Введение к работе
Актуальность темы. Исследование механизмов гибели клетки является одной из актуальных проблем биофизики. Несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор остаются не выясненными многие механизмы этого явления, в частности, не до конца понятны механизмы регуляции гибели отдельных клеток в целостном многоклеточном организме (Фильченко А.А., Стойка Р.С., 1999). Актуальность этой проблемы определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса запрограммированной гибели клетки с большинством заболеваний. Выявление конкретных механизмов нарушения регуляции клеточной гибели, сопровождающих конкретные заболевания, позволит определить этиологию и патогенез данных заболеваний. Детерминация гибели клеток и ее регуляция – одна из центральных проблем биологии клетки (Уманский С.Р., 1996; Abastado J.-P., 1996; Prins J.B. et al., 1994, 1997; Білий Р. О., Стойка Б. Р., Стойка Р. С., 2002).
В последние годы в биофизике успешно развиваются новые методы исследования человеческих тканей и органов, основанные на хорошо контролируемом по температуре, времени и пространству нагреве. С этой точки зрения особый интерес представляет жировая ткань. Так, например, жировая ткань характеризуется достаточно низкой температурой плавления, близкой к физиологической, что может значительно повлиять на динамику поведения тканей, имеющих жировые накопления. При нагреве от 24С до 45С жировая ткань претерпевает несколько фазовых переходов. Фазовые превращения “кристаллическая фаза – жидкость” в адипоцитах человека протекают в широком диапазоне температур, что связано с многокомпонентностью запасённого жира (Garti N., Sato K., 1988).
Одной из важных проблем современной медицины и, косметологии в частности, является исследование способов физического воздействия на жировые клетки с целью их разрушения. Одним из самых простых, но эффективных способов физического воздействия на жировые клетки, является гипертермия (Prins J.B., Walker N.I. et al., 1994), эффективность которой можно усилить с помощью биоактивных веществ.
В настоящее время в качестве гистохимических реагентов большое внимание уделяется использованию лектинов. Это позволяет эффективно проводить селективное гистохимическое маркирование отдельных типов и популяций клеток, тканевых структур, а также осуществлять управление биохимическими процессами в клетках, в частности вызывать апоптоз (Bilyy R., Stoika R., 2003; Porras F. et al., 2000; Антонюк Л.П., Игнатов В.В., 2001; Лахтин В.М., 1987; Луцик М.Д., Кусень С.И., 1987; Никитина В.Е. и соавт., 1998; Франц Х., 1980).
Анализ литературы показывает, что проблема управления процессами гибели адипоцитов еще очень далека от своего решения. Например, недостаточно полно изучены механизмы повреждения жировых клеток при воздействии физических факторов и биологически активных веществ. Всё это не позволяет пока однозначно осуществить выбор внешнего фактора, активного вещества и предсказать результаты этих воздействий на биоткань. Таким образом, возникает потребность проведения исследований, направленных на определение морфологических изменений в адипоцитах, механизма гибели жировой ткани под воздействием физических (нагрев, ИК излучение) и биохимических факторов.
В данной работе в качестве физических факторов выбрано тепловое воздействие (гипертермия), вызванная контактным нагревом или нагревом ИК лазерным излучением; в качестве биологически активных агентов выбраны нетоксичные фукозоспецифичные лектины Azospirillum brasilense Sp7 и Laburnum anagyroides.
Целью данной работы явилось комплексное изучение морфологических изменений адипоцитов жировой ткани человека и механизмов их гибели в условиях гипертермического воздействия, анализ участия лектинов в регуляции клеточной гибели адипоцитов человека, склонного к ожирению в норме и при патологии сахарного диабета, а также исследование динамики гибели адипоцитов в условиях ИК (805 нм) лазерного нагрева.
В рамках работы решались следующие задачи:
изучение морфологических изменений при гипертермии в адипоцитах жировой ткани человека в норме и при патологии;
разработка методики воздействия лектинов на жировые клетки;
изучение влияния лектинов на процесс гибели адипоцитов при гипертермии;
исследование влияния углеводной специфичности лектина азоспирилл на структурные изменения в адипоцитах при нагреве;
анализ морфологических изменений адипоцитов при ИК лазерном воздействии;
изучение процесса гибели жировых клеток в условиях действия лектина азоспирилл и ИК лазерного излучения.
Научная новизна работы
-
-
Исследована динамика гибели адипоцитов жировой ткани человека при нагреве в диапазоне физиологической гипертермии и при ИК лазерном воздействии.
-
Впервые изучено действие фукозоспецифичных лектинов Azospirillum brasilense Sp7 и Laburnum anagyroides на жировую ткань. Установлено, что лектины при нагреве оказывало разное влияние на адипоциты жировой ткани. Растительный лектин Laburnum anagyroides не оказывал влияния на гибель клеток, в то время как лектин бактерий рода Azospirillum brasilense Sp7 активировал скорость гибели клеток.
-
Впервые на примере жировой ткани показано, что лектин азоспирилл в совокупности с нагревом ((43,5±0,5)0C) активирует клеточную гибель.
