Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор современного состояния проблемы 7
1.1. Пондеромоторные силы 7
1.2. Основные концепции и обзор методов ультразвукового разделения и концентрирования частиц в суспензиях
1.3 Состояние исследований по действию сил на частицы и клетки в ультразвуковом поле.
1.4 Изменение скорости ультразвука и сжимаемости в растворах и суспензиях .
1.5. Метрология ультразвукового поля 29
1.6. Биологические эффекты ультразвука. 32
Глава 2. Материалы и методы 38
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Метрология ультразвуковых полей 51
3.2 Параметры необходимые для расчета сил, действующих в ультразвуковом поле на клетки в суспензии
3.3. Силы, действующие на клетки в поле стоячей ультразвуковой волны
3.4 Условия удержания клеток в ультразвуковом поле в потоке жидкости
3.5. Концентрирование клеток в поле стоячей ультразвуковой волны
3.6. Жизнеспособность клеток 91
3.7 Распределение клеток и кавитационных пузырьков в ультразвуковом поле
3.8. Акустические течения 98
Приложение 106
Заключение 112
Выводы 114
Список литературы 115
- Основные концепции и обзор методов ультразвукового разделения и концентрирования частиц в суспензиях
- Изменение скорости ультразвука и сжимаемости в растворах и суспензиях
- Параметры необходимые для расчета сил, действующих в ультразвуковом поле на клетки в суспензии
- Распределение клеток и кавитационных пузырьков в ультразвуковом поле
Введение к работе
Актуальность темы.
Актуальность этого исследования обуславливается:
быстрым развитием . ультразвуковых методов разделения и концентрирования клеток в суспензиях;
отсутствием количественных данных о волновых параметрах для большинства клеток и сред для их культивирования и суспендирования;
возможностью эффективного использования методов, которые представляют взаимозависимости рассчитанных сил, теоретически предсказывающих возможности разделения и концентрирования клеток различного происхождения методом ультразвукового продольного селектирования и концентрирования.
Исследования биологических систем на клеточном уровне организации, на уровне тканей и организма в целом связано с использованием ряда технических систем и методов, которые обеспечивают разделение и концентрирование клеток, и являются длительными и дорогостоящими (например, центрифугирование, электрофорез). Дальнейшее развитие этой области зависит не только от разработки новых, более совершенных методов концентрирования и разделения с помощью ультразвуковой техники, но и от изучения физических законов и процессов, лежащих в основе целого класса новых ультразвуковых методов как препаративного, так и диагностического назначения.
В медицинской диагностике ультразвук применяется для ускорения проведения серологических реакций, ускорения реакции агглютинации, проведения иммуносуспензионного анализа методом флуоресцирующих антител. Первичным механизмом перечисленных применений ультразвука является действие различных сил ультразвукового поля на клетки и частицы в суспензиях. Перераспределение клеток в объеме под действием сил, действующих на клетки в ультразвуковом поле, привели к развитию ряда
4 новых методов концентрирования и разделения клеток в поле стоячей ультразвуковой волны для медицинских, биотехнологических целей и для научных исследований в области биологии клетки.
Следует сказать, что акустическое управление отдельными (или немногочисленными) частицами является широкой областью исследования, с возможными практическими приложениями, например, в микроскопии [Hertz Н.М. 1995, Wu J. 1991], приготовлении образцов [Holwill I.L., et al. 1995], биотехнике [Takeuchi М., Yamanouchi К. 1994], микромеханической обработке [Kozuka Т., et. al. 1995, 1996] или космических технологиях [Collas P., et al. 1989].
Крайне важным при работе с клетками в ультразвуковых полях является исследование механизмов (кавитационного, теплового и механического) биологического действия, ультразвука для определения функционального состояния клеток и выделения клеток в нативном виде. В зависимости от интенсивности ультразвука может преобладать один из механизмов. Поэтому важно провести оценки вкладов каждого из перечисленных факторов при формировании физических и биологических эффектов.
В терапевтическом диапазоне интенсивностей необходимо обращать основное внимание на изменение функционального состояния клеток под действием механических факторов воздействия: пондеромоторных сил, действующих в ультразвуковых полях на клетки, микротечений. При повышении интенсивности ультразвука рассматриваются тепловые факторы воздействия как преобладающие. При дальнейшем повышении интенсивности ультразвука рассматриваются в первую очередь кавитационные эффекты, как правило, приводящие к повреждению биологических систем по свободнорадикальному механизму и за счет образования мощных микротечений вблизи кавитирующих или осциллирующих микропузырьков.
