Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА I. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РОСТА И СИНТЕЗА МЕТА
БОЛИТОВ МИКРОБНОЙ ПОПУЛЯЦИЕЙ . ; 10
1 Образование экзопродуктов микробными популяциями.... 10
2 Флуоресцирующие соединения в клеточном обмене веществ 21
3 Математическое описание взаимосвязи процессов накопле
ния биомассы и образования продукта метаболизма мик
робной популяцией 32
ГЛАВА II. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ РОСТОВЫХ
л- БИОСИНТЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МЖРОЕНЫХ
ПОПУЛЯЦИЙ 40
1 Анализ взаимосвязи удельных скоростей роста и синтеза целевого продукта при выращивании популяции на питательной среде лимитированной по одному элементу.. 40
2 Анализ взаимосвязи удельных скоростей роста и синтеза целевого продукта при выращивании популяции на питательной среде лимитированной по двум элементам... 57
3 ММ-системы и их применение для анализа взаимосвязи
ростовых и биосинтетических характеристик микроб
ных популяций 66
ГЛАВА III. ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МАТЕРИАЛЫ И
ПРЕПАРАТЫ 85
1 Аппаратура иметодьт культивирования. Измерение кон
центрации биомассы 85
2 Измерение спектральных характеристик клеточных сус
пензий и супернатанта 93
Стр. ГЛАВА ІУ. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ НАКОПЛЕНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО МЕТАБОЛИТА КУЛЬТУРОЙ E.COLI М-І7 В УСЛОВИЯХ
ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВЛРОВАНИЯ ІОІ
1 Спектральные характеристики супернатанта 101
2 Исследование кинетики накопления флуоресцирующего метаболита при культивировании Е.соІіїУЇ-І7 на питательных
средах с односубстратным лимитированием 109
3 /исследование кинетики накопления флуоресцирующего метаболита при культивировании E.coli M-I7 на питательных
средах, лимитированных по двум элементам питания 119
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ РАБОТЫ 132
СШСОК ЛИТЕРАТУРЫ 134
Введение к работе
стоящих перед современной микробиологией особенно в настоящее время, в связи с широким внедрением методов управления на основе вычислительной техники[82,83І.
Цель работы. I.Разработка математического описания и качественное исследование взаимосвязи ростовых и биосинтетических характеристик микробных популяций на примере E.coli M-I7 и синтезируемых ею метаболитов /веществ пиридиннуклеотидной природы и пиридоксина/ при одно- и двухфакторном влиянии состава питательной среды на рост и биосинтез.
Создание инструментальной базы для исследования кинетики накопления биомассы и флуоресцирующих метаболитов.
Исследование динамики накопления флуоресцирующих метаболитов при культивировании E.coli M-I7 на питательных средах определенного состава в лимитируемых по ряду элементов /Mg,P, H,S/ и их комбинациям /P,Mg ; Р,Ы; Мо ,Ы/ условиях.
Проверка адекватности математического описания наблюдаемым в эксперименте зависимостям между ростовыми и синтетическими характеристиками.
Основные задачи исследования. В задачу настоящего исследования входит:
Построение и качественное исследование математического описания взаимосвязи ростовых и биосинтетических характеристик микробных популяций при одно- и двухфакторном влиянии II0J.
Создание технического обеспечения эксперимента для получения кинетических кривых накопления биомассы и Флуоресцирующего метаболита 114,32,33,52І в процессе культивирования.
Экспериментальное исследование процесса накопления флуоресцирующих метаболитов в стрессовых ситуациях /при одно- и двухфакторных лимитированиях/!I]
Общая характеристика работы
Математическое описание, построенное на базе ММ-систем [l6\ определяет взаимосвязь таких физиологических характеристик микробной популяции как удельной скорости роста биомассы и удельной скорости синтеза продукта. Качественное исследование системы уравнений, описывающей эти характеристики, позволило построить трехмерный параметрический портрет системы и виявить области с качественно различным характером фазовых траекторий. Разработанный применительно к данному случаю аппарат М-представ-ления [Ю,53] позволяет получить аналитическое решение исследуемой системы уравнений, что может представлять определенный интерес при адаптивном управлении процессом культивирования.
Техническое обеспечение данной работы реализовано в виде специально разработанной проточной системы измерения оптической плотности бактериальной суспензии с широким динамическим диапазоном измеряемых оптических плотностей /0 f 20 Д/, а также в виде двухволнового проточного флуориметра, принцип действия которого основан на измерении отношения интенсивностей флуоресценции на двух длинах волн, что позволяет в ходе эксперимента фиксировать не только интенсивность флуоресценции, но и изменение положения максимума спектра флуоресценции. Применение данных приборов в исследовании значительно повысило точность получаемых результатов, сократило затраты ручного труда при проведении анализов, уменьшило вклад неконтролирумых погрешностей в процессе измерения.
