Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 19
ГЛАВА 1. Применение электрофизических методов анализа клеточных суспензий для решения прикладных биологических задач 19
ГЛАВА 2. Методы определения ферментативной активности целых клеток 42
ГЛАВА 3. Методы идентификации микроорганизмов в экологическом мониторинге 53
Собственные исследования 71
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 71
ГЛАВА 5. Электрофизический анализ клеточных суспензий при метаболизме пара-нитрофенола 85
ГЛАВА 6. Использование электрооптических свойств клеточных суспензий для разработки микробных биосенсорных систем анализа низкомолекулярных соединений 99
6.1. Разработка сенсорных систем определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью электрооптического анализа 102
микробных клеток P. putida С-11, P. putida БА-И и A. calcoaceticum А-122
6.2. Сравнительное исследование электрооптических свойств 121
микробных суспензий и их респираторной активности для определения инсектицидов мегафоса и сумитиона
ГЛАВА 7. Электрофизические свойства микробных клеток Е. coli при метаболизме глюкозы. Ингибирование ферментативной активности клеток при метаболизме глюкозы 134
7.1. Электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12 при метаболизме глюкозы. Влияние химических ингибиторов на метаболизм глюкозы 135
7.2. Влияние температуры и рН среды на электрооптические характеристики клеточной суспензии Escherichia coli К-12 при метаболизме глюкозы 149
ГЛАВА 8. Влияние антибиотиков на электрооптические свойства микробных суспензий Escherichia coli 156
8.1. Влияние Р-лактамных антибиотиков на электрооптические свойства микробных суспензий E.coli 159
8.2. Влияние хлдорамфеникола на электрооптические свойства микробных суспензий Е. col i178
8.3. Изучение электрофизических свойств микробных клеток 195 Е. coli при комбинированном действии антибиотиков
ГЛАВА 9. Определение микробных клеток с помощьюэлектрооптического анализа клеточных суспензий при специфическом взаимодействии микроорганизмов с биоселективными агентами 207
9.1. Изучение электрооптических свойств микробных суспензий Listeria monocytogenes при специфическом взаимодействии с моноклональными антителами 208
9.2. Изучение электрооптических свойств микробных суспензий Azospirillum brasilense Sp7 при взаимодействии с поликлональными антителами 221
9.3. Изучение электрофизических свойств микробных клегок Е. coli XL-1 при их инфицировании фагом М13К07 234
Заключение 246
Выводы 275
Список использованных литературных 278
Источников
Приложения
- Применение электрофизических методов анализа клеточных суспензий для решения прикладных биологических задач
- Электрофизический анализ клеточных суспензий при метаболизме пара-нитрофенола
- Разработка сенсорных систем определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью электрооптического анализа
- Электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12 при метаболизме глюкозы. Влияние химических ингибиторов на метаболизм глюкозы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема изучения метаболической активности микробных клеюк и их индикации актуальна для различных областей прикладной микробиологии и биотехнологии. Вопросы детекции клеток и определения активности их ферментативных систем тесно взаимосвязаны. Это обусловлено тем, что при детекции микроорганизмов обычно решаются несколько основных вопросов: индикация микроорганизма, определение количества клеток и оценка активности ферментативных систем микроорганизма, что при определенных условиях може і служить показателем жизнеспособности клеток [Ivnitski et al., 1999]. Вместе с тем, определение метаболической активности микробных клеток может являться и независимой задачей, которая находит свое приложение, как в микробиологических производствах, так и в медицинской микробиологии.
Одними из наиболее удобных подходов для экспрессной оценки морфологических и физиологических параметров клеюк являю і ся электрофизические (ЭФ) методы, к которым относится метод ориентации клеток в переменном электрическом поле [Мирошников с соавт., 1986; Бунин, 1996].
Изменения электрофизических свойств клеток при микробном метаболизме могут быть обусловлены несколькими различными процессами, протекающими в клеіках как по отдельности, так и одновременно. Такими процессами могут являться: транспорт субсірага в клетку, его ферментативная трансформация в клетке, дейсівие изучаемого соединения на клеточный метаболизм и т.д. Важное значение при данных исследованиях имеют свойства изучаемого соединения, его способность участвовать в ферментативном катализе у клеток исследуемого
7 микроорганизма, возможное токсическое действие на изучаемые клетки и пр.