В настоящее время существует ряд работ, которые посвящены рассмотрению действию сил на различные клетки и частицы в ультразвуковом поле [Coakley W.T. 1997, Hawkes J J., Coakley W.T. 2001, King L.V., 1934, Weiser A.H., Apfel R.E., 1984, , Kawasima Y., Yoshioka K., 1955]. Однако многие из них ограничиваются рассмотрением либо отдельных сил, либо теоретическими расчетами на основании литературных данных. До настоящего момента не проводилось анализа всех физических параметров (плотности, сжимаемости, скорости звука для большинства клеток и сред культивирования), влияющих на поведение клеток в стоячих ультразвуковых волнах. Для большинства клеток нет расчета сил, и полного анализа действия всех сил в поле стоячей ультразвуковой волны на клетки в суспензиях. Поэтому, большой интерес представляют исследования основных параметров объектов воздействия и сред культивирования, с помощью которых можно управлять процессом концентрирования и разделения клеток в ультразвуковом поле.
Цель работы.
Исследование сил, действующих на клетки в суспензии в поле стоячей ультразвуковой волны, и параметров действующего фактора, клеток и сред культивирования, определяющих величины этих сил в методах ультразвукового концентрирования и селектирования нативных клеток.
Основные задачи исследования:
Получение и анализ параметров, связанных с ультразвуком, с клетками и средами суспендирования, лежащих в основе процессов концентрирования и разделения клеток.
Расчет сил, действующих на клетки в стоячей ультразвуковой волне.
Теоретическое определение граничных условий для концентрирования и разделения клеток на основании рассчитанных сил.
Экспериментальное подтверждение полученных данных.
Проверка жизнеспособности клеток при воздействии на них ультразвукового поля.
Научная новизна.
Впервые исследован весь комплекс физических параметров, влияющих на динамику перемещения клеток различного вида в узлы или пучности ультразвукового давления в поле стоячей ультразвуковой волны под действием пондеромоторных сил. Мы выявили 15 существенных параметров относящихся как к клеткам и средам культивирования, так и к ультразвуку, как воздействующему фактору.
Проведен анализ действия сил на клетки в суспензиях, находящихся в поле стоячей ультразвуковой волны при различных средних плотностях энергий поля.
Рассчитаны силы радиационного давления, Стокса, Бьеркнеса, Бернулли и гравитационные силы применительно к клеткам, имеющим разную природу, размеры и физические параметры.
Найдены граничные условия, позволяющие подбирать условия для эффективного разделения и концентрирования клеток в камере для проточного селектирования.
Теоретически исследованы повреждающие факторы, которые могут возникнуть при концентрировании клеток в ультразвуковом поле. Показано, что основные повреждающие факторы, которыми могут являться акустические микротечения и образование сдвиговых напряжений, возникающих около клеток, не вызывают повреждений исследуемых клеток в исследованном нами диапазоне средних плотностей энергии и частот ультразвукового поля.
Практическая значимость работы. Результаты данного исследования могут быть использованы для разработки и оптимизации ультразвуковых методов быстрого выделения, сепарации и концентрирования клеток различного типа в суспензиях. Они могут найти применение в биологии, биотехнологии, молекулярной биологии, гидробиологии, экологии, медицинской диагностике.
Основные концепции и обзор методов ультразвукового разделения и концентрирования частиц в суспензиях
В настоящее время существует множество представлений об ультразвуковом разделении и концентрировании взвешенных частиц. Конкретная система может включать в себя использование стоячих или бегущих акустических волн, импульсный и непрерывный проточный режимы прокачки сред, любую из вышеупомянутых комбинаций, но все практические методы базируются на использовании радиационной силы. Кроме того, другие силы также могут быть использованы, в зависимости от устройства прибора ультразвукового селектирования. Эффект коагуляции частиц в стоячей ультразвуковой волне известен давно и был исследован многими авторами [Fittipaldi F., 1979, Johring А., 1995, Sollner К., Bondy С, 1936]. Вследствие действия радиационной силы частицы собираются в плоскостях, перпендикулярных к направлению распространения звука [Mantysalo М., Mantysalo Е., 2000].
