Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.2.Механизмы клеточной гибели 13
1.3. Гибель клеток при фотодинамическом воздействии 19
1.4.Механизмы фотодинамического воздействия на нейроны 23
2. Методика эксперимента 25
2.1 .Химические реактивы 25
2.2.Объект исследования..' 26
2.3. Регистрация импульсной активности рецептора растяжения 29
2.4.Фотодинамическое воздействие 31
2.5.Исследование спектральных характеристик Фотосенса 32
2.6.Фармакологическая модификация реакции нейрона
на фотодинамическое воздействие 33
2.7.Активность сукцинатдегидрогсназы 35
2.8.Общая дегидрогеназная активность (МТТ-тест) 37
2.9.Флуоресцентно-микроскопические исследования 38
2.9.1. Исследование локализации Фогосенса в рецепторе растяжения речного рака 38
2.9.2. Исследование целостности плазматической мембраны нейронов 39
2.9.3. Исследование морфологии ядер механорецепторного нейрона..39
2.10. Исследование ультраструктурных изменений
в механорецепторном нейроне 40
2.11. Статистический анализ результатов 41
3. Результаты исследований 42
3.1 .Спектральные характеристики Фотосенса 42
3.2.Локализация Фотосенса в механорецепторе речного рака 42
3.3. Реакция нейрона на лазерное облучение и темновое действие Фотосенса 45
3.4.Электрофизиологическая реакция нейрона на фотосенсибилизацию Фотосенсом 48
3.5.06 участии Са + в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 51
3.6.06 участии протеинкиназы С в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 57
3.7.06 участии фосфатидилинозитол 3-киназы в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 65
3.8.06 участии биоэнергетических процессов в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 68
3.9.Фотоиндуцированное изменение активности СДГ в рецепторных нейронах 75
3.10. Влияние фотодинамического воздействия на общую активность дегидрогеназ в нейроне (МТТ-тест) 80
3.1 1. Динамика нарушения проницаемости плазматической мембраны 82
3.12. Морфология ядра механорецепторного нейрона после ФД-индуцированного прекращения активности 85
3.13. Ультраструктурные изменения рецептора растяжения при фотосенсибилизации Фотосенсом 90
4. Обсуждение... -. 93
4.1 .Динамика гибели механорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии Фотосенса в концентрации 1 0 моль/л 94
4.2. Динамика гибели мехаиорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии Фотосенса в концентрации 10" моль/л 97
Выводы
Благодарности 111
Список литературы
- Гибель клеток при фотодинамическом воздействии
- Регистрация импульсной активности рецептора растяжения
- Реакция нейрона на лазерное облучение и темновое действие Фотосенса
- Морфология ядра механорецепторного нейрона после ФД-индуцированного прекращения активности
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ.
Фотодинамический эффект - гибель окрашенных фото сенсибилизаторами клеток, при освещении светом в присутствии кислорода. Он лежит в основе фотодинамической терапии, успешно применяемой в онкологии для избирательного разрушения злокачественных опухолей, селективно накапливающих фото сенсибилизаторы (Dougherty et al., 1998), в частности, для лечения некоторых опухолей мозга (Muller, 1990; Kostron, 1996). В экспериментальной нейрофизиологии фотодинамический эффект используется для направленного разрушения определенных нейронов или групп клеток с целью выяснения их роли в функционировании разных нервных центров (Picaud et al., 1990; Yeoman et al., 1994). Однако, при фотодинамической терапии могут повреждаться и здоровые клетки, окружающие опухоль, в частности, периферические нервные элементы (Ji et al., 1992; Hebeda et al., 1998). Поэтому необходимо всестороннее комплексное исследование динамики повреждения нейрона и механизмов его смерти, конечной целью которого было бы максимальное разрушение злокачественных клеток и защита здоровых. Кроме того, детальное исследование влияния фотодинамического воздействия на нервные клетки может дать новую информацию об общебиологических механизмах фото сенсибилизации на клеточном уровне. Однако исследованию фотодинамического эффекта на нервные клетки посвящены пока единичные работы (Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1992, Lilge et al., 2000; Kress et al., 1997), изучающие отдельные стороны реакции нейронов на фото сенсибилизацию и не позволяющие связать наблюдавшиеся изменения биоэлектрических процессов с происходящими при этом метаболическими реакциями.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Цель настоящей работы провести комплексное электрофизиологическое, биохимическое, цитологическое и фармакологическое исследование влияния фотодинамического воздействия на одиночную нервную клетку. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать динамику ин активации механорецепторного нейрона по показателям биоэлектрической активности при фотодинамическом воздействии сульфированного алюмофталоцианина Фотосенса.