Микробная деградация низкомолекулярных токсичных соединений представляет значительный интерес, поскольку лежи і в основе биотехнологических способов очистки токсичных выбросов и может бьпь использована для создания биокаталитических технологий синтеза ряда токсичных веществ [Карасевич, 1982]. При этом в большинстве случаев для изучения метаболической активности микробных клеток используют методы, основанные на количественном определении продукта или субстрата ферментативной реакции с использованием меченых соединений, фотометрии, хроматографии и т.д. Такие исследования обычно проводят в несколько этапов и характеризуются относительной сложностью анализа, требуют дорогостоящего оборудования и реагентов [Кулис, Разумас, 1986; West, Sparting, 1986; Knowng, Govind, 1994]. Применение электрооптического анализа микробных суспензий позволит не только регистрировать метаболическую активность микроорганизмов, проводить количественное определение соединений, являющихся субстратами ферментативной реакции, но и при определенных условиях проводиіь сравнительное изучение путей метаболизма определенных субстратов у бактерий.
Другим аспектом исследований являеіся изучение электрооптических свойств микробных суспензий при действии на клетки различных ингибиторов метаболической активности. Ингибиторами могут служить вещества, традиционно применяемые в биохимических исследованиях, а также различные антибиотики. Это направление имеет значительный потенциал и может привес і и к созданию нового подхода для экспрессного определения чувсівительности микроорганизмов к антибиотикам.
Создание методологии для быстрого обнаружения микроорганизмов в окружающей среде является одной из важных проблем современной биотехнологии в связи с существующей опасностью террористических угроз, наличием в окружающей среде возбудителей опасных инфекций и т.д. [Walt, Franz, 2000; Deisingh, Thompson, 2002]. Наиболее часто способность антител (Ат), меченных различными маркерами, образовывать комплекс с соответствующими антигенами используется для решения биосенсорных методов детекции клеток [Keith, 2000; Vaughan, 2001 и др.]. При этом электрофизические методы могут значительно упростиіь и облегчить задачу детекции микроорганизмов с помощью моноклональных или поликлональных антител.
Наряду с применением антител для определения микроорганизмов могут быть использованы бактериофаги, которые обладают определенной селективностью взаимодействия с клеточной поверхностью и являются достаточно точными индикаторами, определяющими видовую и типовую принадлежность бактерий [Kristensen, Winter, 1998; Sieber, 1998].
Цель работы - развише методологии электрооптического анализа микробных суспензий для определения метаболической акіивности клеток и их детекции.
Задачи исследования
Разработка методических приемов для определения метаболической активности при катаболизме низкомолекулярных соединений у микроорганизмов с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.
Сравнительное изучение путей метаболизма юксичных низкомолекулярных соединений у микроорганизмов, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительною
9 метаболизма, с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.
3 Создание нового метода определения токсичных низкомолекулярных соединений на основе измерения электрофизических свойств микробных клеток, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма.
Исследование изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при метаболизме нетоксичных низкомолекулярных соединений в микробных клетках Escherichia coli при ингибировании их ферментативных систем на примере метаболизма глюкозы.
Развитие методических подходов определения антибиотикочувствительности микробных клеток с помощью метода электрооптическою анализа клеточных суспензий на примере Р-лактамных, аминогликозидных антибиотиков, тетрациклина и хлорамфеникола. Изучение синергетического антимикробного эффект антибиотиков на примере канамицина и іетрациклина с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
Разработка методических подходов индикации бактерий при взаимодействии со специфическими антителами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
Изучение возможности определения бактерий при их инфицировании специфическими бактериофагами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Изучение зависимости изменений электрооптических параметров клеточных суспензий Е. coliXL-X при их инфицировании бактериофагом М13К07.
Исследование изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при взаимодействии с биоселективными агентами (антителами и бактериофагами) в присутствии посторонней микрофлоры.
10 Научная новизна работы
Впервые показана возможность использования электрооигического анализа суспензий клеток для сравнительного изучения пуіей метаболизма низкомолекулярных соединений на примере метаболизма пара-нитрофенола (ПНФ). Нами установлено, чго электрофизические свойства микробных клеток, способных утилизировать ПНФ, значительно изменяются в процессе метаболизма этого соединения. Установлена взаимосвязь активности ферментов подготовительного метаболизма низкомолекулярных соединений и изменений злекірооптических параметров клеточных суспензий при их метаболизме. Установлено, что ингибирование метаболических процессов в микробных клетках Е coli при метаболизме глюкозы приводит к изменениям электрооптических параметров клеточных суспензий и их респираторной активности, что подтверждает зависимость элекгрофизических свойств клеток от процессов метаболизма.
Впервые проведено определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона в водных растворах с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий клеток штаммов, обладающих специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма этих соединений. Установлена зависимость изменений электрофизических свойств микроорганизмов от процессов метаболизма низкомолекулярных токсичных соединений и концентрации субстрата.
