Введение к работе
Актуальность проблемы. Трансляция последовательности мРНК в полипептидную цепочку, происходящая на рибосомах, является важнейшим этапом реализации генетической информации. Присоединение очередной аминокислоты определяется комплементарностью между кодоном мРНК и антикодоном тРНК. Однако же, высокую точность трансляции, реализуемую in vivo, не удается объяснить на основании простых физико-химических расчетов, исходя из энергий водородных связей между тринуклеотидами кодона мРНК и антикодона тРНК. Очевидно, что в процесс декодирования должны быть вовлечены дополнительные механизмы повышения точности отбора корректных кодон-антикодоновых комплексов в А сайте рибосомы. На настоящий момент хорошо изучены основные механизмы контроля декодирования, осуществляемые рибосомой, а также определены отвечающие за них структурные элементы. С другой стороны, имеются многочисленные указания на то что каноническая, эволюционно консервативная структура другого участника процесса декодирования -молекулы тРНК - также вносит существенный вклад в повышение специфичности кодон-антикодонового взаимодействия на рибосоме.
Наибольшее внимание в этой связи привлекает структура антикодоновой петли тРНК, характеризующаяся как асимметрией расположения пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, так и присутствием модифицированных нуклеотидов. Эксперименты in vivo, а также изучение кодон-антикодонового взаимодействия в простых модельных системах in vitro показали существенность наличия модифицированного основания с 3' стороны от антикодона для эффективности кодон-антикодонового взаимодействия.
Очевидно, что для дальнейшего понимания молекулярного механизма функционирования тРНК при декодировании генетической информации (и роли отдельных структурных элементов тРНК в этом процессе) необходимо систематическое количественное изучение взаимодействия тРНК с мРНК в декодирующем (А) сайте рибосомы в модельной системе, максимально приближенной к ситуации, реализуемой in vivo.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлись изучение молекулярных механизмов декодирования генетической информации на рибосоме на уровне взаимодействия дрожжевой фенилаланиновой тРНК с А сайтом 70S рибосомы E.coli и выявление роли модифицированного пурина в 37 положении тРНК в кодон-антикодоновом взаимодействии.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.
-
Получить препараты дрожжевой тРНКРИв с различными нуклеотидами в 37 положении путем транскрипции in vitro соответствующих генов на специально сконструированных плазмидах.
-
Изучить кинетические и термодинамические параметры кодон-антикодонового взаимодействия пептидил-тРНК с различными нуклеотидами в 37 положении с А сайтом 70S рибосом Е. coli.
-
Методами престационарной кинетики изучить модельное кодон-
j М>С НАЦИОНАЛЬНАЯ 1
3 І ІИБЛНОТЕКА |
»" » II «11« J
антикодоновое взаимодействие в растворе при отсутствии рибосом.
-
Изучить влияние аминогликозидного антибиотика паромомицина на взаимодействие пептидил-тРНК с А сайтом рибосом.
-
Методами престационарной кинетики изучить взаимодействие аминоацил-тРНК с А сайтом 70S рибосом. Исследовать влияние нуклеотида в 37 положении TPHKphe на кинетику реакций гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu и синтеза дипептида fMetPhe.
Научная новизна. Впервые исследована роль 37-го нуклеотида тРНК в кодон-антикодоновом взаимодействии в модельной системе [пепт-тРНК*А сайт 70S рибосомы] Измерены кинетические и равновесные константы кодон-антикодонового взаимодействия лепт-тРНК в А сайте рибосомного комплекса, определены его термодинамические параметры.
Впервые показано, что наличие пурина в положении 37 стабилизирует кодон-антикодоновое взаимодействие пепт-тРНК в А сайте рибосомы благодаря усилению стэкинг-взаимодействия. При этом установлено, что посттранскрипционная модификация пурина не вносит дополнительного вклада в энтальпию взаимодействия, т.е. не участвует в усилении стэкинга.
Впервые изучено влияние аминогликозидного антибиотика паромомицина на взаимодействие пепт-тРНК с А сайтом рибосомы.
Впервые установлено, что пепт-тРНК с различными нуклеотидами в 37 положении требуют привлечения разного количества ионов магния при образовании кодон-антикодонового комплекса с мРНК в А сайте рибосомы.
Для изучения престационарной кинетики взаимодействия двух тРНК с комплементарными антикодонами впервые применена методика остановленного потока. При этом показано, что для образования аналога кодон-антикодонового комплекса вне рибосомы привлечения дополнительных ионов магния не требуется.
Практическая значимость. Результаты работы дают существенно новую информацию для понимания механизма работы сложной молекулярной системы синтеза белка на рибосомах, также получены данные о механизме действия аминогликозидного антибиотика паромомицина. Полученные результаты могут быть использованы при интерпретации имеющихся в литературе данных рентгеноструктурного анализа бактериальных рибосом.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "tRNA 2000", 18th International tRNA Workshop, (Кембридж, Великобритания, 2000); 4-ой и 5-ой конференциях молодых ученых Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН, (Гатчина, 2003,2004); Международной конференции "RNA-2003", 8th Annual Meeting of the RNA Society (Вена, Австрия, 2003); Международной конференции "The tRNA World", 20th International tRNA Workshop (Банц, Германия, 2003); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Пуриновое основание в 37 положении тРНК стабилизирует связывание тРНК в А сайте рибосомы за счет усиления стэкинг-взаимодействия и вовлечения дополнительных ионов магния при формировании комплекса тРНК*рибосома.
-
Аминогликозидный антибиотик паромомицин значительно стабилизирует связывание тРНК в А сайте и устраняет зависимость сродства тРНК от концентрации ионов Мд2*.
-
Для кодон-антикодонового взаимодействия в растворе при отсутствии рибосом не характерна зависимость константы диссоциации от концентрации ионов Мд2*.
-
Природа 37 нуклеотида тРНК влияет на скорость гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu.
-
Применение химерных молекул тРНК с заменами 37 нуклеотида и модельной системы [пепт-тРНК*А сайт 70S] позволяет провести сравнительное изучение и количественно охарактеризовать вклад 37 нуклеотида тРНК в кодон-антикодоновое взаимодействие. Использованные методы престационарной кинетики позволяют определить константы скоростей реакций взаимодействия аа-тРНК с А сайтом и определить лимитирующую роль реакции гидролиза GTP для химерных видов тРНК9.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на
страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и
обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован рисунками и
таблицами. Библиографический указатель включает публикаций.
