Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 7
1.1.1.. Строение основной обонятельной системы 7
1.1.2. Трансдукция обонятельного сигнала обонятельными рецептирующими нейронами 9
1.1.3. Трансдукция обонятельного сигнала другими обонятельными нейронами 12
1.1.4. Электрическая активность других клеток обонятельного эпителия 15
И.5. Принципы распознавания и кодирования запахов 15
II.6. Электрическая активность обонятельных эпителиев 15
III. Материалы и методы 19
III. 1. Животные 19
Ш.2. Регистрация ответов обонятельного эпителия 19
Ш.4. Флуоресцентная микроскопия и микрофотометрия 20
IV. Результаты и обсуждение 21
IV. 1. Олфактометр 21
IV.2. Регистрация электроолфактограмм 25
IV.3. Моделирование электроолфактограмм. Исходные положения модели . 30
IV.4. Анализ экспериментальных данных. 34
IV.5. Микрофлуориметрия клетки 37
IV.6. Шумовые характеристики. 40
IV.7. Исследование одиночных клеток. 43
IV.8. Обсуждение 44
V. Заключение 53
VI. Выводы 55
VII. Список литературы
- Трансдукция обонятельного сигнала обонятельными рецептирующими нейронами
- Электрическая активность других клеток обонятельного эпителия
- Регистрация ответов обонятельного эпителия
- Моделирование электроолфактограмм. Исходные положения модели
Введение к работе
Обоняние - способность определять запах веществ, рассеянных в воздухе. Обонятельная система позвоночных и млекопитающих состоит из двух связанных подсистем - основной и дополнительной, расположенных в носовой раковине. Традиционно считалось, что.у позвоночных главный обонятельный эпителий (МОЕ) специализируется на восприятии обычных запахов, а вомероназальный орган (VNO) ответственен за распознавание относительно узкого класса пахучих веществ (феромонов), детерминирующих социальное и половое поведение животных. Однако исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о том, что VNO свойственна более широкая химическая чувствительность, в то время как восприятие животными ряда феромонов происходит при участии МОЕ. Процесс восприятия простых пахучих стимулов, не участвующих в химических коммуникациях животных, основательно изучен и прослежен от связывания молекул запаха с рецептирующей поверхностью обонятельных нейронов МОЕ до возбуждения нейронных сетей обонятельной луковицы. В частности, установлено, что запахи распознаются специализированными рецепторами, относящимися к суперсемейству гептаспиральных рецепторов, сопряженных с сигнальными каскадами с помощью G-белков. Связывание молекулы запаха с рецептором приводит к активации аденилатциклазы, быстрому повышению уровня циклического аденозинмонофосфата (сАМР) в обонятельной цилии, активации сАМР -зависимых катионных каналов и генерации рецепторного потенциала. Вопросы о том, какие клетки МОЕ и при участии каких рецепторных и сигнальных механизмов детектируют феромоны, остаются открытыми.
Методами иммуногистохимии недавно показано, что: 1) в МОЕ функционирует субпопуляция клеток, которые экспрессируют не гептаспиральные рецепторы запахов, а рецептор-гуанилатциклазу; 2) определенная популяция клеток МОЕ экспрессирует G-белок гастдуцин и ионный канал TRPM5 - ключевые элементы каскада вкусовой трансдукции. Вполне вероятно, что клетки данных подтипов являются феромон-чувствительными, хотя прямых доказательств этого не существует. В силу сказанного, одним из направлений исследований нашей лаборатории, является попытка выяснить физиологическую роль этих субпопуляций клеток МОЕ, скорее всего выполняющих хемосенсорную функцию. В частности, предполагается установить природу химических стимулов, на которые способны отвечать эти неканонические хемосенсорные клетки, и исследовать сигнальные процессы, запускаемые в этих клетках химическими стимулами.