Полученные с помощью технических средств данные при культивировании E.coli M-I7 в условиях лимитирования рядом неорганических элементов питания позволили выявить различный характер поведения зависимостей <\ (и) для случаев одно- и двухфактор-ных лимитирований, а также сверхсинтез веществ пиридоксалевой
природы при двухсубстратном лимитировании, когда одним из лимитирующих элементов был фосфор.
Сопоставление экспериментально полученных зависимостей как для метаболитов пиридиннуклеотидной, так и пиридоксалевой природы показывает, что математическое описание, предложенной в данной работе, качественно верно описывает взаимосвязь ростовых и синтетических характеристик популяции, что подтверждает правильность основных положений данного описания.
Научная новизна и основные результаты работы
Для исследования ростовых и синтетических характеристик популяции создана инструментальная база, позволяющая получить в реальном масштабе времени /в темпе эксперимента/ полную и точную информацию о накоплении биомассы и флуоресцирующего метаболита. Два из разработанных в составе комплекса аппаратуры устройства - пробоотборное и измеритель оптической плотности защищены авторскими свидетельствами и положительным решением / А.с. W 9ІЗІ2І, заявка № 2955128 от 14.07.80 ; А.с. № 991,230, заявка W 3303671 от 03.04.81. Положительное решение ВНИИГЛЭ от 28.06. 83 по заявке № 3476198/25 от 11.06.82/.
Предложенное математическое описание взаимосвязи удельных скоростей роста биомассы и синтеза продукта, построенное на основании ММ-систем, позволяет качественно верно описать характер взаимосвязи физиологических характеристик популяции-продуцента, таких как удельная скорость роста биомассы и удельная скорость синтеза целевого продукта. Данная модель удовлетворительно описывает взаимосвязь С^ и 14 как в случае выделения популяцией продукта в тропофазе, так и при синтезе вторичных метаболитов. Характерным отличием данного математического описания от существующих является его универсальный характер, а наличие структурного портрета системы позволяет из получающихся экспе-
риментальных данных оценить соотношение кинетических постояннных, определяющих характер протекающего процесса. ММ-представление, предложенное в рамках данной модели, позволяет расширить область применения данного описания на широкий класс биологических объектов, а также использовать его при решении задач управления /в т.ч. и адаптивного/.
Исследование динамики накопления метаболита пиридиннуклео-тидной природы в культуральной суспензии при выращивании Е.соЗд M-I7 в периодических условиях выявило зависимость синтеза этих соединений от условий культивирования.
Имеющаяся корреляционная связь между ростом биомассы и интенсивностью флуоресценции позволяет использовать флуоресценцию суспензии для оценки концентрации биомассы кулвзтуры в широком диапазоне оптических плотностей /0 * 5 Д/. При культивировании E.coli M-I7 на питательных средах, лимитированных по двум элементам питания - Р, N и Р,Мо , обнаружен сверхсинтез культурой веществ пиридоксалевой природы /концентрация пиридоксина достигает 20 мг/л/. До настоящего времени в научной литературе информация по данному вопросу отсутстует.
Практическое внедрение. На базе Научно-исследовательского Центра автоматизации /НИЦ биоавтоматика/ налажено производство составных элементов устройства для кинетического измерения характеристик роста, которые включены в состав серийно выпускаемых систем для культивирования микроорганизмов: "Шермус-3" /про-боотборное устройство/ и "Фермус-4" /проточный измеритель оптической плотности/ с объемом выпуска 15 единиц в год.
Математическое описание используется в автоматизированной биотехнологической системе "Автоферм-2". Результаты исследования, а также аппаратура используется в научно-исследовательской работе сотрудников НИЦ биоавтоматика.
Связь работы с целевыми комплексными программами Работа выполнена в связи с целевой комплексной научно-технической программой 0.Ц.027 /тема-задание 06.19/, утвержденной ГКНТ СМ СССР, Госпланом СССР и АН СССР /постановление № 474/250/132 от 12 декабря 1980 г./.
Автор защищает следующие положения:
Математическое описание взаимосвязи ростовых и синтетических характеристик микробной популяции-продуцента.
Аппаратурное оформление метода исследования кинетических характеристик популяции-продуцента.
Результаты экспериментальных исследований кинетики накопления биомассы Е.соК M-I7 и флуоресцирующих метаболитов
в процессе периодического культивирования.
