелопероксидазу и лизоцим (А.Н. Маянский, Д.Н: Маянский, 19 83; А.А. Славинский, 2002); вторичных (специфических), имеющих в составе коллагеназу, лизоцим, белок, связывающий витамин В12, лактоферрин; третичных гранул, содержащих N-ацетил-Р-глюкозаминидазу, катепсины, желатиназу (Н.И: Бахов с соавт., 1988; Н.М: Бережная, 1988; А.А. Славинский; 2002), а также секреторных пузырьков с щелочной фосфатазой (А.А. Славинский; 2002).
Созревание нейтрофилов в костноммозге сопряжено с динамикой морфологических изменений клеток. На стадии поздних миелобластов и промие-лоцитов в аппарате Гольджи ив системе: ЭПР происходит интенсивное образование первичных гранул, специфическим маркером)которых является МПО (А.Н. Маянский, Д.Н..Маянский, 1983). На стадии промиелоцита в клетке начинается формирование специфической зернистости (вторичных гранул), специфическими маркерами; которых:являются лактоферрин; и нейтрофильный липокалин, ассоциированный с желатиназой. Активность щелочной фосфата-зы,. вначале ошибочно отнесенная к: специфическим гранулам,. впоследствии была выявлена в мембранной фракции нейтрофилов (А.А. Славинский, 2002).
Покидая: костный мозг, нейтрофилы; являются полностью дифференцированными клетками;, имеющими полный спектр поверхностных рецепторов и цитоплазматических гранул с продуктами секреции (К. Yoshimura, 1992). Ключевую роль в процессах удаления нейтрофилов играет апоптоз, характеризующийся фрагментацией ДІЖ и вакуолизацией цитоплазмы (S.L. Newman et al.,1982;H;M. Бережная, 1988; А.Н; Маянский. с соавт., 1999).
Нейтрофилы в крови распределены между пристеночными и циркулирующими пулами, находящимися в динамическом равновесии/ (А.А. Тотолян, И.С. Фрейдлин, 1999). При воспалительном процессе пристеночный пул нейтро-филов резко увеличивается в месте воспаления (Н.И. Бахов с соавт., 1988).
В крови содержание палочкоядерных нейтрофилов — 40-300, сегментоя-дерных - 200-5500 кл/мкл. Повышение числа нейтрофилов — нейтрофилез, как правило, сочетается с увеличением общего числа лейкоцитов крови и наблюдается: при острых воспалительных процессах, интоксикациях, шоковых состояниях, при кровотечениях, инфаркте миокарда, гемолитическом кризе. Снижение числа нейтрофилов — нейтропения - обычно сопровождается лейкопенией и наблюдается при вирусных инфекциях, после приема некоторых медикаментов, после лучевой терапии (М.Г. Шафран, В.Е. Пигаревский, 1979).
В норме нейтрофилы находятся в циркуляции в неактивном состоянии. Их потенциальные возможности можно выявить только на фоне стимуляци-онных или депрессивных воздействий. Нейтрофилы высокочувствительны к широкому спектру агонистов, что делает их универсальными клеточными мишенями и клеточными; индикаторами любых тканевых изменений (А.Н. Маянский, Д!Н. Маянский, 1983).
Прямую стимуляцию клеток, кроме факторов плазмы, вызывают продукты окисления арахидоновой кислоты, медиаторы І лейкоцитов, бактерий. Наиболее яркие проявления . реактивности нейтрофилов — их способность быстро перестраивать метаболизм клетки в ответ на широкий спектр стимулирующих воздействий (респираторный взрыв — РВ), адгезия к разным субстратам, агрегация; миграция и хемокинез, интернализация корпускулярных частиц, фагоцитоз, и эндоцитоз, секреторная І дегрануляция и экзоцитоз, активация гуморальных каскадных систем организма и свойства, которые проявляют нейтрофилы при взаимодействии с другими типами клеток: бактерицидность и цитотоксичность. Разные формы реактивности нейтрофила обеспечиваются или, по крайней мере, инициируются обособленными механизмами и могут проявляться независимо друг от друга (А.Н. Маянский, А.Н. Галиуллин, 1984). Некоторые стимуляторы (КонА, формил-пептиды) показывают сильную зависимость от внеклеточного Са" , тогда как другие (иммунные комплексы, форболы) не зависят от него (Н.И. Бахов с соавт., 1988). На мембране нейтрофилов обнаружены структуры, рецеп-тирующие адренергические и холинергические агенты, гистамин, простаглан-дины, кортикостероиды и др. (А.Н. Маянский; Д.Н. Маянский, 1983). Все они определяют фармакологический профиль, то есть реактивность клетки к определенному набору функциональных модуляторов. Сигналы с разных рецепторов ; приводят к неодинаковым реакциям. Р-адренергическая стимуляция обработка гистамином, простагландином Е\ снижают интенсивность секреции; хо-линергические агенты, напротив, усиливают этот процесс. Экспрессия рецепторов, хотя она и имеет определенный стартовый уровень, может меняться в зависимости от задач, решаемых нейтрофилом в конкретной ситуации:
Общий признак, который сближает разные стимулирующие агенты - все они, так или иначе, реагируют с плазматической мембраной, меняя ее молекулярную топографию. Стимулирующий агент (внешний сигнал) вызывает кон-формационные изменения в структуре гомологичного рецептора плазматической мембраны, которые улавливаются инициирующим ферментом, входящим-в состав рецепторного узла. Один рецептор может быть связан с несколькими ферментами, а однотипные ферменты могут кооперироваться; с разными ре-цептирующими структурами. Взаимодействуя по принципу каскадного механизма, эктоферменты трансформируют реакцию плазматической мембраны в реакцию внутриклеточных посредников. Это конечное звено в системе медиаторов, которое: непосредственно выходит на эффекторые механизмы, обеспечивающие внешние проявления реакции нейтрофила.
