Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1. Современное состояние экспертизы прижизненное и давности возникновения механической травмы 10
1.2. Метод ЭПР и его применение в медико-биологических исследованиях 23
1.3. ЭПР спектроскопия как один из методов диагностики в практической медицине 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований.
2.1. Экспериментальное исследование 32
2.2. Исследование экспертных случаев 35
2.3. Методы приготовления и анализа биологического материала 44
2.4. Метод ЭПР спектроскопии для решения задач судебно-медицинской экспертизы 2.4.1. Аппаратура 50
2.4.2. Метод спиновых зондов 53
2.4.3. Возможность использования метода спинового зонда для установления прижизненное и давности механической травмы 55
2.4.4. Выбор параметра для оценки состояния тканей 63
2.4.5. Приготовление препаратов для ЭПР спектроскопии 67
2.5. Математическая обработка результатов измерений 73
ГЛАВА 3. Восстановительные процессы в прижизненно травмированных тканях и посмертные процессы в переживающих тканях
3.1. Восстановительные процессы в прижизненно травмированных тканях 74
3.2. Посмертные процессы в переживающих тканях определение прижизненности и давности возникновения механической травмы методом эпр в различные сроки постмортального периода .
ГЛАВА 4. Определение прижизненности и давности возникновения механической травмы на этапе постмортального периода до одной недели 113
4.1. Установление возникновения механической травмы по крови 11З
4.2.Установление возникновения механической травмы по костному мозгу 125
4.3. Установление возникновения механической травмы с использованием печени 131
4.4. Установление возникновения механической травмы с использованием головного мозга 135
4.5. Установление прижизненности и давности механической травмы по крупным кровеносным сосудам 138
4.6. Установление возникновения механической травмы с использованием скелетных мышц 141
ГЛАВА 5. Определение прижизненное и давности возникновения механической травмы на этапе постмортального периода от недели до месяца 143
5.1. Установление возникновения механической травмы по крови 143
5.2. Установление возникновения механической травмы по костному мозгу 146
5.3. Установление прижизненное и давности механической повреждений крупных кровеносных сосудов 149
5.4. Установление возникновения травмы с использованием миокарда 153
5.5. Установление наступления травмы с использованием тканей мышц 154
5.6. Установление возникновения травмы с использованием тканей из области перелома 156
ГЛАВА 6. Определение прижизненности и давности возникновения механической травмы на отдалённых этапах постмортального периода от месяца до года 161
6.1. Установление прижизненности и давности механических повреждений крупных кровеносных сосудов 161
6.2. Установление наступления механической травмы с использованием языка 163
6.3. Установление наступления механической травмы с использованием миокарда 167
6.4. Установление прижизненности и давности наступления механической травмы с использованием скелетных мышц 172
6.5. Установление прижизненности возникновения механической травмы с использованием мышц из области перелома 177
6.6. Установление возникновения механической травмы по костному мозгу 181
ГЛАВА 7. Влияние экзогенных и эндогенных факторов на установление прижизненное и давности травмы с учётом постмортального периода 184
Заключение 195
Выводы 217
Практические рекомендации 221
Указатель литературы
- Метод ЭПР и его применение в медико-биологических исследованиях
- Метод ЭПР спектроскопии для решения задач судебно-медицинской экспертизы 2.4.1. Аппаратура
- Посмертные процессы в переживающих тканях определение прижизненности и давности возникновения механической травмы методом эпр в различные сроки постмортального периода
- Установление возникновения механической травмы с использованием печени
Метод ЭПР и его применение в медико-биологических исследованиях
В качестве иллюстрации успешного применения ЭПР в медико-биологических исследованиях приводим ряд работ преимущественно выполненных при участии самого автора (Резникова И.И.).