Далее происходит концентрирование (агломерация) собранных частиц, вызванное акустическими силами. После выключения ультразвукового поля большие агломераты всплывают или оседают под действием силы тяжести. Этот метод, может быть, применим только для частиц, формирующих устойчивые агломераты, иначе агломераты разъединяются после прекращения действия ультразвукового поля.
Ламинарный поток, параллельный плоскостям сбора частиц, двигает их до выхода. Этот метод не требует агломерации частиц и дает возможность непрерывной работы. Однако, такой метод работает, если положение плоскостей сбора частиц (плоскости узлов) сохраняются устойчивыми. Так как скорость звука в жидкости значительно зависит от температуры, то длина звуковой волны и, следовательно, положения плоскостей сбора частиц изменяются с температурой, если действующая частота постоянна. Поэтому, для устойчивой работы устройств, работающих на основе указанного выше метода, требуется точная температурная стабилизация или подстройка частоты, чтобы компенсировать изменение скорости звука при длительной работе.
Ясуда и др. [Yasuda К., et al., 1995] создали акустический разделитель, имеющий только одну узловую плоскость (то есть разделитель с камерой размера вмещающую в себя только один узел давления). Они показали, что 90 % и более сфер полистирола в суспензии могли фракционироваться при помощи единственного капиллярного выхода, находящегося в зоне узла переменного давления. Мандралис, Гупта и Феке [Gupta S., Feke D.L., 1995, 2001] разработали аналогичный лабораторный разделитель, который был предназначен для фракционирования суспензий, содержащих различные типы частиц. В системе используется разница направления движения в звуковом поле (в узел или пучность давления) для частиц с разными размерами и акустическими свойствами (плотностью и сжимаемостью). Гупта и Доналд [Gupta S. and Donald L. Feke., 1995] разработали метод фракционирования для смешанных частиц, когда частицы сравнимы по плотности и показали, что частицы разделяются, если различаются их сжимаемости. Собански и др. [Sobanski М.А., et al., 2001] использовали систему, которая позволила манипулировать субмикронными частицами, используя стоячую ультразвуковую волну с частотой 4.5 МГц. Суспензия частиц находилась в стеклянной капиллярной трубке диаметром 1-2 мм. Мандралис и др. [Mandralis Z.I., Feke D.L., 1993, Mandralis Z.I., et al, 1994] трансформировали метод для фракционирования частиц, заключающийся в периодическом переключении между двумя резонансными частотами и синхронной сменой направления потока жидкости. При переключении частот (подбор частоты происходит в зависимости от размера частиц) и смене направления потока жидкости происходит разделение на крупные и мелкие частицы, которые в дальнейшем отбираются в отдельные емкости. Бродо [Brodeur Р.Н., 1994] исследовал акустическое разделение взвешенных волокон с помощью резонатора, работающего на принципе разделения, показанном на рис. 1.5. Полученные результаты могут быть применимы в целлюлозной и бумажной промышленности. Разделение частиц в постоянном акустическом поле, используя специально разработанный резонатор с плоскостями сбора частиц, расположенными под углом к направлению потока жидкости, демонстрировал Франк и др. [Frank A., et al., 1993] рис. 1.5
Следующий способ разделения частиц основан на перемещающихся (дрейфующих) акустических полях, с помощью которых достигают определенного перемещения частиц к некоторым областям в пределах камеры разделения. Сгущение суспензий. Суспензию расслаивают в поле стоячей ультразвуковой волны (УЗСВ) и смещают слои вдоль распространения УЗСВ. Этого можно достигнуть, медленно перемещая источник ультразвука. Такое дрейфующее поле может быть произведено суперпозицией двух бегущих навстречу волн, немного отличающихся по частоте. Этот метод был обсужден в работе Петерсона и др. [Peterson S., et al., 1986].
В методах, рассмотренных далее используют: 1) волновод с излучателями в обоих концах, возбуждаемыми на разных частотах; 2) один активный излучатель, который возбуждается с непрерывно меняющейся частотой и фиксированный отражатель; 3) излучатель, который работает на фиксированной частоте, а отражатель перемещается; 4) девиацию частоты и синхронизировано движущийся отражатель.