2. Оценить степень повреждения плазматической мембраны, изменения морфологии клеточных ядер и нарушений биоэнергетических процессов в нейронах при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
3. Изучить роль различных биоэнергетических процессов (гликолиз, цикл Кребса, окислительное фосфориллирование) и процессов внутриклеточной сигнализации (ионы Са2+, активность протеинкиназы С и фосфатидилинозитол 3-киназы) в динамике инактивации изолированных нейронов при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
Впервые проведено комплексное электрофизиологическое, биохимическое, цитологическое и фармакологическое исследование влияния фотодинамического воздействия на одиночную нервную клетку. Показано, что фотосенсибилизация может инициировать различные механизмы клеточной гибели в зависимости от интенсивности воздействия. Изучена динамика изменений ядра, митохондрий и плазматической мембраны при фотодинамическом воздействии. Выявлено участие различных биоэнергетических процессов и процессов внутриклеточной сигнализации (ионы кальция, активность протеинкиназы С и фосфатидилинозитол 3-киназы) в фотоинактивации изолированных нейронов. Показано, что фармакологическая модификация разных метаболических и сигнальных процессов повышает или понижает чувствительность нейрона к фотодинамическому воздействию.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.
Данные о характере реакций нервных клеток, динамике развертывания в них процессовповреждения, механизмов фотоповреждения и фотоиндуцированной гибели нейронов, зависимости эффективности воздействия от концентрации фотосенсибилизатора, а также о влиянии различных модуляторов на реакцию нервной клетки к ФД воздействию могут учитываться при разработке методов фотодинамической терапии опухолей мозга и других онкологических заболеваний. Применяя модуляторы, повышающие внутриклеточную концентрацию ионов Са2+, активаторы протеинкиназы С или ингибиторы продукции АТФ можно усилить фотодинамическое повреждение опухолевых тканей. С другой стороны, применяя биоэнергетические субстраты, ингибиторы протеинкиназы С, фосфагидилинозитол 3-киназы или агенты, снижающие внутриклеточную концентрацию ионов Са , можно защитить здоровые клетки, окружающие патологическую ткань при фотодинамической терапии. Материалы работы используются в учебном процессе при чтении курса лекций по фотобиологии на кафедре биофизики физического факультета РГУ. Результаты работы использованы при выполнении грантов РФФИ № 02-04-48027 и 03-04-06101.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Фотодинамическое воздействие вызывает качественно различные импульсные ответы механорецепторного нейрона речного рака в зависимости от концентрации фотосенсибилизатора. При высокой концентрации сульфированного аюмофталоцианина Фотосенса (10° моль/л) происходит учащение импульсной активности, заканчивающееся резким блоком генерации потенциалов действия. Фотосенсибилизация нейрона с меньшей концентрацией Фотосенса (10" моль/л) вызывает торможение импульсной активности с последующим необратимым прекращением импульсации.
2. При фотодинамическом воздействии высокой концентрации Фотосенса (Ю-3 мол/л) происходит повреждение плазматической-мембраны и биоэнергетических процессов в процессе облучения, что приводит к некрозу мехапорецепторного нейрона. При меньшей концентрации Фотосенса (10 7 моль/л) активность дегидрогеназ и целостность плазматической мембраны сохраняются в течение первых 2 часов после функциональной инактивации нейрона, но затем также развивается некроз.