Впервые предложен способ определения чувсівительности микробных клеток к действию Р-лактамных, аминогликозидных антибиотиков, тетрациклина и хлорамфсникола с помощью меюда электрооптического анализа клеточных суспензий. Нами установлено, что электрооптические свойства микробных суспензий при действии Р-лактамных антибиотиков у чувствительных и резистентных штаммов
E coli коррелируют с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам. Исследованы изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при воздействии на них антибиотиков, являющихся ингибиторами белкового синтеза и обладающими как бактерицидным, так и бактериостаїическим эффектом воздействия на микробные клетки. Изучены изменения электрооптических параметров клеточных суспензий при совместном действии канамицина и тетрациклина. Показана возможность изучения синергидного действия антибиотиков на микробные клетки с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
Впервые показана возможность создания нового типа биосенсорной системы для определения микробных клеток при специфическом взаимодействии как с моноклональными, так и с поликлональными антителами. Показана возможность индикации бактерий при взаимодействии со специфическими антителами в присутствии посторонней микрофлоры с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.
Впервые показана возможность определения бактерий, инфицированных специфическими бактериофагами, с помощью регистрации изменений электрофизических свойств микробных клеток. Изучена зависимость изменений электроопгических параметров клеточных суспензий Е. coli XL-1 при инфицировании бактериофагом М13К07 в зависимости от количества внесенного фага и от времени инкубации клеток с фагом. На основании изучения взаимодействия микробных клеток Е. coli XL-1 и колибактериофага М13К07 показана возможность использования электрооптического анализа клеточных суспензий для изучения процесса инфицирования бактериофагом микробных клеток. Показана возможность индикации бактерий при их инфицировании
12 бактериофагом в присутствии посторонней микрофлоры с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.
Практическая значимость
Разработана методология определения метаболической активности микробных клеток в процессе каїализа токсичных и нетоксичных соединений в микробных клетках, основанная на измерении электрооптических параметров суспензий клеток.
Разработан новый способ индикации и количественного
определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов
метафоса и сумитиона с помощью метода электрооптического анализа
клеточных суспензий штаммов-деструкторов, способных
метаболизировать определяемые субстраты.
Предложен новый подход для определения чувствительности микробных клеток к действию антибиотиков на основе измерения электрофизических свойств микробных клеток. Показана возможное і ь использования метода электрооптическою метода анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного действия антибиотиков.
Предложен новый метод индикации микробных клеток в водных растворах при взаимодействии со специфическими моноклональными и поликлональными антителами с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.
Разработан метод определения бактерий при их инфицировании специфическим бактериофагом с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Установлена зависимость изменений электрооптических параметров клеточных суспензий при их инфицировании бактериофагами от количесіва внесенного фага и от времени инкубации клегок с ним.
13 Разработан способ количественного определения метафоса и пара-нитрофенола в водных растворах, на который получен патент Российской Федерации (№2175352 заявл. 11.05.2000, опубл. 27.10.2001 бюлл. №30 / Гулий О.И., Игнатов О.В., Щербаков А.А., Игнатов В.В.).
Материалы, представленные в диссертации, используются при обучении студентов и аспирантов на кафедре биохимии и биофизики, кафедре микробиологии и физиологии растений биологического факультета, кафедре нелинейной физики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре микробиологии и ветсанэкспергизы, кафедре биотехнологии, органической и биологической химии Саратовского государственного аграрного университет им. Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработан комплекс методических приемов для определения метаболической активности микробных клеток при катаболизме низкомолекулярных соединений с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий. Показана взаимосвязь изменений элекгрооптических параметров клеточных суспензий при метаболизме ряда соединений с активностью ферменгов подготовит ел ьної о метаболизма. Проведено сравнительное изучение электрооптических свойств клеточных суспензий микроорганизмов, обладающих различными ферментативными системами подготовительного метаболизма пара-нирофенола (через гидрохинон или 4-нитропирокатехин).
Установлено, что ингибирование метаболических процессов в микробных клетках Escherichia coli при метаболизме глюкозы приводит к изменениям электрооптических параметров клеточных суспензий и их респираторной активности.
3. Разработан принцип действия биосенсорной системы для
определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов
метафоса и сумитиона с помощью электрооптического анализа клеточных
суспензий, обладающих специализированными фермешативными
системами подготовительного метаболизма определяемых соединений.
Разработан принцип использования метода электрооптического анализа клеточных суспензий для определения чувствительности микробных клеток к действию антибиотиков, обладающих бакіерицидньїм и бактериостатическим эффектом воздействия на микробные клетки. Установлено, что электрооптические свойства микробных суспензий при действии р-лактамных антибиотиков на чувствительные и резистентные штаммы Е coli коррелируют с наличием плазмид устойчивости к данным антибиотикам. Показана возможность использования метода электрооптического анализа микробных клеток для регистрации синергетического антимикробного эффекта антибиотиков.