Существует несколько специфических проблем, препятствующих эффективному анализу популяции неканонических хемосенсорных клеток МОЕ. Во-первых, данная субпопуляция слишком мала ( 1% числа нейронов), что значительно затрудняет их идентификацию среди клеток диссоциированного обонятельного эпителия и делает проблематичным эффективное использование таких методов клеточной физиологии как patch clamp и Са2+ imaging. Морфологические критерии для решения задачи идентификации одиночных клеток МОЕ практически неприменимы. В частности, в процессе выделения большинство обонятельных нейронов теряют обонятельные цилии, наличие которых является характерным морфологическим признаком этих клеток. Кроме того, обонятельные нейроны постоянно обмениваются, развиваясь из базальных клеток. Незрелые нейроны приобретают цилии только когда их рецептирующая апикальная мембрана достигает поверхности эпителия. Задача идентификации неканонических хемосенсорных клеток могла бы быть решена с помощью трансгенных животных, у которых различные хемосенсорные клетки МОЕ экспрессируют различные флуоресцентные маркерные белки. Еще одной проблемой является то, что химические вещества, специфически стимулирующие неканонические хемосенсорные клетки, в целом, не идентифицированы. Учитывая все эти обстоятельства, а также то, что в нашей лаборатории предполагалось использование трансгенных и нокаутных животных, в качестве основной цели данной работы было сформулировано создание новой методической и приборной базы для анализа физиологической активности неканонических хемосенсорных клеток, функционирующих в обонятельном эпителии. Решались следующие задачи:
1. Разработать мультиволновой осветитель на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах для идентификации и исследования одиночных хемосенсорных клеток методом флуоресцентной микроскопии. 2. Разработать двухканальный олфактометр для поддержания и регистрации электрической активности изолированного обонятельного эпителия и стимуляции его газовыми пахучими стимулами заданной концентрации.
3. Исследовать роль субпопуляции гастдуцин-положительных рассеянных хемосенсорных клеток в генерации ответов на 2-гептанон - синтетический феромон мышей.
4. Для интерпретации полученных данных разработать математическую модель суммарного электрического ответа обонятельного эпителия, генерируемого при участии нескольких популяций хемосенсорных клеток.
В результате выполненной работы:
1. Был разработан и построен двухканальный олфактометр, который позволяет поддерживать и регистрировать электрическую активность изолированного обонятельного эпителия до 5 часов и стимулировать его пахучими стимулами в виде калиброванной смеси воздуха и насыщенных паров пахучих веществ. Идея создания данного прибора возникла при анализе современных тенденций в электрофизиологии. Дело в том, что классическая микроэлектродная техника, а затем и метод patch clamp, революционизировавший клеточные исследования и позволивший решить многие задачи от регистрации активности одиночных ионных каналов до анализа экспрессии генов в одиночных клетках, вытеснили на какое-то время некогда традиционные электрофизиологические методы исследования. В частности, исследователи практически отказались от измерения трансэпителиальных токов и потенциалов, которые, естественно, уступают по своей информативности современным методам клеточной биологии. Тем не менее, в последние годы возродился интерес к относительно простым электрофизиологическим методикам, таким как экстраклеточное отведение или методика Усинга для измерения электрической активности эпителиев (Ussing andZerahn, 1951), которые позволяют осуществлять экспресс-анализ функционального состояния биологических объектов с разными уровнями организации. Связано это с рядом обстоятельств, из которых в контексте данной работы следует отметить следующее. Современные методы молекулярной биологии и генной инженерии позволяют манипулировать рецепторными, канальными и сигнальными белками, либо подавляя экспрессию данного белка (knock-out, sRNA interference), либо усиливая его экспрессию, либо вводя точечные мутации. Простые электрофизиологические методы часто дают возможность выявить функциональные последствия подобных манипуляций. В качестве примера отметим, что мыши с нокаутированным геном аденилилциклазы типа 3, которая в норме специфически экспрессируется в обонятельных нейронах, становились полными аносмиками по отношению к простым запахам, что успешно выявлялось по олфактограмме (Wong et al., 2000).,
2. Была проведена разработка мультиволнового осветителя на сверхярких излучающих диодах для исследования одиночных хемосенсорных клеток методами флуоресцентной микроскопии, в том числе, с использованием флуоресцентных зондов. Основанием для постановки такой задачи явилось следующее. Если исключить дорогостоящую конфокальную микроскопию, традиционным для флуоресцентных приложений является использование осветителей на основе ксеноновых ламп - достаточно нестабильный источник света - в сочетании с оптическими фильтрами или монохроматорами. В первом случае имеется плохо перестраиваемая система с ограниченным набором длин волн (две, как правило). Во втором, платой за широкий спектральный диапазон является потеря светосилы и/или чувствительности. Например, в светосильных монохроматорах на дифракционных решетках, которые обеспечивают возбуждение на произвольных длинах волн, фоновая засветка составляет порядка 0.05-0.08% от интенсивности возбуждающего света в силу неидеальности решеток и наличия спектров выше первого порядка (Lakowicz, 1999). Наличие достаточно интенсивного «паразитного» света является одним из основных факторов, ограничивающих чувствительность регистрации и недостаточное соотношение сигнал/шум. Между тем, нами планировались: идентификация клеток с помощью флуоресцентных маркерных белков, исследование одиночных клеток с помощью флуоресцентных зондов и использование нескольких красителей одновременно. Для этого были необходимы мультиволновое монохроматичное возбуждение и идеальное спектральное разделение возбуждения и эмиссии.