3. В фотодинамической инактивации нейрона участвуют ионы Са , внутриклеточная сигнализация (протеинкиназа С и фосфатидилинозитол 3-киназа) и биоэнергетические процессы. Применение модуляторов, увеличивающих концентрацию ионов Са , активаторов протеинкиназы С и ингибиторов продукции АТФ может повышать эффективность ФДТ, в то время как применение биоэнергетических субстратов, агентов, снижающих концентрацию ионов Са +, и ингибиторов протеинкиназы С и PI-3 киназы может защищать нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от фотодинамического воздействия.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Материалы диссертации были представлены на 17 международных конференциях; 3rd European Biophysical Congress "Eurobiophysics 2000" (Munich), VI и VII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Moscow-Pushchino, 2000, Kaliningrad -Svetlogorsk -Otradnoe, 2003), III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), 29-31th Annual Meeting American Society for Photobiology (Chicago, 2001, Quebec, 2002, Baltimore, 2003), 9-10th Congress of European Society for Photobiology (Lillehammer, 2001, Vienna, 2003), 10lh Annual International Laser Physics Workshop (Moscow, 2001), Saratov Fall Meeting -SFM 01-02 International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine III-IV (Saratov, 2001-2002), IX International Conference of Laser Applications in the Life Sciences (Vilnius, 2002), Юбилейной международной конференции по нейрокибернетике им А.Б. Когана (Ростов-на-Дону, 2002), 12 1 European Bioenergetic Conference ЕВЕС (Bordeaux, 2002), 7ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 4 статьи в реферируемых журналах, 9 статей в сборниках и 14 тезисов по материалам конференций.
Гибель клеток при фотодинамическом воздействии
Внутриклеточная локализация фотосенсибилизатора - ключевой фактор, определяющий локализацию повреждений, механизм и тип гибели клетки при ФД воздействии (Schneckenburger et al., 1996). Время жизни синглетного кислорода около 10" с, за это время он может продиффундировать не больше чем на 10-20 нм (Moan and Berg, 1991). Поэтому ФД воздействие, в зависимости от локализации фотосенсибилизатора, может повреждать плазматическую мембрану, элементы цитоскелета, лизосомы, митохондрии и хроматин.
Кинетика проникновения и локализация фотосенсибилизатора зависит от его физико-химических свойств, таких как липофильность, тип и число зарядов, отношения заряд/масса, тип и число ароматических колец и тип заместителя ядра. ФС могут проникать в клетку путем диффузии или эндоцитоза (Oleinick and Evans, 1998). Большое значение имеют время инкубации, концентрация сыворотки или белков в питательной среде или физиологическом растворе и последующее отмывание клеток. ФД воздействие повышает проницаемость плазматической мембраны (Moan and Berg, 1992). Методом электронной микроскопии показано, что ФДТ приводит к изменению распределения липидов и белков мембран путем направленного повреждения мембранных белков или вследствие повреждения цитоскелета (Moan and Chnstensen, 1981). ФД воздействие может нарушать полимеризацию тубулина, в результате чего клетки теряют способность делиться, и клеточный цикл останавливается в фазе митоза (Berg and Moan, 1997; Lee and Chen, 1995). Некоторые фотосенсибилизаторы локализуются в лизосомах, однако разрушение лизосом не ведет к немедленной инактивации клетки. Это связано с инактивацией лизосомальных протеаз в результате ФД воздействия или действием на них внутриклеточных ингибиторов (Berg and Moan, 1994). Повреждение митохондрий ведет к высвобождению из межмембранного пространства многочисленных молекул, активирующих запуск программы апоптоза (Granville et al., 1998). Методами электронной микроскопии показано набухание митохондрий после ФД воздействия (Moan and Chnstensen, 1981). Биохимические исследования ферментативной активности также указывают на повреждение митохондрий (Oleinic et al., 1992). Клеточные структуры в околоядерном пространстве очень чувствительны к ФД воздействию вследствие связывания некоторых фотосенсибилизаторов с ядерной оболочкой (Evensen and Moan, 1982). Фотосенсибилизация вызывает однонитевые разрывы, ДНК-протеиновые сшивки, абберацию хромосом и обмен соседних хроматид (Oleinick and Evans, 1998) Однако ФД воздействие не обладает такими выраженными мутагенными свойствами, как ионизирующая радиация (Kvam et al., 1990). Липофильные фотосенсибилизаторы проявляют большую мутагенность, чем гидрофильные (Noodt et al., 1993).