-
Показано, что углеводсвязывающий центр лектина азоспирилл принимает участие в его воздействии на клетки жировой ткани человека. Однако влияние лектина характеризуется не только специфическим, но и не специфическим воздействием на адипоциты, поскольку и с заблокированным активным центром лектин продолжает оказывать влияние на адипоциты, хотя и менее выраженное.
-
Впервые рассмотрена динамика гибели адипоцитов жировой ткани людей с нормальной массой тела, склонных к ожирению и больных сахарным диабетом.
Практическая значимость
Проведенные исследования процесса гибели адипоцитов при комбинированном внешнем воздействии позволяет подвести теоретическую базу для разработки эффективных методов коррекции жировой массы, борьбы с опухолевыми новообразованиями, для выяснения механизма клеточной гибели (апоптоз или некроз).
Исследования изменения структуры адипоцитов в условиях внешнего воздействия (контактный и лазерный нагрев), а также влияние биологического фактора (лектина) на гибель адипоцитов в норме и при патологии, существенно расширяют возможности диагностики и дифференциации патологий жировой ткани по характеру гибели адипоцитов и открывают новые возможности для изучения мембраны жировых клеток.
Достоверность результатов
Достоверность полученных результатов обеспечивается адекватностью используемых методов измерения, обработки и анализа экспериментальных данных. Результаты проведенных исследований подвергались статистической обработке общепринятыми методами с использованием t-критерия Стьюдента, достоверными считали различия при р0,05. Все оригинальные результаты воспроизводятся при повторении экспериментов.
Основные результаты и положения, выносимые на защиту
-
При нагреве до температуры (43,5±0,5)0C возникают морфологические признаки апоптоза у адипоцитов здорового человека с нормальной массой тела и некроза у жировых клеток человека с нормальной массой тела и патологией сахарного диабета. Время гибели клеток здорового человека примерно в 2 раза меньше, чем время гибели адипоцитов людей с нормальной массой тела и патологией сахарного диабета.
-
В условиях комбинированного воздействия лектина азоспирилл и нагрева до температуры (43,5±0,5)0C ускоряется процесс гибели клеток жировой ткани, как здоровых, так и больных сахарным диабетом людей СКО, при этом воздействие лектина азоспирилл характеризуется не только специфическим, но и не специфическим воздействием на адипоциты, поскольку и с заблокированным активным центром данный лектин продолжает оказывать влияние на адипоциты.
-
Нагрев адипоцитов ИК лазерным излучением до температуры (40,5±0,5)0C приводит к увеличению скорости гибели клеток в 2 раза по сравнению с контактным нагревом.
Апробация работы
Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих международных конференциях: II международная научная молодежная школа “Оптика – 2002” (С.-Петербург, октябрь 2002); “Saratov Fall Meeting: International School on Optics, Laser Physics & Biophysics” (Саратов, октябрь 2002, 2003, сентябрь 2004, 2005, 2006); II International Conference “Laser Optics for young Scientists 2003” (С.-Петербург, июнь 2003); III международная конференция молодых ученых и специалистов “Оптика – 2003” (С.-Петербург, октябрь 2003); IV международная конференция молодых ученых и специалистов “Оптика – 2005” (С.-Петербург, октябрь 2005); Международная научно-практическая конференция “Современная техника и технологии в медицине, биологии и экологии” (Новочеркасск, декабрь 2003); Пироговская студенческая научная конференция (Москва, март 2004, 2005, 2006, 2007); X Всероссийская научная конференция студентов-физиков и молодых учёных “ВНКСФ-10” (Москва, апрель 2004); международная научно-техническая конференция “Наука и образование – 2004” (Мурманск, апрель 2004); IV Международная научно-практическая конференция “Медицинская экология” (Пенза, июнь 2005); V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа “Химия и медицина” (Уфа, сентябрь 2005 г); 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученных “Биология – наука XXI века” (Пущино, апрель 2006 г.); Всероссийская конференция с международным участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, сентябрь 2007 г.).
Исследования, проводимые по теме диссертации, выполнялись в рамках грантов: грант РФФИ “Ведущие научные школы” № 00-15-96667 2000-2002 гг. (руководитель – профессор В.В. Тучин); международный грант CRDF № REC-006 2000-2003 гг.; грант Мин. образования РФ “Ведущие научно-образовательные коллективы” № 01.2003.15221; грант президента РФ “Поддержка научных школ” № 25.2003.2.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 работ (5 статей в рецензируемых журналах, 15 статей в научных сборниках, 2 статьи в сборнике тезисов докладов конференций).
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя состоит в самостоятельной постановке и проведении экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Постановка исследовательских задач осуществлялась профессором, д. ф.-м. н. Тучиным В. В. Исследования с лектинами проводили совместно с к.б.н. Е. Г. Пономарёвой и д.б.н. В.Е. Никитиной (ИБФРМ РАН, Саратов). Исследование по воздействию температурного фактора проводили совместно с к. ф.-м. н. Г. В. Симоненко.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы из 357 наименований. Работа изложена на 168 страницах, иллюстрирована 93 рисунками, из них 50 фотографии.
Похожие диссертации на Исследование динамики гибели адипоцитов при гипертермии и воздействии лектинов
-
