Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается существенный прогресс в области молекулярно-биологических и генетических исследований бактерии Escherichia coli и других организмов. Клеточный метаболизм, включающий взаимопревращения тысяч молекул в виде катализируемых ферментами биохимических реакций, - очень активно изучаемая сейчас система. Для большинства биохимических путей в Е. coli известны все молекулы-метаболиты и стехиометрия их взаимопревращений, т.е. имеется так называемая статическая информация о последовательности реакций и о том, какие молекулы и в каких количествах в них участвуют. В данной ситуации может возникнуть иллюзия, что статической информации достаточно для предсказания функционирования биохимических путей при решении фундаментальных и прикладных (например, биоинженерных) задач. Отчасти, это действительно так - в некоторых случаях возможно сделать предсказания на основе только статической информации [Л1]. Однако, как правило, такой подход не оправдывает себя, поскольку внутриклеточные процессы определяются не только последовательностью реакций, но и регуляторными влияниями интермедиатов на ферменты, и генетической регуляцией уровней экспрессии ферментов, что позволяет клетке адаптироваться к изменениям внешней среды. Регуляторные механизмы в клетке ответственны за поддержание гомеостаза и переходы между различными физиологическими состояниями метаболизма. Вот почему крайне важно включать в модели регуляторные механизмы метаболических путей. Для построения таких моделей в данной работе был использован подход кинетического моделирования [Л2], который может быть, в частности, применен для изучения побочных эффектов лекарств. На основе данных по стехиометрии и регуляторным механизмам могут быть реконструированы внутриклеточные процессы, на которые
лекарство оказывает негативное действие. Как правило, лекарства имеют множественные эффекты на внутриклеточный метаболизм, например, несколько ферментов могут быть активированы или ингибированы, а также ряд ферментов может быть вовлечен в экскрецию лекарства. Проблема выявления главных и второстепенных механизмов токсического действия лекарств не может быть решена только экспериментально, т. к. анализ различных влияний требует их избирательного выключения, а это, как правило, невозможно сделать в эксперименте. Кинетическое моделирование позволяет исследовать каждый эффект в отдельности и понять, какой из них имеет больший вклад в общий побочный эффект. Цель данной работы заключалась в выявлении и описании с помощью кинетических моделей особенностей функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli.
Для достижения поставленной цели в рамках настоящей работы решались следующие основные задачи:
Разработать кинетические модели цикла Кребса митохондрии, потребляющей глутамат и малат, и Escherichia coli, растущей на ацетате аэробно, основанные на детальном описании функционирования отдельных ферментов.
Получить с помощью кинетических моделей цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli ответы системы на изменение внешних условий -энергетической и биосинтетической нагрузки клетки.
3. Промоделировать совместное и изолированное влияние отдельных
механизмов ингибирования салицилатом цикла Кребса для выявления
среди них критических и предложить способы восстановления
стационарной скорости в цикле Кребса, сниженной салицилатом.
4. Показать, возможно ли, объединяя в модели in vitro экспериментальные
данные из различных источников, описать измеренное in vivo
распределение потоков в цикле Кребса Е. coli, потребляющей ацетат как
источник углерода.
з Научная новизна. Впервые разработана кинетическая модель сегмента цикла Кребса митохондрии, который функционирует в состоянии повышенной активности митохондрий, на основе информации об отдельных ферментах. Значения кинетических параметров, входящих в уравнения скорости, оценены по in vitro литературным экспериментальным данным. Концентрации ферментов определены из экспериментальных данных по дыханию суспензии митохондрий на глутамате и манате. На модели изучены эффекты салицилата на энергетический метаболизм митохондрии. Было показано, что ингибирование сукцинатдегидрогеназы и а-кетоглутаратдегидрогеназы вносит существенный вклад в общее ингибирующее действие салицилата, тогда как разобщение окислительного фосфорилирования и потребление коэнзима А в реакциях трансформации салицилата незначительно влияют на скорость окисления субстратов в цикле Кребса. Модель позволяет предсказать, что заингибированный салицилатом поток в цикле Кребса может быть увеличен путем перераспределения потоков в цикле увеличением концентраций внемитохондриальных глутамата и малата и снижением концентраций внемитохондриального а-кетоглутарата и внутримитохондриального глицина. Разработана также детальная кинетическая модель цикла Кребса Escherichia coli, растущей на ацетате аэробно. На основе in vitro данных дано подробное описание функционирования и регуляции ферментов полного цикла Кребса и глиоксилатного шунта, учтена регуляция изоцитратдегидрогеназы путем фосфорилирования. С помощью модели показано, как будет изменяться распределение потоков между циклом Кребса и глиоксилатпым шунтом при изменении энергетической и биосинтетической активностей клетки. Практическое значение. С помощью построенной модели сегмента цикла Кребса митохондрии, функционирующей при повышенном энергопотреблении, изучено ингибирующее влияние салицилата на стационарный поток по циклу Кребса и предложены возможные способы
предотвращения его уменьшения. На модели цикла Кребса Escherichia coli показана возможность объединения in vitro экспериментальных данных по отдельным ферментам для описания поведения системы in vivo. Предложенный подход кинетического моделирования позволяет решать практические фармакологические (показать, как можно уменьшить токсические эффекты уже существующих лекарств, а также предсказать возможные побочные эффекты новых лекарственных веществ, которые находятся в стадии разработки) и биоинженерные задачи. Апробация работы. Результаты диссертации докладывались на 2 съезде токсикологов России (Москва, 2003), на 3 европейской конференции по вычислительной биологии (Глазго, 2004), на 11 и 12 международных конференциях по биотермокинетике (Оксфорд, 2004, Тракай, 2006), на 12 международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2005), на конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005).
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав исследований, заключения и списка литературы. Работа представляет собой рукопись на 166 страницах, включая 57 рисунков и 5 таблиц.