Высвобождение преформированных биологически активных веществ составляет важнейший этап реализации» эффекторного потенциала зрелого нейтрофила. Дегрануляция может быть истинной, когда гранулы І целиком выталкиваются из клетки (экзоцитоз), но чаще происходит выделение только растворимых компонентов (Н.ИІ Бахов с соавт., 1988). Реакция зрелого нейтрофила на і раздражение во многом зависит от исходного состояния клетки. Гипо- и гиперреактивность нейтрофила-это ослабление или. усиление его способности к раздражению. Общее изменение реактивного потенциала клеток было названо "кондиционированием" (А.Н. Маянский, 1983). Возможны его позитивный (праймирование) и негативный (деактивация) варианты.
Определение качественного и количественного состава суспензии нейтрофильных лейкоцитов
Функциональный потенциал нейтрофилов раскрывается при их стимуляции, в результате которой развивается резкое усиление потребления кислорода клетками, и образуются активизированные метаболиты кислорода. Этот процесс: сопровождается І эмиссией света, хемилюминесценциейг (преимущественно в желто-зеленой области спектра). В-работе использовали "универсальный" хемилюминесцентныйзонд -люминол, реагирующий? с. 02 " Ог, Н2О2, ОН , ОСГ и г промежуточными І продуктами пероксидного окисления липидов, а также люцигенин, избирательно взаимодействующий с 02 (А.Н. Маянский; Д.Н: Маянский; 1983). Измерение ХЛ проводили на высокочувствительной фотометрической установке "Биохемилюминометр-06 MV! . С" этой цельюшолистиреновую кювету, содержащую нейтрофильные лейкоциты (1 мл, ,110 кл), помещали в измерительную камеру люминометра, затем в суспензию вводили «люминол (100 мкл, 2,510 моль/л)гили,люцигенин; (20?мкл, 2-10"4 моль/л) ив течение 40 секунд; проводили запись-, спонтанной хемилюминесценции.. После этого в І кювету добавляли стимулятор - латекс (10 мкл, 0,2 мг/мл) и регистрировали стимулированную ХЛі Измерение ХЛ-ответа нейтрофилов осуществлялишри постоянном перемешивании суспензии клеток и температуре 37 С Обработку данных проводили на компьютере IBM PC с использованием программы LUMOGRAF. Нейтрофильные лейкоциты вьщеляли из крови, как описано в разделе 3;2: Для; получения; супернатанта клетки; лизировали путем І смешивания г 1 мл; суспензии і нейтрофилов с двукратным объемом - дистиллированной воды, охлажденной до +4 С. Смесь оставлялив холодильнике на 30 мин, затем добавляли 0,6 мл холодного 3 %-го NaGl и центрифугировали при 3 00 0 об/мин в течение 40 мин для осаждения мембран. Супернатант отбирали из надосадочного слоя. Принцип? метод а основан на способности МПО окислять органические субстратьь в присутствии; пероксида водорода.