Разделитель клеток крови, использующий метод 2, был описан Петерсоном и др. [Peterson S., et al., 1986]. Витворз и др. [Whitworth G., et al., 1991] использовали методы 1 и 2, и дополнительно использовали импульсные ультразвуковые волны, дающие возможность прерывистого разделения частиц. Лучшие результаты в этом исследовании были получены первым методом. Устройство разделения с дрейфующим акустическим полем, как было описано в методе 2, создали Толт и Феке [Tolt T.L., Feke D.L., 1992, 1993]. Волновод был сделан в виде короткой цилиндрической трубы.
Изменение скорости ультразвука и сжимаемости в растворах и суспензиях
Прохождение звуковой волны через среду может служить одним из способов возмущения динамического равновесия благодаря сопровождающим этот процесс вариациям температуры и давления. Рассматриваемый ультразвуковой диапазон лежит в интервале частот от 104 до 109 Гц и выше, то есть охватывает около пяти порядков величины [Джон Штуер, 1977]. Измерение скорости звука, сжимаемости, плотности и поглощения позволяет изучить и оценить свойства водных сред, таких как растворы различных химические соединений, белков, суспензий клеток и липосом. Множество работ, например [Букин В.А., Девдариани А.К., и др., 1973, Зиновьев О.И., и др., 1977, Нематуллаев У., Белинский Б.А., 1971, Прозоров П., 1940, стр. 384-400, Харакоз Д., 1983, Fukada К.М. et al, 2000, Herzfeld K.F., 1930], посвящены распространению звука в жидких средах, адиабатической сжимаемости водных растворов, электролитов, сжимаемости белков и аминокислот, поглощению ультразвуковых волн. В 1987 г. Горелов [Горелов С.Е., 1987] исследовал скорость распространения ультразвука в клеточных суспензиях. Им были проведены измерения скорости звука в суспензиях соматических клеток и определены численные значения адиабатической сжимаемости и акустического импеданса клеток. Лырчиков [Лырчиков А.Г., 1988] исследовал скорость ультразвука в интактных и гемолизированных эритроцитах. Он показал, что скорость ультразвука в этих эритроцитах одинакова, что указывает на одинаковую гидратацию молекул гемоглобина в разбавленном растворе и в упакованном состоянии внутри эритроцита. Шунг и др. [Shung К.К., et al., 1982] изучали свойства эритроцитов в малом диапазоне температур до 25С.
В большинстве случаев измерение скорости и поглощения ультразвуковой волны производят в плоской волне, вследствие чего используем уравнения, относящиеся к плоской волне. С распространением ультразвуковой волны ее амплитуда уменьшается, что может быть связано с несколькими факторами, которые являются причиной затухания звука в жидкости. К ним относятся потери на трение, убыль плотности потока энергии волны вследствие увеличения поверхности, занимаемой фронтом волны, поглощение, вызываемое вязкостью и теплопроводностью (тепловые потери) и потери, связанные с динамическим равновесием (релаксация и рассеяние). Первые эффекты относятся к классической абсорбции. Не классическое (релаксационное) затухание включает диссипацию энергии звука при возмущении химического или физического равновесия, чувствительного либо к давлению, либо к температуре.
Итак, большинство исследований поведения клеток в поле стоячей ультразвуковой волны проводилось либо на модельных системах, которые не дают полного представления о действии сил на живые клетки, либо исследовалось действие силы радиационного давления и гравитации применительно к практическому применению фракционирования различных клеток и их агрегации, но не рассматриваются другие силы, которые могут возникнуть в исследуемых системах. При рассмотрении влияния параметров частиц и клеток на исследуемые силы, главным образом делается акцент на плотность и сжимаемость клеток. Однако, кроме этих параметров существует еще несколько важных управляющих параметров, влияющих на силы в ультразвуковом поле: скорость ультразвука в материале клеток и средах, вязкость суспензий, размер частиц, частота и интенсивность ультразвукового поля. Также необходимо рассмотреть метрологию применяемых ультразвуковых полей, так как величины применяемых интенсивностей или средних плотностей энергии могут существенно влиять на величины сил, действующих на клетки в полях бегущей и стоячей ультразвуковых волн.