Разработан метод использования электрооптического анализа клеточных суспензий для определения микробных клеюк в водных растворах при их взаимодействии со специфическими моноклональными и поликлональными антителами.
Разработана схема использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения бактерий при их инфицировании бактериофагом.
Установлена возможность использования электроопгического анализа для индикации бактерий при их взаимодействии с антителами и бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.
Работа выполнена в лаборатории электрофизиологии клетки (ЛЭК) Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в рамках бюджетной темы: «Исследование
15 электрофизических свойств микроорганизмов» 2001-2005 гг. Номер государственной регистрации 11.200.117783.
Данная работа получила финансовую поддержку грантов: Президента РФ для молодых докторов наук № 01-04-99421, Международного научно-технического фонда (МНТЦ) проекты 615; 3170 PDG; «Фонда содействия отечественной науке» - 2004-2006 гг.; фонда CRDF грант REC-006 - 2003-2006 гг.; программы «Фундаментальные исследования и высшее образование», грант Y1-P-06-09 - 2003-2006 гг.; проіраммьі «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы», проект Д4169; Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» подпрограммы "Развитие инфраструктуры научно-технической и инновационной деятельности высшей школы и ее кадрового потенциала, «индивидуальный код» 4198 -2005г.; NATO Collaborated Linkage Grant CBP.NR.NRCLG 981615 - 2005-2006 гг.; Европейской Академии наук - 2005г.; Федерального агентства по науке и инновациям по приоритетному направлению "Развише инфрасіруктурьі" в рамках ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы по мероприятию 1.9 "Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки, высоких технологий и образования" контракт № 02.442.11.7153, шифр работы: 2005-РИ-19.0/002/171 - 2005 г.; Президента РФ для молодых кандидатов наук МК-8599.2006.4 - 2006 г.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на всероссийских и международных симпозиумах и конференциях: Euroconference "Bacterial-Material/Radionuclide Interaction", Rossendor/Dresden, Germany, 1998;
научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И. Вавилова по итогам научно-исследоваїельской и учебно-методической работы за 1999 год, Саратов, 1999; 9lh European Congress on Biotechnology, Belgium, 1999; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития Волжского региона", Тверь, 2000; International Symposium on Environmental Biotechnology 2000, Kyoto Japan, 2000; семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2000, Пущино, 2000; международной научной конференции "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон", Санкт-Петербург, 2000; научной конференции, посвященной двадцатилетию создания ИБФРМ РАН, Саратов, 2000; международной научно-практической конференции "Проблеми I перспективи очищення та повторного використання води", Харьков, 2000; научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2000 год, Саратов, 2001; 5-ой Путинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2001; всероссийской конференции "Фундаментальные и прикладные аспекіьі функционирования водных зкосисіем: проблемы и перспективы гидробиологии и ихтиологии в XXI веке", Саратов, 2001; всероссийской заочной конференции "Перспективы развижя Волжского региона", Тверь, 2001; семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов биотехнологии-2001, Пущино, 2001; всероссийской конференции «Экологизация подготовки специалистов в вузах. Утилизация и переработка отходов», Саратов, 2001; первой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 2002; 6-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2002; всероссийской заочной конференции "Перспективы развития
17 Волжского региона", Тверь, 2002; 2-ой международной конференции "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон", Санкт-Петербург, 2002; международной конференции "Biotechnology and food 2003", Zagreb, Croatia, 2003; 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2003; международной конференции "Enzymes in the environment: activity ecology and applications 2003", Prague, Czech Republic, 2003; отчетной конференции по итогам НИР 2003 года Инстиіут биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 2004; итоговой конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ, Саратов, 2004; международной конференции «The 6 Workshop on biosensors and bioanalytical ц-techniques in environmental and clinical analysis», Rome, Italy, 2004; конференция молодых ученых НОЦ, Саратов, 2005; 9-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, 2005; всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаменіальньїе и прикладные аспекты», Саратов, 2005; международной конференции «13th International biodeterioration and biodegradation symposium», Madrid, Spain, 2005; международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; международной конференции «4th International Conference instrumental methods of analysis IMA », Greece, 2005.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 56 рабо і, в і ом числе получен 1 патент Российской Федерации, 21 статья и 34 тезисов докладов, список которых приведен в конце автореферата.
18 Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 5 глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 363 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 317 страницах компьютерною іекста, включающего 67 рисунков и 4 таблицы.
Применение электрофизических методов анализа клеточных суспензий для решения прикладных биологических задач
Развитие работ по отдельным разделам злекірофизики клетки началось еще в середине прошлого века. Систематическое изучение этих вопросов относится к 30-м годам прошлого столетия, когда стали изучать одну из электрических характеристик клеток - поверхностный заряд. Позднее, в 60-е годы, появились работы по изучению диэлектрической проницаемости и электропроводности тканей, клеток и клеточных органелл.