В данном методе вкачестве субстрата выступает о-фенилендиамин (М.Ж. Бакуев с соавт., 1991): Для проведения реакции готовили следующие реактивы: 1. Раствор о-фенилендиамина (7,4 10"3 моль/л), приготовленный на фосфат-цитратном буфере (0,1 моль/л, рН 6,0); 2. Раствор пероксида водорода (8,0 ммоль/л), приготовленный на фосфат-цитратном буфере (0,1 моль/л, рН 6,0); концентрацию Н202 контролировали 3. Субстратную смесь, состоящую из растворов № 1 и №2 в соотношении 1:1. В лунки плоскодонных полистироловых планшет вносили по 50 мкл су-пернатанта Нф, 100 мкл субстратной смеси и оставляли на 10 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 10 %-го раствора серной кислоты. За ходом реакции следили по росту оптической плотности при длине волны 492 нм, используя коэффициент молярной экс-тинкции продукта окисления о-фенилендиамина в фосфат-цитратном буфере, равный 1,78" 10 л-моль" см" (Л.Т. Рязанцева, 2002). Активность МПО рассчитывали по формуле: где Do - оптическая плотность в опытных лунках; DK - оптическая плотность в контрольных лунках (вместо образца вносили 50 мкл рабочего буфера); У0бщ - объем реакционной смеси; VBH - объем исследуемого образца; мл; t - время инкубации, мин; 1 - длина? оптического пути, 0,5 см; Є492 - коэффициент мо-лярной экстинкции продукта окисления о-фенилендиамина; 1,78 10 л-моль см 1; Шб - количество белка в пробе, мг. Растворы пероксидазы инкубировали в течение 30 минут в термостате UTU-4 при температурах 37, 40,45, 50, 55, 60 и 70 С. УФ - облучение исследуемых образцов проводили в стеклянной термо-статируемой кювете (20 С) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. В качестве источника излучения использовали ртутно- кварцевую лампу ДРТ-400. Расстояние от оси лампы до кюветы с образцом -23 см. Интенсивность облучения 151і Дж/м2 в 1 минуту, время облучения составляло 30 секунд, Г, 3,5, 10 минут, что соответствовало дозам 75, 151, 453, 755, 1510 Дж/м . Облучение образцов проводили через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания в области 240-390 нм.
Исследование влияния температуры и УФ-света на каталазную; активность пероксидазы
Нами была определена каталазная активность нативной и термомодифи-цированной пероксидазы. Исследование проявления данного типа активности при рН 6,0 и рН 6,7 показало эффективность использования для экспериментов значения рН 6,7, соответствующего оптимуму концентрации водородных ионов для функционирования каталазы. Было показано, что нативная пероксидаза проявляет незначительную каталазную активность (рис. 7). Воздействие температур в диапазоне 37-7-55 С влечет за собой исчезновение данного типа активности. Однако термомодификация при 60 С приводит к появлению каталазной активности, причем более высокой, чем у нативного фермента. Изучение зависимости каталазной активности пероксидазы от концен трации пероксида водорода показало сложные изменения изучаемого пара метра в диапазоне концентраций субстрата 10- 60 ммоль/л. Максимальная ка- талазная активность нативной пероксидазы наблюдается при концентрации пероксида водорода 15 ммоль/л, увеличение концентрации субстрата до 30 ммоль/л вызывает ее снижение. Каталазная активность термомодифициро- ванной при 60 С пероксидазы в диапазоне концентраций субстрата 15-И 5 ммоль/л достоверно не изменяется (рис. 7). При концентрации пероксида во дорода 10 и 60 ммоль/л ни у нативной, ни у термомодифицированной перок сидазы каталазная активность не выявляется. Таким образом, зарегистриро ванная нами зависимость каталазной активности пероксидазы от концентра- Р ции пероксида водорода носит сложный, многовекторный характер. Рис. 7. Каталазная активность нативной и модифицированной температурой пероксидазы в диапазоне концентраций пероксида водорода 15 -г-45 ммоль/л У термомодифицированного при 60 С раствора пероксидазы возрастает оптическая плотность (рис. 8) и кажущаяся молекулярная масса по сравнению с нативным ферментом.
Дополнительное облучение раствора фермента в дозе 151 Дж/м приводит к резкому увеличению оптической плотности. Дальнейшее облучение в дозах 453 и 1510 Дж/м" вызывает снижение исследуемого параметра, величина которого, однако, остается выше, чем у нативного фермента (рис. 8). Увеличение оптической плотности растворов термомодифицированной при 60 С пероксидазы по сравнению с нативным ферментом обусловлено разворачиванием белковой глобулы, что подтверждается изменением спектральных, буферных и гель-хроматографических свойств гембелка. Однако, если пероксидазная активность фермента после нагревания его растворов до температуры 60 С снижается, то в случае каталазной активности мы обнаруживаем противоположный эффект (рис.7). Более того, облучение в дозе 1510 Дж/м2 усиливает наблюдаемые изменения.
Т.о., мы показали, что процесс термоинактивации пероксидазы протекает в две последовательные стадии. На основании анализа функциональной активности, спектральных и буферных свойств пероксидазы установлено, что при температурах 20- 55 С происходят обратимые конформационные изменения моле- кулы гембелка, связанные с последовательным разворачиванием и сворачиванием белковой глобулы. Известно, что гемин в свободном состоянии в растворе способен проявлять достаточно высокую каталазную активность (Д.И; Метелица, 1984). Исходя из наших данных, можно предположить, что разворачивание молекулы пероксидазы под воздействием температуры;приводит к увеличению вклада гемина в каталазную активность пероксидазы, что связано с возможным ослаблением связей гем-белок и возрастанием доступности железопорфирина к, субстрату в результате термомодификаций фермента.