Вопросы метрологического контроля наиболее важны при работе с ультразвуковыми источниками излучения. Без метрологического контроля источников, используемых в экспериментальной работе, анализ данных будет значительно затруднен. Во многих случаях трудно сказать, какие именно параметры ультразвукового поля влияют на возникающие эффекты.
Одним из важнейших параметров ультразвука является интенсивность, которая определяет природу первичных физических процессов (механических, тепловых, кавитационных) в биологических объектах, находящихся в ультразвуковом поле.
Ультразвуковое поле неоднородно, и локальные интенсивности для плоских излучателей могут превышать средние в несколько раз. При выборе параметров ультразвукового воздействия на конкретный объект исследования необходимо учитывать отношение пиковых интенсивностей к средним, пространственное распределение интенсивностей. Поэтому метрологический контроль воздействующего ультразвука важен. Имеется множество методов контроля ультразвуковых полей. Исмаель и др. [Ismael N., et al., 1998] для исследования ультразвукового поля использовали пьезокомпозитный преобразователь, над которым находилась водная поверхность. Затем гелий-неоновый лазерный луч подсвечивал водную поверхность и отражался, проходя через линзу, попадая в фокальную плоскость линзы. После чего, CDD камера, получая оптическое изображение, переводила его в компьютер, где строился трехмерный график распределения интенсивностей ультразвукового поля.
Блакей [Blakey J.R., 1998] измерял интенсивность ультразвука, генерируемого преобразователем с рабочей частотой 1.8 МГц. В работе использовался 0.5 мм акустический игольчатый гидрофон, с помощью которого сканировалась плоскость ультразвукового поля размером 64 64 точек на расстоянии 48 мм от излучателя. Полученные данные об амплитуде реконструировались с помощью специально написанного алгоритма. Белый и др. [Belyi V.N. et. aL, 1995] для изучения ультразвуковой волны с частотой 10 МГц, излучаемой пьезопреобразователем диаметром 20 мм, использовали автоматическую систему сканирования поля. Сигнал проходил через контроллер в компьютер для дальнейшего графического представления распределений интенсивностей в ультразвуковом пучке.
Эти методы обладают рядом серьезных недостатков: они либо интегральны (можно получить информацию только о средних интенсивностях, но не учитывают пространственное распределение локальных интенсивностей ультразвука), либо позволяют проводить только локальные измерения (термопары, термисторы, гидрофоны), либо требуют сложной и дорогостоящей аппаратуры, доступной ограниченному кругу исследователей (Шлирен-опти ческие системы).
Радиационное давление может быть измерено с большой точностью весовыми методами, и оно однозначно связано с параметрами акустического поля. Недостатком весовых методов измерения интенсивности ультразвука является зависимость показаний от формы фронта волн, падающих на отражающий рефлектор.
Измерения с помощью гидрофонов имеют недостаток, обусловленный конечностью их размеров. При этом они интегрируют акустическое давление по своей апертуре, а не измеряют его в точке [К. Хилл., 1989]. Измерения с помощью термопар применяется в калориметрических методах измерения. Термопара может дать картину локального измерения интенсивностей за счет разницы разогревов спаев при использовании дифференциальных термопар, один из спаев которой покрывается слоем звукопоглощающего материала. Однако для получения полной картины структуры ультразвуковых полей требуется длительное время для сканирования в различных сечениях ультразвуковых пучков. Кроме того, этим методом невозможно выявить тонкую структуру полей вследствие конечного размера термопар и поглощающего слоя. Поэтому, для определения тонкой структуры поля и точного определения локальных и средних интенсивностей в различных его точках был использован метод Пашовкина-Шильникова [Пашовкин Т.Н., Шильников Г.В., 2000] который лишен вышеперечисленных недостатков. Метод заключается в том, что в растворе красителя (например, метиленового синего) помещают индикаторную пластину, в качестве которой используется бумага. В растворе возбуждается ультразвук, и через несколько секунд или минут, в зависимости от интенсивности ультразвука, на индикаторной пластинке появляется изображение распределения интенсивности. Вследствие увеличения скорости диффузии молекул красителя в материал индикаторной пластины, различной в разных точках поля, получают изображение, и по полученному изображению наблюдают распределение интенсивности.