ФДТ может индуцировать и апоптоз, и некроз клеток, как in vivo, так in vitro. Впервые ФД-индуцированный апоптоз продемонстрировали Агравал и др. (1991) на культуре клеток лимфомы мыши, фотосенсибилизированной алюмохлорофталоцианином. Индукция апоптоза в этих клетках наблюдалась со всеми протестированными и используемыми в настоящее время ФС (Agrawal et al., 1991). Повышение интенсивности ФД воздействия приводило к клеточной гибели без характерной для апоптоза фрагментации ДНК, вероятно, вследствие развития некроза (Не, Oleinick, 1994). Предполагалось, что более интенсивное ФД воздействие может вызывать повреждение ферментов ответственных за образование олигонуклеосомных фрагментов хроматина при апоптозе. ФД воздействие фотосенсибилизаторов, локализующихся в ядре повреждает преимущественно ДНК, белки ядра и вызывает некроз. Фотосенсибилизаторы аккумулирующиеся в митохондриях, преимущественно вызывают апоптоз, накапливающиеся в лизосомах, могут вызывать как апоптоз, так и некроз. Фотосенсибилизаторы локализующиеся в плазматической мембране преимущественно инициируют некроз.(Oleinick et al., 2002).
Фотосенсибилизация запускает активацию различных сигнальных путей в клетке, которые вовлечены как в защиту клеток от гибели, так и в процесс индукции гибели клеток (Moor, 2000). Молекулярные механизмы ФД-индуцированного апоптоза недостаточно изучены. Наиболее изучен общий первичный механизм запуска ФД-индуцированного апоптоза, развивающийся при повреждении митохондрий. Фотодинамическое повреждение митохондрий приводит к образованию в митохондриальных мембранах РТР, и разрушению наружной митохондриальной мембраны (Noodt et al., 1999, 1996, 1998; Kroemer, 1997; Kessel et al., 1997). При этом из межмембранного пространства митохондрий в цигозоль выходят цитохром С и апоптоз-индукцирующий фактор (AIF), происходит активация каспазы 3 (Granville et aJ., 1998, 1999), запускающей каспазный каскад (Carre et al., 1999) заканчивающийся активацией Фактора Фрагментации ДНК (FFD). Фактор Фрагментации в свою очередь, активирует эндонуклеазы, ответственные за фрагментацию ДНК, конденсацию хроматина (Sahara et al., 1999; Zamzaini, 1999) и разрезание поли-АДФ-рибозо-полимеразы (PARP) (Heetal., 1998).
ФД индуцированное повреждение ДНК ведет к инициированной белком р53 транскрипции р21, остановке клеточного цикла и запуску апоптоза (Ahmad et al., 1998). Оксид азота (NO) запускает апоптоз, активируя митохондриальные РТР (Hortelano et al., 1997). Известно, что ФД воздействие активирует конститутивную NO-синтазу, что приводит к увеличению продукции N0 и апоптозу (Gupta et al., 1998). Кроме того, ФД воздействие может активировать митоген активируемые протеинкиназы (МАРК). Это важные промежуточные сигнальные молекулы, переводящие внеклеточный сигнал от других протеинкиназ и фактора транскрипции во внутриклеточный ответ (Hortelano et al., 1997). МАРК-белки р38 H0G1 и JNK1/SAPK присутствуют в различных клетках и вовлечены в индукцию апоптоза или защиту от него (Хне et al., 1999).