Последние годы характеризуются повышенным интересом к электрическим характеристикам клеток в связи с тем, что, во-первых, существует тесная связь электрических характеристик клеток с процессами жизнедеятельности; во-вторых, измерение этих характеристик можно проводи іь бьісіро и без нарушения жизнедеятельности, ЧТО ПОІВОЛЯЄІ исследовать процессы, протекающие в клетках в динамике; в-третьих, разные электрические параметры характеризуют различные структурные элементы клетки (так, например, заряд определяется физико-химической структурой и строением клеточной поверхности и составом окружающей среды; диэлектрическая проницаемость и электропроводность связаны не только с поверхностными, но и с внутренними физико-химическими свойствами клеток и отдельных структур; поляризуемость определяется химическим составом и строением отдельных клеточных структур и параметрами примембранного слоя).
Необходимость развития теории электрофизики клетки была вызвана тем, что при интерпретации результатов электрофизических исследований часто использовались закономерности физической химии. Однако, простое перенесение закономерностей, полученных для небиологических чаешц, не всегда давало удовлетворительное объяснение результатов при исследовании электрофизических свойств клеток. Большое количество работ по теоретическому обоснованию электрофизических двухфазных и многофазных моделей клеток и по методам экспериментального измерения злекірофизических характеристик клеток (микроэлектрофорезу, диэлсктроскопии, электрооптике) обобщены в книге Мирошникова А.И. с соавторами [Мирошников с соавт., 1986].
Работы в области изучения электрофизики клетки можно разделить на несколько групп: 1. изучение электрических характеристик клеток и клеючных струкіур: заряда, электропроводности, поляризуемости, диэлектрической проницаемости, а также исследование взаимосвязи этих характеристик с функциональными и видовыми особенностями клеток; 2. изучение реакции клеток на внешние физические и химические воздействия по изменению их электрических характеристик; 3. разработка теореіических вопросов для интерпретации экспериментальных данных; 4. создание современных автоматизированных приборов и новых меіодических подходов к исследованию электрофизических свойств клеток; 5. использование электрических характеристик в биологических и медицинских исследованиях для экспресс-анализа в микробиологической промышленности.
Задача препаративного разделения клеток была и остается акіуальной при решении самых разнообразных общебиологических и медицинских проблем. Наибольший интерес представляют те методы, которые позволяют производить разделение по биологическим признакам, не оказывая неблагоприятного воздействия на клетки. Один из таких методов - это электрофорез в свободном потоке или препаративный клеточный электрофорез, в котором параметром разделения является заряд. В некоторых странах уже начали выпускать современные автоматизированные приборы препаративного разделения клеток, которые находят успешное применение, как для разделения смесей белковых макромолекул, так и для разделения гетерогенных популяций клеток крови, микроорганизмов [Hanning, 1982].
Определение электрофоре гической подвижности клеток, на основании которой судят о видовых и функциональных особенностях клеток в норме и патологии, используется для исследования и диагностики в гематологии, иммунологии, онкологии. В микробиологии клеточный электрофорез применяют при исследовании развития микробных культур [Hill et al, 1963; Plummer and James, 1961; Plummer et al., 1962], воздействия антибиотиков на микробные клетки [Marshall et al, 1971; McQuillen ,1951], адсорбции полиэлектролитов и ПАВ [Bush, Stumm, 1968; Фомченков с соавг., 1983; Иванов и Фомченков, 1989], инактивации микроорганизмов физическими и химическими воздействиями [Schott 1977; Фомченков с соавт., 1990].
Что же касается таких методов, как электроориентация, диэлектрофорез, электроротация, электрооптика, используемых для оценки физиологического состояния клеток, ю соответствующие приборы пока еще серийно не выпускаются, и исследования проводятся на экспериментальных установках.
Поскольку все вещества, в том числе и биологические, содержат свободные и связанные заряды, при наложении электрического поля в веществе наблюдается два вида процессов. Один из них - перемещение (дрейф) свободных зарядов (электронов и ионов) сквозь толщу вещества от одного электрода до другого представляет собой ток проводимое і и. Другой процесс состоит в том, что связанные заряды под действием внешнего поля смещаются в некоторых допустимых, но ограниченных пределах, вызывая токи смещения и появление наведенного (индуцированного) электрического момента.
Электрофизический анализ клеточных суспензий при метаболизме пара-нитрофенола
Процесс микробной деградации ПНФ представляет значительный интерес, поскольку лежит в основе биотехнологических способов очистки токсичных выбросов и может быть использован для создания биокаталитических технологий синтеза ряда токсичных веществ [Карасевич, 1982]. Поэтому изучению процесса деградации данного соединения посвящено относительно много работ, например, [Spain, Gibson,1991; Rokesh etal., 1994; Jain etal., 1994].
