Содержание к диссертации
Содержание Раздел Введение Литературный обзор
1. Методы экспериментального исследования
1.1. Плазмиды ДНК и клеточная культура
1.2. Экспериментальные ультразвуковые установки (24 и 500 кГц)
1.3. Трансфекция клеток плазмидами ДНК и анализ ее эффективности
1.4. Измерение транспорта плазмид ДНК, меченых флуоресцентными маркерами
1.5. Измерения повреждений ДНК под действием ультразвука
1.6. Электрообработка клеток
1.7. Статистическая обработка результатов
1.8. Методические замечания о поиске оптимума в системе с большим числом переменных
2. Оптимизация трансфекции клеток
2.1. Влияние потока акустической энергии на трансфекцию и выживаемость клеток при облучении ультразвуком частотой 24 и 500 кГц
2.2. Влияние концентрации клеток в суспензии на трансфекцию и выживаемость клеток при облучении ультразвуком 500 кГц
2.3. Зависимость биологических воздействий ультразвука от температуры окружающей среды
2.4. Разрушение ДНК под действием ультразвука 51
2.5. Обсуждение результатов оптимизации трансфекции при 53 ультразвуковом воздействии
3. Исследование доставки ДНК, помеченной 58
флуоресцентными маркерами, в клетки при воздействии электрических полей и ультразвука
3.1. Исследование доставки ДНК в клетки под действием ультразвука 58
3.2. Исследование соотношения эффективности доставки 61 ДНК в клетки и трансфекции под действием ультразвука
3.3. Сравнительное исследование доставки ДНК в клетки и трансфекции при электропорации 65
3.4. Обсуждение результатов исследования доставки ДНК в клетки под действием ультразвука и электрических полей 69
4. Исследование повреждений клеточной мембраны 72
ультразвуком путем измерения диффузионного транспорта в клетки, подвергшиеся ультразвуковой обработке
4.1. Описание эксперимента и процедуры обработки данных 72
4.2. Пассивная диффузия через поры в клеточной мембране 81
4.3. Распределение пор по размерам 84
4.4. Обсуждение результатов 93
5. Модель транспорта заряженных макромолекул в роговом слое кожи человека 95
5.1. Структурная модель рогового слоя 95
5.2. Электропорация липидного мультислоя в SC 102
5.3. Модель извилистого (липидного) пути ПО
5.4. Модель прямого (липидно-корнеоцитного) пути 119
5.5. Оценка параметров модели из сопоставления с экспериментальными данными 126
5.6. Приложения 1
5.6.1. Приложение А. Электродиффузия в полубесконечном пространстве 133
5.6.2. Приложение В. Электродиффузия в слое 0 х Н. 134
5.6.3 Приложение С. Уравнения для липидно-корнеоцитного (прямого) пути 136
6. Заключение 139
7. Выводы 143
8. Библиография 14 5
Введение к работе
Адресная доставка лекарственных препаратов в органы, ткани и клетки человека является актуальной задачей, стоящей перед современной медициной. В человеческом организме существует множество малопроницаемых барьеров, препятствующих доставке макромолекул. Существующие способы химической и биологической модификации препаратов с целью улучшения их доставки обладают серьезными ограничениями, такими как возникновение побочных эффектов и иммунной реакции организма. В качестве альтернативных подходов к облегчению транспорта макромолекул и трансфекции клеток ДНК были предложены электропорация и ультразвук.
Было показано, что обработка клеток и тканей ультразвуком высокой интенсивности способна на некоторое время повышать эффективность транспорта макромолекул и ДНК внутрь клеток. Известно, что ультразвук с высокой точностью можно сфокусировать практически в любой точке человеческого организма и, таким образом, обеспечить высокую селективность воздействия.
Было обнаружено, что при приложении миллисекундных электрических импульсов высокого напряжения к клеткам и тканям (500-1000 В/см) можно обратимо повысить проницаемость клеточных мембран. В последнее время было также показано, что импульсная обработка кожи человека повышает ее проницаемость для макромолекул.
Целью настоящей работы является экспериментальное и теоретическое исследование транспорта макромолекул в клетки (клетки рака простаты DU145) и ткани (кожа человека) под действием электрического поля и ультразвуковой обработки; выявление механизмов воздействия используемых физических методов на клетки и ткани, а также оптимизация их применения.
Для выполнения поставленной цели было произведено исследование влияния физических и химических параметров на эффективность трансфекции и цитотоксичность при ультразвуковом облучении суспензии клеток, а также определены оптимальные параметры для достижения максимальной трансфекции и минимальной цитотоксичности.
Было также произведено сравнение эффективности трансфекции при ультразвуковом облучении и электропорации. В данном исследовании в качестве промежуточного контроля использовалось измерение количества ДНК, доставленной в клетки.
В диссертации было впервые произведено исследование обратимых повреждений, вызванных в клетках ультразвуком. Скорость залечивания клеточной мембраны была охарактеризована с использованием экспериментов по заполнению клеток макромолекулами разного размера. При этом флюоресцентные молекулы добавлялись через определенные интервалы времени после окончания ультразвукового воздействия. С помощью математической модели удалось охарактеризовать размер и распределение пор, возникающих под действием ультразвука на клеточной мембране.
В данной работе также разработана модель транспорта макромолекул (кальцеина) в роговом слое кожи человека (stratum corneum) при приложении электрических импульсов высокого напряжения. Эта модель является первой теоретической моделью, показывающей, что электропорация липидных мультислоев в роговом слое коже позволяет объяснить экспериментально наблюдаемый обратимый рост проницаемости кожи при импульсной электрической обработке.