Индукция апоптоза при ФДТ является более предпочтительной с медицинской точки зрения, поскольку при этом не происходит характерной для некроза воспалительной реакции ткани, что способствует более быстрому заживлению и предотвращает образование рубца. В связи с этим для оптимизации метода ФДТ помимо поиска новых эффективных ФС необходимо фундаментальное изучение механизмов гибели клеток при ФД воздействии. Исследование условий, при которых клетка выбирает тог или иной путь гибели, и возможности управления этим процессом имеет важнейшее значение для оптимизации процесса ФД разрушения опухолевой ткани и лечения раковых заболеваний.
Регистрация импульсной активности рецептора растяжения
После контрольной регистрации частоты генерации ПД в течение получаса, к физиологическому раствору добавляли Фотосенс в концентрациях 10 7 или 10 моль/л, которые были выбраны на основании проведенных ранее исследований (Uzdensky and Mironov, 1999; Uzdensky et al., 2001).
После контрольной регистрации частоты генерации ПД в течение получаса, к физиологическому раствору добавляли Фотосенс в концентрациях 10 7 или 10 моль/л, которые были выбраны на основании проведенных ранее исследований (Uzdensky and Mironov, 1999; Uzdensky et al., 2001). После 30-минутной инкубации с Фотосенсом нейрон облучали гелий-неоновым лазером ЛГН-111 (Полярон, Львов, СССР), излучающим красный свет с длиной волны 632,8 нм и плотностью мощности 0,3 Вт/см . Динамику частоты ПД нейрона непрерывно регистрировали вплоть до необратимого прекращения импульсации. Диаметр лазерного луча составлял 3 мм, что позволяло облучать тело нейрона, дендриты, часть аксона и рецепторных мышц. Высота слоя физиологического раствора над телом клетки в экспериментальной ванночке составляла 0,5-1 мм, так что лазерное излучение с длиной волны 632,8 нм доходило до объекта практически без потерь. По частотограмме определяли динамику импульсной реакции нейрона и его время жизни при ФД воздействии. Мощность лазерного излучения измеряли дозиметром ИМО-2Н (Эталон, Волгоград, Россия). Интенсивность излучения (/) рассчитывали по формуле: 1 = 4 W/nD2, где: W - мощность лазерного излучения, a D - диаметр луча.
Необратимое прекращение импульсации рассматривали как показатель функциональной смерти нейрона. Продолжительность функционирования нейрона, время, в течение которого нейрон генерировал ПД, измеряли по частотограмме от начала облучения до момента прекращения импульсации. Перед исследованием реакции нейрона на фотодинамическое действие Фотосенса, были изучено влияние лазерного излучения и Фотосенса на рецептор по отдельности.
Регистрацию спектров возбуждения и флуресценции Фотосенса проводили на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама (ООО Люмэкс, Санкт-Петербург) в диапазоне длин волн 550-750 нм с шагом 1 нм. Спектр поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000-02 (АОЗТ ОКБ «Спектр», Санкт-Петербург) в области длин волн 300-750 нм через 0,1 нм. Экстинкцию (є) рассчитывали по формуле: 8=D/C% где: D - оптическая плотность, С - концентрация, моль/л, а / толщина кюветы, равная 1 см. В качестве растворителя в обоих случаях использовали раствор ван Харревельда.
Для изучения участия ионов Са +, систем внутриклеточной сигнализации и биоэнергетики клетки в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие Фотосенса в концентрации 10" моль/л, за 15 мин до облучения в экспериментальную ванночку добавляли различные фармакологические агенты, модифицирующие изучаемые биохимические процессы, и изучали реакцию нейрона на низкоинтенсивную фотосенсибилизацию. Концентрации модификаторов подбирали в предварительных экспериментах так, чтобы они сами не влияли на импульсную активность нейрона в течение 2-3 часов. Контролем служили фотосенсибилизированные нейроны, не обработанные модификаторами.