Взаимодействию стероидных гормонов с плазматическими мембранами методом спиновых зондов и меток были посвящены работы И.И. Резникова с соавт. (1977,1978, 1980). Действие стероидных гормонов (гидрокортизона, кор-тикостерона, кортизона, дезоксикортикостерона, тестостерона, эстриола, эстра-диола и эстрона) на плазматические мембраны эритроцитов и гепатоцитов исследовали в интервале температур - 4-55С и рН - 4-Ю. Проведенные исследования позволили обнаружить хорошо выраженный термоиндуцированный кон-формационный переход в области температур 37 - 38С, который может быть связан с фазовым переходом липидов мембран. Изменение рН среды, содержащей биологические мембраны, приводило к значительному изменению «частоты» (v) вращательной диффузии спиновых меток парахлормеркурийбензоата и малеимидной внедрённых в мембраны, причем максимум кривой зависимости Igv от рН соответствовал изоэлектрической области мембранных белков. При введении стероидных гормонов в содержащие мембраны буферные растворы было обнаружено изменение «частоты» вращательной диффузии спиновых меток ковалентно связанных с SH-группами белков мембран при концентрациях гормонов выше 10" М. Влияние названных стероидных гормонов на «частоту» вращательной диффузии гидрофобных спиновых зондов, введенных в липид-ную часть мембран, было несущественным. Стероидные гормоны также не оказывали существенного влияния на термоиндуцированные и рН-зависимые кон-формационные переходы. Нами /Толвинская Л.С., Резников И.И. с соавт., 1983; Резников И.И. с со-авт., 1989/ исследовалось методом ЭПР (с использованием спиновой метки -парахлормеркурийбензоата) взаимодействие эндогенного иммунодепрессивно-го фактора (ЭИФ) - лимфоцитарного фактора печени - с плазматическими мембранами тимоцитов. Применённый метод позволял в течение нескольких минут оценивать активность ЭИФ. Анализ полученных спектров ЭПР показал, что препарат преимущественно связывается с белками, ассоциированными с плазматическими мембранами клеток. С целью оценки возможности использования данного подхода для экспресс-тестирования активности ЭИФ параллельно изучали влияние этих же образцов на число антителобразующих клеток в селезёнках мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Полученные результаты указывают, что иммунодепрессивная активность биогенного фактора in vivo находится в прямой зависимости от интенсивности связывания меченого фактора с тимоцитами.
Нами /Солопов В.Н., Резников И.И., Чучалин А.Г., 1988/ определялась концентрация свободных сульфгидрильных групп в мокроте у больных хроническими неспецифическими заболеваниями лёгких (ХНЗЛ). Динамика содержания в мокроте сульфгидрильных групп, по нашим данным, отражала эффективность проводимой терапии и темпы достижения ремиссии. Содержание сульфгидрильных групп в мокроте больных определяли методом титрования при помощи ртутной спиновой метки — 4-хлормеркур-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил, растворенной в спирте, до появления сигнала свободной метки регистрируемого на радиоспектрометре ЭПР. При определении содержания сульфгидрильных групп в мокроте у больных бронхиальной астмой и сопутствующим хроническим бронхитом до и после лечения выявле 27 но их нарастание в фазе ремиссии. Содержание SH-грунп в мокроте больных в фазе обострения составило от 10" до 0,5»10"5 моль/л, в фазе ремиссии - от 0.4«10-5до Ю-4 (в среднем 0,89±0,06-1(Г5) моль/л. Анализ данных литературы и собственных результатов свидетельствовал о наличии СИНХРОННОЙ динамики содержания сульфгидрильных групп в слизистой оболочке бронхов и бронхиальном содержимом что давало возможность высказать предположение о «пришивании» дисульфидными связями молекул гликопротеинов слизи к поврежденной стенке бронха. Это подтверждалось и тем, что у наблюдавшихся больных с выраженной обструкцией дыхательных путей слизью непродуктивным кашлем у которых были неэсЬ(Ьективны отхаркивающие средства удалось вызвать обильное отхождение мокроты внутривенным введением унитиола причем предыдущее ингаляционное введение его не давало эсЬсЬекта
Метод ЭПР спектроскопии для решения задач судебно-медицинской экспертизы 2.4.1. Аппаратура
Для исследования давности возникновения механической травмы с использованием крови в суточном ностмортальном периоде, была применена следующая методика. Кровь, взятую из полости сердца животных или из бедренной вены трупов людей, смешивали с гепарином в равных соотношениях. Полученную смесь разбавляли физиологическим раствором в соотношении 2:5.
Для исследования давности травмы с использованием периферической крови в течение месячного постмортального периода, кровь в количестве 5 мл бралась из бедренной вены и хранилась в стеклянных бюксах при температуре около +18 С и относительной влажности 50 %.
В случаях субдуральных кровоизлияний проводили комплексное исследование, включающее спектрофотометрическое определение метгемоглобина, оксигемоглобина и общего гемоглобина в травматических субдуральных кровоизлияниях, радиоспектроскопическое определение скорости реакции восстановления нитроксильного радикала спиновой метки кровью из субдурального кровоизлияния, гистологическое исследование вещества и оболочек головного мозга в областях, прилежащих к кровоизлиянию. Для гистологического исследования изымали субдуральные кровоизлияния и расположенные в их области твердую мозговую оболочку и головной мозг с мягкой головной оболочкой. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизона, Перлса. Всего было изготовлено 900 гистопрепаратов. Для исследования давности травмы с использованием тканей языка, миокарда и скелетных мышц в отдалённые сроки постмортального периода кусочки тканей одинакового размера и формы массой 0,5 г помещали в чашки Петри и хранили при комнатной температуре 20С.