Параметры необходимые для расчета сил, действующих в ультразвуковом поле на клетки в суспензии
Фиксированный объем суспензии клеток V высушивался до постоянной массы и взвешивался на весах высокой точности до 3 после запятой. Размер (радиус и объем) клеток получали фотографическим методом, описанным в материалах и методах. Затем вычисляли объем клеток на основании формул для объема шара (формула 3.2) (для клеток дрожжей) и объема цилиндра (формула 3.3) (для эритроцитов). В результате получили данные о плотностях, радиусах и объемах для клеток дрожжей, эритроцитов морской свинки и крысы (Таблица 1). 3.2.2 Скорость звука е материале клеток и их сжимаемости
Измерения скорости ультразвука в суспензии клеток проводились при температуре 25С резонаторным методом, который основан на измерении собственной частоты выбранной гармоники колебаний акустического резонатора, образованного объемом исследуемой суспензии.
Для определения каждого значения проводилось от пяти и выше независимых экспериментов. Для определения концентрационных зависимостей скорости ультразвука, клетки ресуспендировались в буферах, соответствующих каждому типу клеток. Объем пробы составлял 1 мл. После измерения скорости ультразвука концентрация клеток пересчитывалась и, таким образом, исключалась ошибка разведения. Скорость ультразвука измерялась на трех ближайших пиках, расстояние между которыми не превышало 166 кГц. На рисунках 3.4-3.6 приведены концентрационные зависимости скорости ультразвука клеток в суспензиях (дрожжи, эритроциты морских свинок и крыс). Из рисунков видно, что зависимость приращения скорости ультразвука от концентрации клеток в диапазоне измеренных концентраций линейна для всех типов исследуемых клеток (коэффициент корреляции графиков линейной регрессии для всех типов клеток 0.95).
При включении ультразвука в поле стоячей волны на клетки действует радиационная сила. Клетки начинают двигаться с некоторой скоростью. В статическом режиме (без протока сред культивирования) клетки из всего объема концентрируются в узлах или пучностях переменного давления за время, определяемое скоростью расслаивания клеток. Скорость расслаивания клеток в ультразвуковом поле необходимо знать для оценки величины силы Стокса, которая возникает при движении клеток под действием радиационной силы.
Для определения скорости движения клеток в ультразвуковом поле была использована кварцевая камера толщиной 3.102 мм и ультразвуковой излучатель, работающий на частоте 2.64 МГц, при средней плотности энергии 6.6 дДж/см . Измеряли время движения клеток от положения покоя (выключенный излучатель) до узла давления (включенный излучатель) при различных концентрациях суспензий. Время определялось по кинетике расслаивания, как время достижения максимального просветления суспензии. Рис. 3.7. a-i Расслоение клеточных суспензий в поле стоячей ультразвуковой волны, d-f - клетки дрожжей (2.64 МГц) и g-i - эритроциты крысы (0.88 МГц). При расчете скорости движения клеток в суспензии имелось в виду, что среднее расстояние, которое клетка проходит от положения покоя до узла давления равно четверти длины волны (У4).
На рисунке 3.7 a-i можно увидеть и сравнить процесс расслаивания разного типа клеток при разных частотах, d-e-f- клеток дрожжей (2.64 МГц) и g-h-i - расслаивание эритроцитов крыс на частоте 0.88 МГц. Клетки собираются в узлах звукового давления и, так как при частоте 0.88 и 2.64 МГц длины волн различны, видно, что расположение клеток в поле стоячей ультразвуковой волны существенно отличаются.
В результате работы были получены концентрационные зависимости скорости движения клеток в стоячей ультразвуковой волне частотой 2.64 МГц. На рисунках 3.8-3.10 показаны зависимости скорости расслаивания клеток от концентрации. Видно, что для эритроцитов крыс скорость расслаивания достигает минимального значения и выходит на плато при концентрации 4 107/мл и составляет 8 мкм/с.
Для эритроцитов морских свинок и клеток дрожжей скорость расслаивания клеток сначала уменьшается, а затем постепенно увеличивается в зависимости от концентрации. Минимум скорости для эритроцитов морских свинок - при концентрации 5 х 106/мл, для клеток дрожжей -2 х Ю7/мл и составляет 6 мкм/с и 11 мкм/с соответственно.