С целью исследования роли ионов кальция использовали фармакологические агенты, модулирующие различные механизмы внутриклеточной регуляции кальциевого гомеостаза: Са + ионофор -иономицин ("10" моль/л, Oleinick et al., 1991); тапсигаргин, блокирующий Са2+-АТФазу, закачивающую Са2+ в депо (10"Г) моль/л, Treiman et al., 1998); хелатор ионов Са + ВАРТА (10"4 моль/л, Tsien, 1980) и блокатор кальциевых каналов эндоплазматической сети риаподин (10" моль/л, McPherson et al., 1991). Для исследования роли протеинкиназы С (РКС) использовали активатор фермента 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТРА, 5 10"8 -2,5 10" моль/л), действующий аналогично диацилглицеролу (Tanaka and Nishizuka, 1994) и ингибиторы: гиперицин (10" моль/л); стауроспорин (10" -6 10" моль/л) и челеритрин (5 10" моль/л, Housey et al., 1988; Gescher et al, 1995).
Для исследования роли фосфатидилинозитол-3 киназы (PI 3-киназы) использовали два ингибитора: вортманнин (10" моль/л) и LY294002 (10" -2 10"5 моль/л, Brunn G.J. et al. 1996).
С целью исследования роли отдельных звеньев энергетического метаболизма использовали субстраты и ингибиторы гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, окислительного фосфориллирования и электронного транспорта: субстраты гликолиза - глюкоза (10" моль/л) или цикла трикарбоновых кислот - сукцинат натрия (5 10"1 моль/л) и смесь пируват/малат натрия (2,5 10 моль/л, Ленинджер, 1985); ингибиторы гликолиза - моноиодацетат (2 10" моль/л), алкилирующий сульфгидрильные группы гликолитических ферментов, преимущественно фосфоглицеральдегидрогеназы и 6-фосфофруктокиназы, (Уэбб, 1966) и 2-дезокси-О-глюкоза (5 10"4 моль/л) конкурирующая с глюкозо-6-фосфатом за фосфоглюкоизомеразу, с которой она образует неметаболизируемый продукт (Wick et all., 1957); ингибитор цикла Кребса - малонат натрия (5 10 моль/л), основными мишенями которого являются сукцинатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и малатдегидрогеназа (Досон и др., 1991);
Реакция нейрона на лазерное облучение и темновое действие Фотосенса
Механорецепторные нейроны оказались очень чувствительными к сочетанному действию лазерного облучения и Фотосепса, т.е. к фотодинамическому эффекту. В предыдущих исследованиях реакции нейронов на ФД воздействие часто включали несколько фаз возбуждения и торможения импульсации. Наблюдались следующие типы импульсных ответов МРН на ФД воздействие: В-тип - учащение импульсации, затем резкий и необратимый ее срыв; ВТ-тип - учащение импульсации, затем постепенное торможение вплоть до необратимого прекращения; ВТВ-тип -учащение, затем торможение, новое учащение и резкий необратимый срыв импульсации; Т-тип - постепенное торможение вплоть до необратимого прекращения импульсации; ТВ-тип - торможение, учащение и резкий необратимый срыв импульсации; ТВТ-тип - торможение импульсации, затем учащение и постепенное торможение вплоть до необратимого прекращения (Узденский и Миронов, 2000; Uzdensky et al., 2001; 2002, рис. 8).
В наших экспериментах тип реакции нейрона зависел от интенсивности ФД воздействия, то есть от концентрации фотосенсибилизатора, поскольку интенсивность лазерного излучения поддерживалась постоянной во всех экспериментах. Как известно, интенсивность облучения определяется количеством поглощенных квантов, которое может быть обусловлено как плотностью мощности, так и числом молекул, то есть концентрацией фотосенсибилизатора. В связи с этим, мы приняли ФД воздействие более высокой концентрации Фотосенса (10 моль/л) как более интенсивное, а воздействие меньшей концентрации (10" моль/л) как менее интенсивное воздействие. 20 10 0 10
Типы реакций механорецепторного нейрона на фотодинамическое воздействие различных фотосесибилизаторов. (Uzdensky et al. 2001). Первая стрелка показывает время добавления фотосенсибилизатора, вторая стрелка - начало облучения.