Для исследования давности травмы с использованием тканей печени образцы для исследования приготовлялись из кусочков печени. После нанесения животным смертельной черепно-мозговой травмы трупы животных хранили в термостате не препарированными в течение в течение заданного срока, после чего из трупов извлекалась печень, из которой брались кусочки для дальнейших исследований.
Приготовление образцов для исследования гомогенатов тканей скелетных мышц, головного мозга и печени заключалось в следующем: сразу после извлечения исследуемые органы помещали в специальные стеклянные сосуды с герметически закрывающимися пробками и до исследования они хранились в термостате при температуре -10С. Для проведения исследования, каждый из образцов размораживался при комнатной температуре, после чего кусочки тканей измельчали ножницами и отмывали от крови в 0,25 М растворе сахарозы. Избыток влаги удаляли. После этого брался материал в количестве 3 - 4 г., к которому добавляли равное по массе количество 0,25 М сахарозы и гомогенизировали в гомогенизаторе из пирексового стекла с помощью механического микроизмельчителя тканей в течение 3-4 мин. До получения однородной массы.
Для исследований мышечной ткани из области переломов, мышечную ткань помещали в стеклянные бюксы и хранили при температуре около +19С и относительной влажности 60% в течение 3-х месяцев. Мышечную ткань замораживали в жидком азоте, измельчали в фарфоровой ступке. После добавления физиологического раствора в соотношении 1:1 и тщательного перемешивания полученный гомогенат центрифугировали в течение 3-х минут при скорости центрифуги 3000 об/мин. Супернатант стандартизировали на микроэлектрофо-токолориметре добавлением физиологического раствора до величины поглощения света 40% (длина волны 520 нм).
Для исследования репаративной (посттравматической) регенерации закрытых диафизарных переломов плечевой кости, использовались 60 мышей линии СВА. В поставленных нами экспериментах животные выводились из опыта летальной дозой паров эфира в замкнутом пространстве на различных сроках после травматизации в течение одного месяца. Для достоверности получаемых результатов и проведения статистической обработки в каждый срок наблюдения использовались 3-5 животных. В экспериментальных моделях диафизарных переломов иммобилизация не применялась, что позволяло получать значительную по объёму периостальную мозоль, достаточную для нашего исследования. Использовался рентгенологический контроль консолидации перелома. Получаемые результаты сопоставлялись с гистологической картиной регенерации. Для этого препараты окрашивались гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону и Маллори.
Посмертные процессы в переживающих тканях определение прижизненности и давности возникновения механической травмы методом эпр в различные сроки постмортального периода
У трупов людей и животных брали различные органы, из которых готовили препараты для радиоспектроскопических исследований. Препараты представляли собой кусочки тканей или гомогенаты, в которые добавлялся тот или иной спиновый зонд и после определённого времени инкубации записывался спектр ЭПР. Однако в различных опытах методики приготовления препаратов имели свои особенности.
В подготовленные препараты мышечной ткани из области переломов добавляли два объемных процента спиртового раствора спинового зонда "капри-ловый эфир" в концентрации 1x10"2 М. После инкубации в течение 10 и 30 минут образцы набирали в стеклянный тонкостенный капилляр объёмом 70 мкл и помещали в резонатор радиоспектрометра. В качестве контроля использовался образец марганца в MgO помещённый в резонатор радиоспектрометра. Запись спектров ЭПР производилась в течение 3-х минут. Мышечная ткань была исследована в сроки до 12 недель посмертного периода с интервалом в 1 неделю. Всего получено и обработано 1512 спектров ЭПР.
Для исследования давности возникновения механической травмы с использованием крови в суточном постмортальном периоде, в кровь, взятую от трупов, вводили зонд «каприловый эфир», набирали в стеклянный капилляр и записывали спектр ЭПР при 20 С. Для каждого образца крови проводили по 3 исследования. Всего было получено и обработано 630 спектров ЭПР.
Для исследования давности травмы с использованием периферической крови в течение месячного постмортального периода с помощью спиновых зондов, образцы крови смешивали с физиологическим раствором в соотноше 68 ний I:5. На 1 мл полученного раствора вводили 10 микролитров спинового зонда (спиртового раствора "каприлового эфира") концентрацией 10"2 М. После 10-ти и 40 - минутной инкубации препарат набирали в тонкостенный стеклянный капилляр с внутренним диаметром 0,5 мм. Объем смеси в капилляре составлял 40 микролитров. Один конец капилляра закрывался колпачком во избежание потери исследуемой смеси. Капилляр помещали в резонатор радиоспектрометра и записывали спектр ЭПР. Всего было записано 1360 спектров ЭПР.