Разброс средних значений может быть обусловлен как неточным разведением клеток в суспензии, так и недостаточно точным нахождением времени максимального просветления. Постепенное увеличение скорости расслоения для эритроцитов морских свинок и дрожжей, объясняется тем, что при увеличении концентрации клеток в узле давления становится все больше, места все меньше и движение клеток постепенно прекращается. Многие клетки останавливаются, так и не достигая узла или пучности звукового давления.
Так же видно, что точкой перегиба в зависимости для всех клеток является концентрация 107 кл/мл. Это говорит о том, что эта концентрация клеток является оптимальной для работы. Более высокая концентрация клеток в суспензии не желательна, так как может произойти изменение физических свойств суспензии, например, такой как вязкость. Зная скорость расслоения клеток, мы можем вычислить силу Стокса (FS2) для случая, когда отсутствует проток среды через камеру.
Возможно, что сходный характер изменения скорости для эритроцитов морской свинки и дрожжей можно объяснить практически одинаковой плотностью клеток. Плотность является одной из важнейших величин, от которых зависит радиационная сила, приводящая в движение клетки, находящиеся в поле стоячей ультразвуковой волны.
Распределение клеток и кавитационных пузырьков в ультразвуковом поле
Nyborg (1983) отметил, что микропузырьки больше резонансного размера мигрируют к минимуму давления на поверхности, в то время как микропузырьки, размер которых меньше резонансного, мигрируют к максимуму давления Шутилов [Шутилов В. А., 1980]. Конечное распределение микропузырьков в пучностях колебательного давления было подтверждено Пашовкиным Т.Н. при использовании двух методов регистрации распределений интенсивностей в сечениях ультразвуковых пучков: теневого метода регистрации микропузырьков и метода краска/бумага, регистрирующего распределение интенсивностей (рис. 3.31, 3.32) [Watmough D.J., et al., 1993, Пашовкин Т.Н.]. Посмотрим, как в наших экспериментах будут располагаться клетки и микропузырьки в ультразвуковом поле. Чтобы увидеть, куда именно будут двигаться клетки, и где они будут скапливаться со временем при включении ультразвукового поля, мы поместили на излучатель частотой 0.88 МГц чашку Петри диаметром 5 см.
Выбранная нами частота 0.88 МГц обуславливается более резким и наглядным рисунком распределения интенсивностей, чем для частоты 2.64 МГц, и более низким порогом кавитации. Из рисунков 3.33 а-б. видно, что клетки двигаются и скапливаются в темных областях (областях окрашивания краской). Обрасти окрашивания, являются местами, в которых при включении ультразвукового поля начинается диффузия частиц краски на бумагу. А так как движение частиц в ультразвуковом поле происходит из-за силы радиационного давления, области скопления клеток и диффузии частиц закономерно совпадают.
Это лишний раз подтверждает теорию о том, что клетки двигаются в узлы ультразвукового давления под действием силы радиационного давления.
На рисунке З.ЗЗе видно распределение клеток и пузырьков газа, образующегося при включении ультразвукового поля. Можно заметить, что местоположение клеток и газовых пузырьков не совпадает. Клетки находятся в темных областях, газовые пузырьки в светлых областях. Таким образом, вероятно, можно исключить повреждение клеток газовыми пузырьками.
Известно, что пузырьки в ультразвуковом поле вызывают неоднородные движения жидкости в непосредственной близости от пузырька [14]. Образующиеся высокие градиенты скоростей могут вызывать значительные сдвиговые напряжения на границах раздела двух сред. Однако, при отсутствии кавитации, не могут ли клетки сами являться источником возникновения сдвиговых напряжений. Рассмотрим акустические течения, а так же возникающие сдвиговые напряжения в исследуемых клеток.
Радиационная сила вызывает движение не только частиц, находящихся в ультразвуковом поле, но и жидкости или газа в котором располагаются эти частицы. Такой вид движения жидкости или газа называется акустическим течением. При включении ультразвукового поля происходит ускорение частиц среды, приводящее к установлению стационарного движения жидкости. Такое течение называется эккартовским, и происходит без наличия препятствий в жидкости для распространения звука, поэтому рассматриваться не будет. К течениям около препятствий (например, клеток) относятся релеевское и шлихтинговское акустические течения. Второй вид течений возникает вне пограничного слоя между двумя стенками. Его масштаб больше размера вихрей в пограничном слое, а сами вихри имеют размер порядка длины волны X.