А. Возбуждение (В тип), Б Возбуждение-торможение-возбуждение (ВТВ тип), В. Возбуждение-торможение (ВТ тип), Г. Торможение (Т тип), Д. Торможение-возбуждение-торможение (ТВТ тип), Е. Торможение-возбуждение (ТВ тип). В наших исследованиях фотодинамическое воздействие Фотосенса (10 моль/л) в 63 % опытов вызывало активацию генерации ПД и последующий деполяризационный блок импульсной активности (В-реакция). Инактивация нейрона происходила в среднем за 2,5±0,8 минуты (таблица 1, рис. 9 А). Менее интенсивное фотодинамическое воздействие Фотосенса (10" моль/л) в 71 % опытов приводило к постепенному торможению импульсной активности вплоть до ее необратимого прекращения в среднем за 21±1 мин. (таблица 1, рис. 9 Б). В ряде опытов наблюдались комбинированные случаи с чередованием возбудительных и тормозных В- и Т-фаз: ВТ-, ТВ-, ТВТ- или ВТВ-реакции (Uzdensky et al., 2001; 2002, таблица 1). Необратимое прекращение импульсации рассматривалось нами как показатель функциональной смерти нейрона, а время, в течение которого нейрон генерировал ПД, как время жизни нейрона. Особое внимание уделялось терминальной фазе реакции, ведущей к гибели клетки. Начальная фаза реакции, указывающая на наиболее чувствительные к облучению клеточные мишени, также представляла большой интерес. Возбудительная реакция на воздействие, как в случае 10" моль/л Фотосенса, часто наблюдается при повреждении нейронов разными факторами. Она связана с нарушением проницаемости нейрональной мембраны, падением ионных градиентов, деполяризацией, учащением импульсации и, в конечном итоге, с деполяризационным блоком импульсной активности (Узденский, Миронов, 2000). Механизм тормозных процессов, при фотодинамическом действии меньшей концентрации Фотосенса, а так же механизм последующей смерти нейрона был не ясен.
Мы предположили, что возбудительные фазы могли быть связаны с фотоповреждением мембраны, а тормозные могли быть опосредованы нарушением не только мембранных процессов, управляющих импульсной активностью, но и других важнейших функций клетки, включая биоэнергетические и сигнальные процессы (Uzdensky et al., 2000).
Было высказано предположение о том, что ионы Са + могли служить посредником ФД-индуцированного торможения импульсной активности нейрона (Uzdensly et al., 2000). С целью исследования возможной роли ионов
Са в импульсной реакции нейрона на ФД воздействие Фотосенса (10" моль/л) и выяснения роли различных путей поступления кальция в цитозоль мы использовали следующие модуляторы концентрации кальция в цитозоле: тапсигаргин, блокирующий Са2+-АТФазу, закачивающую Са2+ в депо (Robb-Gaspers et al., 1998); Са + ионофор иономицин (Robb-Gaspers et al., 1998); хелатор ионов Са2+ ВАРТА (Tsien, 1980) и блокатор кальциевых каналов эндоплазматического ретикулума (ЭР) рианодин (McPherson et al., 1991).
Тапсигаргин и иономицин Тапсигаргин проявлял слабую темповую токсичность: в концентрациях 10" -10 моль/л он инактивировал нейрон за 2,5-3 часа (таблица 2). Са +-иопофор иономицин проявлял тсмновую токсичность с выраженной концентрационной зависимостью в диапазоне от 10" до 10 моль/л. (таблица 2).
При изучении фотодинамического воздействия мы использовали такие концентрации иономицина и тапсигаргина (по 10" моль/л), при которых нейрон стабильно работал более двух часов. Добавление тапсигаргина или иономицина достоверно снижало время жизни фотосенсибилизированного нейрона в среднем на 36 и 51% соответственно (таблица 3, рис. 10). Эти воздействия существенно не влияли на процент тормозных фаз в начале реакции нейрона, которые доминировали в контроле. Однако они снижали процент тормозных фаз в терминальной стадии реакции нейрона с 81 до 22 % и 37 %, соответственно (таблица 4).