Для работы с биологически-активными веществами применяли след ющую методику. 1мг лиофилизированного белка активной фракции растворяли в 1 мл 50 мМ трис-HC1 буфере с 2 мМ ЭДТА и добавляли 15 мкл 1 мМ раствора 4-хлормеркурий-2,2Д6-тетраметил-дегидропиперидин-1-оксил в ДМСО. Инкубировали при постоянном перемешивании в течение 5 мин. Не включившуюся метку отмывали, используя общепринятую методику обессоливания на сефа-дексе G-25. Биологическую активность меченого препарата оценивали по степени подавления включения меченного тритием тимидина в ДНК клеток ас-цитной гепатомы 22а на седьмой день ее развития методом сцинтилляции и путем подсчета митотического индекса (МИ) на гистологических препаратах. Тестирование препаратов на различных этапах очистки и после манипуляций, связанных с присоединением спиновой метки, осуществляли на клетках гепатомы 22а. Далее проводилась ассоциация меченого кейлонсодержащего препарата с рецепторами клеточной поверхности. Гепатоциты выделяли из кусочка печени в растворе Хенкса, отмывали центрифугированием, фильтровали и прибавляли 250 мкл (0,25 мг) меченого белка на 1 г клеточной массы в 30 мМ трис-НС1 буфере при рН 8,0. Инкубировали в течение часа при +40С. Неспецифическое связывание убирали промывкой в 50 мМ глициновом буфере с рН 3,5. Суспензию клеток высушивали при комнатной температуре, взвешивали и измеряли спектр ЭПР, записанный на радиоспектрометре (уровень мощности СВЧ - в пределах 10 мВт).
О степени связывания кейлонсодержащего препарата с рецептором судили по амплитуде центральной компоненты спектра, приведенной к единице массы образца. Клетки гепатомы 22а, отделяли от асцитической жидкости центрифугированием, отмывали в растворе Хенкса и обрабатывали способом, описанным выше. В качестве контроля использовали пробу кейлонсодержащего препарата, инактивированного нагреванием, и бычий сывороточный альбумин (БСА).
Для исследования взаимодействия спинмеченного местранола и пальмитинового эфира с плазматическими мембранами печени, в динамике процесса регенерации, плазматические мембраны выделяли из гепатоцитов крысы, взятых в разное время (6, 12, 24, 36 ч) после, частичной гепатэктомии. Чистота препарата плазматических мембран составляла около 85% по данным электронной микроскопии. Стероид, брали в концентрации 10" моля на миллилитр суспензии мембран (концентрация по белку 0,2 мг/мл).
Гомогенаты печени для исследования реакции восстановления спиновых зондов смешивали с растворами спиновых зондов до конечной концентрации спиновых зондов Ю-5-Ю-6 М. Полученную смесь помещали в капилляр в объёме 20 мкл и регистрировали спектры ЭПР при падающей микроволновой мощности около 0,05 мВт.
Установление возникновения механической травмы с использованием печени
Применение разнообразных морфо-функциональных, биохимических и биофизических методов, позволили проводить объективную регистрацию посмертных изменений в органах и тканях трупа.
После наступления биологической смерти организма помимо «обычных» трупных явлений в тканях и жидкостях развиваются различные биохимические и физико-химические изменения, недостаточно изученные в настоящее время.
На современном этане вопрос о давности травмы не может быть разрешен на основании выраженных субъективных данных, фактически не отражающих тех сложных биохимических процессов, которые происходят в организме человека после смерти. Только применение современных методов исследования, направленных на выявление метаболической инволюции гибнущей ткани, с учетом влияющих факторов (причины смерти, источник получения материала, условия окружающей среды и др.), позволит выяснить многие еще неясные аспекты проблемы.
Определение прижизненности и давности механической травмы целесообразно рассмотреть на разных временных интервалах (до одной недели, больще недели и т.д.). Это связано с изменением состояния органов и тканей с течением времени, в свою очередь, влияющим на выбор используемых методов диагностики.
Сроки до одной недели с некоторой долей условности можно отнести к категории ранних. А.Е. Шорохов (1968) при изучении аутолитических процессов для определения ранних сроков смерти отмечал, что в эксперименте возможна диагно 101 стика давности смерти с точностью до I часа в первые 7 часов. Причём аутоли-тические изменения имеют волнообразный характер, т. е. периоды стабильности сменяются выраженными деструктивными процессами в связи с последовательным прохождением клетками и межклеточными структурами ряда этапов посмертной структурной дезорганизации. /Пиголкин Ю. И., Коровин А. А., 1997/.