В большинстве случаев для изучения метаболических процессов, происходящих в микробных клетках, используют стандартные методы, такие как использование меченых соединений, фотометрия, хроматография и т.д. Данные методы характеризуются сложностью проведения анализа, требуют дорогостоящего оборудования и реагентов. В последние годы был выполнен ряд работ по изучению влияния процессов метаболизма различных субстратов на электрофизические свойства (ЭФ) клеток [Ignatov et al., 2002]. Известно, что процессы ферментативного катализа, протекающие в бактериальной клетке, сопровождаются перераспределением зарядов внутри клетки и, следовательно, могут приводить к изменению ее электрофизических свойств [Мирошников с соавт., 1986]. Исследование электрооптических (ЭО) характеристик микробных суспензий используется для решения ряда биотехнологических проблем [Мирошников с соавт., 1986; Иванов и Фомченков,1989; Bunin and Voloshin, 1996; Ignatov et al., 2000]. ЭФ свойства микробных клеток могут являться параметром, изменение которого свидетельствует о метаболических процессах, происходящих в клетке. Мы предположили возможность использования электрооптического метода анализа клеточных суспензий для изучения путей метаболизма ПНФ в микробных клетках. Это связано с рядом достоинств элекгрооптического метода анализа, что обусловлено тесной связью электрофизических свойств биообъектов с их структурой (в частности, с процессами жизнедеятельности клеток), а также возможностью проведения исследований, не повреждая и не разрушая клетки и ткани, определение может быть осуществлено в минимальных объемах и т.п. [Мирошников с соавг., 1986].
Основные принципы электрооптического анализа заключаются в следующем. Воздействие внешнего электрического поля на клеточную суспензию вызывает появление на клетках индуцированного дипольного момента, связанного с перераспределением их объемных и поверхностных зарядов. Взаимодействие этого поля с индуцированным (и/или, возможно, с присущим клеткам постоянным) диполем приводит к некоторой упорядоченности в ориентации клеток и, как следствие этого, к изменению оптических свойств клеточной суспензии (то есть к электрооптическому эффекту). Регистрируя изменение интенсивности рассеянного (или ослабление прямо прошедшего) пучка света, можно количественно охарактеризовать степень пространственной упорядоченности клеток и, в ряде случаев, оценить их электрофизические и морфометрические характеристики [Брезгунов с соавт., 1984]. Преимуществами предлагаемого метода является комплексное развитие методических подходов для экспрессного мониторинга метаболических процессов, происходящих в микробных клетках, с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.
Известны микроорганизмы, утилизирующие ПНФ в качестве единственного источника углерода и энергии. Способностью к деградации ПНФ обладают микроорганизмы многих родов Pseudomonas, Flavobacterium, Xantomonas, Artrobacterium, Achrobacterium. Такая способность микроорганизмов обусловлена наличием в клетках определенных ферментов подготовительного метаболизма, способных превращать данное органическое соединение в одно из соединений основного обмена. Наиболее подробно метаболизм ПНФ в бактериальной клетке был изучен и описан для штамма Moraxella sp., способного утилизировать ПНФ как единственный источник углерода и энергии, но не единственный источник азота. Было показано, что клетки данного штамма нуждаются в дополнительном источнике азота [Spain, Gibson, 1991]. Грубый экстракт из клеток Moraxella sp., выращенных на ПНФ, катализировал зависимое от восстановленных пиридиннуклеотидов окисление субстрата со стехиометрическим освобождением азота в виде нитрит-ионов и образованием гидрохинона (82% от начальной концентрации ПНФ). В дальнейшем происходит расщепление ароматического кольца гидрохинона с образованием полуальдегида 4-гидроксимуконовой кислоты, а также малеилацетиловой и кетоадипиновой кислот. Схема этого процесса приведена нарис. 5.1. (А).
Описан штамм Arthrobacter sp. JS443, способный использовать пара-нитрофенол и 4-нитропирокатехин в качестве источника углерода [Rokesh et al., 1994; Jain et al., 1994]. Было показано, что первым продуктом окисления пара-нитрофенола был 4-нитропирокатехин, который в дальнейшем подвергался ферментативным превращениям с образованием оксигидрохинона (рис. 5.1 (Б)).
Таким образом, возможны два пути микробного метаболизма ПНФ -через прямое гидролитическое отщепление нитрогруппы и образование гидрохинона или через предварительное восстановление нитрогруппы в аминогруппу, с последующим отщеплением ионов аммония и образованием нитро-пирокатехина.
У клеток различных штаммов метаболизм одного и того же соединения может происходить различными метаболическими путями с образованием различных промежуточных продуктов. Мы использовали ЭО анализ клеточных суспензий для изучения путей метаболизма ПНФ в микробных клетках.