Морфология ядра механорецепторного нейрона после ФД-индуцированного прекращения активности
В контрольных препаратах, не подвергавшихся ФД воздействию и зафиксированных спустя 1-2 часа стабильной генерации ПД, флуоресцентный краситель Н33342 специфически флуорохромирующий ядерный хроматин, выявлял крупные ядра нейронов с равномерно распределенными мелкими глыбками хроматина, четкой границей и округлым ядрышком (рис. 12 А). Средняя площадь ядер составляла 720± 110 мкм (таблица 11).
ФД воздействие Фотосенса в концентрации 10 моль/л вызывало набухание ядер сразу после инактивации нейрона, свидетельствующее о развитии некротических процессов. При воздействии меньшей концентрации Фотосенса (10" моль/л) сразу после функциональной инактивации нейрона отличий от контроля не наблюдалось. Во всех фотосенсибилизированных нейронах ядрышко не выявлялось (Рис. 21).
Однако через 4-6 часов после фотоинактивации нейрона в обоих случаях происходило снижение средних площадей ядер нейронов до 540±50 мкм вследствие уплотнения хроматина (таблица 1 1, рис. 12 В).
В 16 % контрольных нейронах наблюдались нарушения границы ядра. Через 4 часа после фотодинамической инактивации нейрона Фотосенсом в концентрации 10" моль/л нарушения границы ядра наблюдались у 29 % клеток, а при воздействии большей концентрации Фотосенса (10 моль/л) у 45 % препаратов. Со временем развивалась деградация ядер нейронов, проявляющаяся в том, что его гранулы спустя 4-6 часов после фотоинактивации расплывались и становились менее четко видны при микроскопическом исследовании. Процент лизировавших ядер увеличивался через 12 часов после фотоинактивации Фотосенсом в концентрации 10" моль/л, и более существенно при фотоинактивации нейронов большей концентрации Фотосенса (10 моль/л, Рис. 21).
Дополнительную информацию о динамике морфологических изменений в нейроне при фотодинамическом воздействии мы получили, проанализировав цитохимически окрашенные на активность СДГ препараты. Формазан, образующийся при восстановлении сукцинатдегидрогеыазой нитротетразолевого синего, локализуется в околоядерном пространстве, заполненном митохондриями, а ядро остается неокрашенным, что позволяло набльодать очертания ядра и измерять его площадь. Обнаружено, что достоверных изменений общей площади тела клетки сразу после инактивации нейрона при фотосенсибилизации Фотосенсом в концентрации 10 моль/л не наблюдалось, но отмечено снижение площади дендритной зоны на 68 % за счет увеличения площади ядра па 58 %, что коррелирует с данными флуоресцентной микроскопии. Площадь аксонной зоны, области между ядром и аксоном, где сконцентрировано большинство митохондрий, достоверно не изменялась. При воздействии меньшей концентрации Фотосенса (10 моль/л) сразу после функциональной инактивации нейрона отличий от контроля не наблюдалосьт (Рис. 22).
У нейронов, подвергшихся ФД воздействию Фотосенса в концентрации 10 моль/л и инкубированных в течение 4 часов после прекращения импульсной активности наблюдали снижение площади клетки на 42 %. При воздействии меньшей концентрации Фотосенса (10 моль/л), через четыре часа после прекращения импульсации мы наблюдали снижение площади тела нейрона на 35 %. Кроме того, наблюдалось снижение площади аксонной зоны и уменьшение площади ядра на 43 и 26 %, соответственно. Таким образом, одновременно уменьшались площади клетки, аксонной зоны и ядра, что коррелирует с данными флуоресцентной микроскопии. Площадь дендритной зоны достоверно не изменялась (Рис. 22).
Итак, при фотосенсибилизация Фотосенсом в концентрации 10"" М происходило типичное для некроза набухание ядра сразу после инактивации нейрона, а ФД действие меньшей концентрации Фотосенса (10" М) вызывало снижение размеров ядер нейронов, что могло быть признаком развития апоптозных процессов. Однако фрагментации ядер нейронов, характерной для апоптоза, мы не наблюдали. Более детальную информацию об изменениях клеточной структуры мы получили при помощи электронной микроскопии.