Достоинством излучающих диодов является то, что они работают в узком спектральном диапазоне относительно длины волны максимального излучения ( тах Ю нм), уже выпускаются диоды с А™ах в широком спектральном диапазоне (320-1500 нм), диоды эффективно управляются электронным образом и практически безинерционны в масштабах кинетики подавляющего большинства изучаемых внутриклеточных процессов. Немаловажным обстоятельством является низкая стоимость излучающих диодов и практически неограниченное время эксплуатации. Для сравнения, время непрерывного излучения ксеноновых ламп обычно составляет 400-800 часов. Опыт работы с монохроматором фирмы РТІ (Photon Technology International, США) и проделанные расчеты давали основание думать, что разработка и создание управляемого осветителя на сверхярких излучающих диодах позволит нам существенно улучшить чувствительность фотометрического метода и исследовать одиночные клетки с большей эффективностью.
Разработанные и построенные приборы были апробированы с использованием биологических объектов, и, тем самым, была продемонстрирована их эффективность. В частности, было показано, что по сравнению с фирменным сканирующим монохроматором использование осветителя на излучающих диодах позволяет увеличить чувствительность фотометрического метода и существенно улучшить соотношение сигнал/шум на фоне уменьшения скорости выгорания флуоресцентных зондов. Последнее весьма важно при исследовании одиночных клеток. Использование олфактометра, генерирующего воспроизводимые пахучие стимулы, позволило провести сравнительный количественный анализ чувствительности к запахам мышей дикого типа и мышей с нокаутированным геном гастдуцина. Данное исследование показало, что электроолфактограмма (EOG) является достаточно информативным параметром, по которому можно судить об относительном вкладе различных клеточных субпопуляций в электрический ответ МОЕ на запах данного типа. Последнее в сочетании с ингибиторным анализом, в принципе, позволяет идентифицировать пахучие вещества, специфически стимулирующие исследуемую субпопуляцию клеток.
Трансдукция обонятельного сигнала обонятельными рецептирующими нейронами
Начало ощущения запаха - акт связывания пахучего вещества с трансмембранным семидоменным G-протеин-связывающим рецептором (GPC-рецептор, G-protein coupled receptor), расположенным в мембране цилий и обеспечивающими идентификацию качественного типа запаха (Buck, Axel, 1991; Zhao et al., 1998; Krautwurst et al., 1998). Активированный в результате связывания молекулы лиганда GPC-рецептор катализирует активацию (заключающуюся в обмена GDP на GTP в регуляторном центре гетеротримера) и последующую диссоциацию молекул специфического для ORN гетеротримерного G-белка - Go]f на а-субъединицы и комплексы Ру-субъединиц (Jones, Reed, 1989; Bruch, 1990; Jones et al., 1990). Субъединица a-G0if активирует молекулы эффекторного фермента - аденилилциклазы типа III (АСЗ) (Sklar et al., 1986; Bakalyar, Reed, 1990). Активированная АСЗ вырабатывает сигнальную молекулу - циклический аденозин-3,5-монофосфат (сАМР), концентрация которого внутри цилий ORN быстро повышается и приводит к открытию катионных каналов, регулируемых циклическими нуклеотидами - CNG-каналов (Nakamura, Gold, 1987; Kolesnikov et al., 1990; Kaupp, 1991; Lowe, Gold, 1993; Firestein, Zufall, 1994). Эти каналы имеют высокое сопротивление в покое при низкой (-0.5 мкМ) внутриклеточной концентрации сАМР ( 10% от [c]1/2, поэтому фоновой ток каналов порядка 1-2% от максимального тока открытого канала) (Lowe, Gold, 1993), поддерживаемой благодаря низкому базальному уровню активности АСЗ (Defer et al., 2000) и высокому уровню активности фосфодиэстераз PDE2 и PDE 3, гидролизующих сАМР (Borisy et al., 1991, 1992; 1993; Yan et al., 1995). При активации CNG-каналов сАМР их проводимость возрастает и вход катионов Na+, Са2+, Mg2+ по электрохимическому градиенту внутрь определяет начало генерации электрического ответа ORN на стимуляцию, представляющего собой дозозависимую деполяризацию мембраны (Trotier, MacLeod, 1986; Firestein, Werblin, 1989; Restrepo et al., 1990; Restrepo et al., 1993; Zagotta, Sigelbaum, 1996). Эта деполяризация запускает весь последующий процесс передачи возбуждения в обонятельном нейроне: активацию потенциал-зависимых Na-каналов и К-каналов, вырабатывающих потенциал действия, передаваемого по аксону в обонятельную луковицу (Mozell, 1962, 1964, 1970; Mozell and Jagodowicz, 1973; Duchamp-Viret et al, 1999; Imanaka, Takeuchi, 2001).