Разработка сенсорных систем определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью электрооптического анализа
Нами изучались клетки бактериальных штаммов
Pseudomonas putida С-11, P. putida БА-11, и Acinetobacter calcoaceticum А-122, описанные как деструкторы нитрофенолов [Сингирцев, 1996]. Первоначально проводились исследования по оптимизации условий культивирования и условий проведения электрооптического анализа клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 для получения биомассы, активной в отношении инсекіицидов метафоса и сумитиона. Условия культивирования микробных клеток и условия проведения ЭО анализа клеток по отношению к ПНФ (глава 5) были признаны оптимальными для проведения анализа микробных суспензий по отношению к метафосу и сумитиону.
Был проведен дополнительный контроль чистоты препаратов метафоса и сумитиона с помощью газожидкостной хроматографии, по результатам которого было установлено, что используемые инсектициды представляют собой чистые препараты без содержания примесей. Автор приносит благодарность старшему научному сотруднику лаборатории структурных методов исследования Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, кандидату химических наук Макарову О.Е. за проведенный газожидкостной анализ препаратов метафоса и сумитиона.
Нами изучалось влияние процессов метаболизма инсектицидов метафоса и сумитиона на ЭО параметры клеточных суспензий P. putida С-11, БА-11 и A. calcuaceticum А-122 в зависимости от времени инкубации с субстратами. Это было необходимо для определения времени инкубации клеток с субстратом в дальнейших экспериментах. Для этого в суспензии клеток вносили метафос и сумитион до конечной концентрации 0,75 мМ. Выбор используемой концентрации инсектицидов обусловлен ранее проведенными исследованиями СРА клеток 3-х исследуемых штаммов по отношению к метафосу и сумитиону, которая составляет 0,75 мМ [Гулий, 2001]. ОС клеточных суспензий измеряли при 25С через 5, 15, 30, 60 и 90 минут после начала инкубации с инсектицидами метафосом и сумитионом. После инкубации клетки отмывались трижды в дистиллированной воде (электропроводность 1.6-2.0 u.S/m) и использовались для ЭО измерений. В результате проведенных исследований было установлено, что изменения ОС суспензий клеток штаммов P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122, инкубированных с инсектицидами метафосом и сумитионом, имели место на первых пяти частотах ориентирующего электрического поля (10-1000 кГц). На более высоких частотах существенных изменений не отмечено. Как видно из полученных данных, значительные изменения в ОС клеточной суспензии P. putida С-11 происходят через 15 мин после инкубации с метафосом (рис. 6.2) и в течение первых пяти минут после инкубации с сумитионом (рис. 6.3).
Изменения в ОС микробных клеток P. putida Б А-11 происходят в течение первых пяти минут от начала инкубации с метафосом (рис. 6.4) и через 15 мин после добавления сумитиона (рис. 6.5).
Значительные изменения в ОС суспензии клеток A. calcoaceticum А 122 происходят через 15 мин от начала инкубации с метафосом (рис. 6.6) и в течение первых пяти минут от начала инкубации с сумитионом (рис. 6.7).
Дальнейшие эксперименты проводились после 15 минут инкубации клеток с субстратом для всех изучаемых штаммов. Ранее в главе 5 упоминалось, что существует ряд неспецифических (не связанных с метаболизмом изучаемых субстратов) факторов, которые могут приводить к изменению электрооптического сигнала: сорбция высоко или низкомолекулярных соединений на клеточной поверхности и осмотические явления, связанные с инкубацией клеток в дистиллированной воде. Для выявления возможных изменений ОС суспензий, связанных с сорбцией молекул субстратов на поверхности клеток, были поставлены контрольные эксперименты. Для этого использовались клетки штаммов Azospirillum brasilense Sp7 и Escherichia coli К-12, не обладающие ферментативными системами подготовительною метаболизма метафоса и сумитиона. Для этого микробные клетки А. brasilense Sp7 и Е. coli К-12 инкубировали с метафосом (0,75 мМ) и сумитионом (0,75 мМ) в течение 15 мин. После инкубации клетки отмывались трижды в дистиллированной воде, подготавливалась для ЭО анализа и использовалась для изменений ОС клеточной суспензии. Было установлено, что инсектициды не влияют на электрооптические свойства микробных суспензий штаммов A. brasilense Sp7 (рис. 6.8).и Е. coli 12 (рис. 6.9).
Электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12 при метаболизме глюкозы. Влияние химических ингибиторов на метаболизм глюкозы
На первом этапе нашей работы проводились исследования по изучению влияние метаболизма глюкозы на ЭО свойства клеточной суспензии Е. coli штамма К-12, поскольку необходимо было установить, что изменения ЭО параметров клеточных суспензий связаны с ферментативной активностью клеток при метаболизме не только токсичных, но и нетоксичных веществ, к которым относится глюкоза. Поскольку метаболизм глюкозы клетками Е. coli хорошо изучен, нами не проводились предварительные исследования с различными концентрациями субстрата, и в экспериментах использовалась глюкоза в концентрации 10 г/л.
Нами проводились эксперименты по изучению динамики изменений ОС суспензий клеток Е. coli при инкубировании с глюкозой при 30С. Для этого клетки выращивали в течение ночи на жидкой питательной среде LB, отмывали от питательной среды и переносили в дистиллированную воду. Затем добавляли глюкозу до конечной концентрации 10 г/л. После инкубации суспензия клеток отмывалась трижды в дистиллированной воде, подготавливалась для ЭО анализа, и использовались для ЭО измерений.
Эксперименты проводились при напряженности электрического поля 17 В/см, времени приложения электрического поля 16 сек; ЭО измерения проводились на частотах 10, 52, 104, 1000, 5020 и 10000 кГц; Электропроводность воды во всех случаях составляла 1,8 uS/m. ОС клеток были измерены через 5, 15 и 30 минут после начала инкубации с глюкозой.
В результате проведенных исследований было установлено, что при инкубации клеток Е. coli с глюкозой наиболее значительные изменения ОС клеточной суспензии происходят в диапазоне частот от 10 до 1000 кГц (рис. 7.1). На более высоких частотах существенных изменений ОС не отмечено. Показано, что максимальное увеличение ЭО сигнала имело место на начальных этапах инкубирования клеток с субстратом.
Для определения вклада возможных осмотических явлений на изменение ЭФ свойств суспензий Е. coli К-12 были поставлены контрольные эксперименты. Для этого клеточная суспензия изучаемого штамма инкубировались в дистиллированной воде в течение 5, 15, и 30 минут. После инкубации клетки подготавливались для ЭО анализа и использовались для измерений ОС. В результате проведенных исследований было установлено, что значительных изменений ориентационных спектров бактериальных суспензий Е. coli К-12 (рис. 7.2) при инкубации в дистиллированной воде выявлено не было. Измерение ОС во всех экспериментах проводилось через 15 минут инкубации клеток с субстратом.
Таким образом, в результате проведенных исследований были зарегистрированы изменения ЭФ свойств клеточной суспензии Е. coli К-12 после инкубации клеток с глюкозой, которые возможно связаны с интенсивностью ферментативных процессов, происходящих в микробных клетках под действием субстрата.
Как показано в предыдущих главах 5 и 6, при изучении влияния метаболизма низкомолекулярных токсичных соединений на ЭО параметры клеточных суспензий были использованы штаммы, обладающие соответствующими ферментативными системами подготовительного метаболизма изучаемых субстратов. В этой серии экспериментов были предложены контрольные опыты с использованием культур клеток, не обладающих ферментативными системами метаболизма токсичных субстратов.
При использовании в качестве субстрата глюкозы можно отметить, что гликолиз, как один из центральных путей катаболизма глюкозы, характерен для многих микроорганизмов. В связи с этим существует вероятность того, что при использовании прежней схемы проведения контрольных опытов и инкубации микробных клеток представителей других видов или штаммов с глюкозой будут происходить изменения ЭО параметров клеточных суспензий. В связи с этим для подтверждения высказанного предположения, что изменения ЭО параметров суспензий клеток Е. coli К-12 при инкубации с глюкозой связаны с процессами ее метаболизма в клетках, решено было использовать ингибиторы ферментов. Сущность этого подхода состоит в нарушении нормальной метаболической активности клеток путем воздействия различных ингибиторов и проведении сравнительных измерений электрооптических параметров клеточных суспензий после добавления субстрата. Для этого могут быть использованы различные ингибиторы ферментативной активности.
Известно, что клетки Е coli являются факультативными анаэробами, т.е. обладают способностью к росту, как в присутствии, так и в отсутствии кислорода [Готтшалк, 1985]. В аэробных условиях за счет кислорода часть субстрата окисляется до С02, при этом кислород служит конечным акцептором электронов. Если субстратом для Е. coli является глюкоза, то около 50% окисляется до СО2 и образовавшийся при этом АТФ используется для окисления остальных 50% глюкозы [Готтшалк, 1985].
Весь процесс окисления глюкозы до С02 и воды в клетках Е. coli можно разделить на несколько этапов: 1) транспорт глюкозы в клетку, 2) расщепление глюкозо-6-фосфата до пирувата по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, 3) окислительное декарбоксилирование пирувата до ацетилкофермента А, 4) окисление ацетил-СоА в цикле трикарбоновых кислот [Готтшалк, 1985].