Обширный литературный материал по изучению характера и развития трупных изменений в зависимости от времени, прошедшего с момента смерти, представлен в монографии Е. М. Евгеньева-Тиша (1963). В частности, кровь, как и другие ткани трупа, подвергается постоянным посмертным изменениям. Учитывая это, многие авторы изучали отдельные показатели динамики трупной крови. К.В. Егоров (1970) установил разрушение клеток белой крови в первые часы после смерти. Через 4 часа количество разрушенных клеток составляло 4 -5%, через 12 часов и к концу суток - соответственно 20 - 25 и 40 - 50%. Количество лимфоцитов постепенно увеличивалось и к концу первой половины суток доходило до 50%. По истечении 20 - 24 часов после смерти оно достигало 60 -65%. Начало разрушения лимфоцитов наблюдалось только через 20 - 24 часа. В то же время отмеченная авторами вариабельность этих сроков, естественно, требует осторожности при использовании таких критериев для диагностики давности наступления смерти.
А. De Beraardi и Р. Tarditi (1965) отмечали фагоцитоз до 24 часов в крови из сосудов брыжейки и до 48 часов - из полостей сердца. В кровяных свертках сохраняемость фагоцитарной активности лейкоцитов лучше до 80 часов.
Заслуживает внимания работа С.Н. Бакулева (1965), в которой приведены результаты динамического исследования гемоглобина, эритроцитов и показателя гематокрита. Автор установил статистически достоверное нарастание количества гемоглобина в течение первых двух суток после смерти. Что касается эритроцитов, то их количество статистически достоверно нарастало, причем наиболее выражено в первые сутки после смерти и несколько в меньшей степени - на вторые. Показатели гематокрита свидетельствовали о прогрессивном сгущении крови. Автор привел статистически достоверные цифровые данные, позволяющие разграничивать интервалы в 2 - 4 часа вплоть до 48 часов с момента смерти. Ishibashi Kinichi (1956), исследуя гемоглобин в крови трупов собак, отметил, что в гемолизированных растворах полосы а- и Р-оксигемоглобина становились все более слабыми с увеличением времени, прошедшего после смерти. Е.С. Eliakis с соавт. (1966 в), изучая изменения рН в крови и спинномозговой жидкости умерших насильственной смертью в течение первых 24 часов после ее наступления, получили рН, равную от 7,1 до 5,9. Зависимости ее величины от посмертного периода ими не установлено. Повышение сульфгемоглобина крови гнилых трупов на 6-е сутки после смерти отметил В.М. Зеленгуров (1961).
Я.С. Смусин с соавт. (1958), Э.Н. Ростошинский (1963) и другие охарактеризовали динамику ряда биохимических и химических ингредиентов (вода, концентрация водородных ионов, молочная кислота, активность холинэстера-зы) в мышцах человека в процессе трупного окоченения. В частности, Я.С. Смусин с соавт. (1958) установили, что коэффициент активности холинэстера-зы в икроножной мышце в пределах до 3 суток после смерти не уменьшается и является величиной постоянной. Они же доказали, что посмертное (в пределах до 3 суток) содержание молочной кислоты, воды и концентрация водородных ионов остаются преимущественно на одном и том же уровне.
Изменение в содержании аденозинтрифосфорной (АТФ) и аденозинди-фосфорной (АДФ) кислот, макро- и микроэлементов в скелетной мускулатуре трупов людей в период формирования посмертного окоченения выявил В.В. Жаров (1967). Им установлено, что снижение количества АТФ наблюдается в течение первых 6 часов после наступления смерти и в среднем составляет 0,45 -0,5 мг на 1 г скелетной мышечной ткани через каждые 2 часа. В последующие 6 часов оно несколько замедляется и составляет в среднем 0,2 - 0,15 мг на 1 г мышцы через каждые 2 часа.
М.Г. Кондратов (1962), Н. Watanab (1955), анализируя кислотный состав печени, мышц и мозга в различные сроки после смерти (от 1 до 90 суток) установили, что после смерти содержание аминокислот несколько возрастает в связи с процессом аутолиза и гниения, однако динамика нарастания недостаточно закономерна и нечетко выражена и зависит от условий окружающей среды.
Э.Н. Ростошинский (1963) исследовал содержание воды в миокарде в зависимости от причины и времени, прошедшего с момента смерти. Предварительные результаты, полученные автором, указывают на то, что с увеличением времени после смерти отмечается нарастание количества воды в миокарде.