Ион Ca2+ играет роль универсального вторичного мессенджера, опосредуя действие нейротрансмиттеров и гормонов и регулируя важнейшие клеточные функции, такие как секреция, метаболизм, возбудимость, развитие и апоптоз (Berridge, 1993; Berridge et al, 2000). В ORN млекопитающих входящий Са2+, в первую очередь, активирует триггерную Са2+- и потенциал-зависимую СГ -проводимость, усиливающую амплитуду электрического ответа в 2-3 раза (Kleene, 1993, 1997; Kurakhashi and Yau, 1993; Frings et al., 2000; Reisert et al., 2003; Eggermont, 2003; Pifferi et al., 2007).
Одновременно Ca запускает комплекс процессов адаптации ORN, результатом которой является уменьшение амплитуды ответа при продолжительной стимуляции (Getchel, Shepherd, 1978; Firestein et al., 1990; Kurakhashi and Shibuya, 1990; Kurakhashi and Menini, 1997). Так, свободный Са2+и его комплексы с кальмодулином (СаМ), снижают афинность а2-субъединиц CNG-каналов (CNGA2) к сАМР (Kramer, Siegelbaum, 1992; Zufall et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Zagotta, Siegelbaum, 1996), что выражается в наблюдаемом снижении проводимости мембраны (Kurakhashi and Shibuya, 1990; Zufall et al., 1991; Kurakhashi and Menini, 1997; Leinders-Zufall et al., 1997). Комплекс Ca-CaM также снижает активность АСЗ (Вгеег et al, 1990; Ronnett et al, 1991; Wayman et al., 1995; Boekhoff et al., 1996) и стимулирует фосфодиэстеразу PDE1C (Borisy et al., 1991; Yan et al., 1995), которая, совместно с сАМР-зависимой изоформой PDE4A (Borisy et al., 1991, 1993), быстро гидролизует сАМР, что приводит к снижению проводимости мембраны за счет уменьшения числа открытых CNG-каналов и уменьшения их проводимости. Перечисленные процессы, таким образом, запускают механизм инактивации CNG -каналов, в котором также участвует СаМ (Chen, Yau, 1994). При высокой концентрации комплекса Са-СаМ, вследствие продолжительного ( 10 сек и более) стимулировании запахом, происходит десенситизация - снижение активации АСЗ кальмодулин-зависимой киназой II (СаМК-П), экспрессируемой в цилиях ORN (Wei et al., 1996, 1998; Leinders-Zufall et al., 1999). При стимуляции ORN короткими и интенсивными стимулами наблюдается еще и другая форма адаптации - длительная (long-lasting adaptation) - проявляющаяся в виде ослабления амплитуды, уменьшении времени восстановления сАМР-опосредованных ответов и генерации небольшого (-1-2 пА) устойчивого и длительного тока ( 2-5 мин), который обеспечивается за счет активации CNG-каналов не сАМР, а циклическим гуанозин 3 ,5 -монофосфатом (cGMP) (Zufall and Leinders-Zufall, 2000). Выработка cGMP осуществляется эндоплазматической гуанилатцикалазой, активируемой микромолярными концентрациями моноксида углерода (СО), синтезируемого гемооксигеназой (Zufall and Leinders-Zufall, 1997).
Модуляция цепи обонятельной трансдукции в ORN осуществляется также и маркирующими протеинами (olfactory marker proteins, ОМР), в большом количестве присутствующими в цитоплазме зрелых обонятельных клеток позвоночных (Мепсо, 1989; Buiakova et al., 1996). Животные с удаленным геном, кодирующим ОМР, демонстрировали пониженную чувствительность к обонятельным стимулам в поведенческих экспериментах (Youngentob and Margolis, 1999; Youngentob et al., 2001) и сниженные (на 25-40%) амплитуды ответов, замедленую кинетику фронта и восстановления и сниженную способность обнаруживать повторный стимул в паре (Buiakova et al., 1996).
Электрическая активность других клеток обонятельного эпителия
Ответ обонятельного эпителия на стимуляцию пахучим веществом электроолфактограмма (EOG) - медленный отрицательный потенциал, который регистрируется на поверхности обонятельного эпителия позвоночных (Hosoya&Yoshida, 1937; Ottoson, 1956). EOG является результатом суммарной деполяризации в цилиях (генераторный потенциал) популяции ORN (Duchamp-Viretet al., 1999) и представляет собой первичный дозозависимый ответ эпителия на обонятельный стимул, отражающий силу ответа индивидуальных активированных ORN и их числа. Этот ответ не зависит от потенциала действия в обонятельном нерве (Tucker, Shibuya, 1965) и исчезает только при дегенерации ORN после бульботомии обонятельного нерва (Ottoson, 1956) и у генетически измененных животных с удалёнными (knock-out) звеньями цепи обонятельной трансдукции (Brunet et al., 1996; Belluscio et al., 1998; Wong et al., 2000). Потенциал EOG на поверхности обонятельного эпителия имеет отрицательный знак, поскольку деполяризация поверхности ORN со стороны цилий больше, чем деполяризация тканей под ORN, к которым обычно подключен индифферентный электрод (Getchell, 1986; Firestein and Shepherd, 1991; Lowe and Gold, 1991; Leinders-Zufall et al., 1997).
Обычно EOG регистрируется по схеме, описанной Ottoson (1956), с внеклеточным электродом, контактирующим с апикальной поверхностью обонятельного эпителия (при «открытой» препарации обонятельного эпителия) и реже - электродами расположенными на решетчатой кости (Thommesen and Doving, 1977) или введёнными через эпителий с черепной стороны после удаления решетчатой кости (Chaput and Chalansonnet, 1997; Chaput, 2000; Ezeh et al., 1995; Potter and Chorover, 1976; Scott et al., 1996; Scott-Johnson et al., 2000). В ряде работ EOG регистрировали при помощи потенциал-зависимых красителей (Kent and Mozell, 1992; Kent et al., 1996; Youngentob et al., 1995; Youngentob and Kent, 1995). В качестве характеристики EOG обычно используются амплитуда пика. Длительность фронта используется реже (Van As et al., 1985; Scott-Johnson et al., 2000). Время задержки фронта используется редко ввиду трудностей, связанных с точным его определением (Ottoson, 1971). Оценки его различны: около 30 мс у крыс (MackaySim, Kesteven, 1994) и 150 - 200 мсек у земноводных (Ottoson, 1971; Van As et al., 1985). Время спада EOG отражает свойства собственно ORN и механизм очистки среды над обонятельным эпителием от молекул стимулирующего вещества (Ottoson, 1956; Scott and Scott-Johnson, 2002).
Результаты сравнения амплитуд EOG в ответ на аппликацию стимулов, нагнетаемых равномерно на весь эпителий при «открытой» препарации (MackaySim and Kesteven, 1994) и на ограниченную область вокруг регистрирующего электрода (Scott et al., 1997) не выявили достоверных различий. Это означает, что амплитуда EOG определяется свойствами рецепторов и не зависит от условий стимуляции, в частности, направления и расхода струи воздуха, переносящей молекулы стимула (Kent et al., 1996; Scott-Johnson et al., 2000).
EOG успешно использовался для изучения пространственного распределение амплитуды EOG по обонятельному эпителию (Daval et al., 1970, 1980; Mustaparta, 1971; MackaySim et al., 1982; MackaySim and Shaman, 1984; Kent and Mozell, 1992; Thommesen and Doving, 1977), которые позволили выявить возможную связь распределения амплитуд EOG и зон экспрессии рецепторов (Ngai et al., 1993; Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1993; Scott et al., 1996; Scott and Brierley, 1999; MackaySim et al., 1982; MackaySim and Shaman, 1984; Kent and Mozell, 1992; Marchand, 2001). Эти зоны совпадают с расчетным распределением полей скорости воздуха в носовой раковине (Kimbell et al., 1997). Ряд появившихся в последнее время работ демонстрирует возможности EOG, как экспресс-метода оценки функционирования цепи обонятельной трансдукции R- G0if- АСЗ- сАМР - CNG-каналы. Так, генетический нокаут субъединицы CNGA2 (Brunet et al.1996) и G-белка G0if (Belluscio et al., 1998) приводило животных к глубокой аносмии, что фиксировалось в поведенческих тестах и проявлялось в практически полном отсутствии EOG. Аналогичные результаты были получены на животных с нокаутированным геном, кодирующим эффекторный фермент АСЗ (Wong et al., 2000). Эксперименты по фармакологической блокаде АСЗ селективными ингибиторами аденилатциклазы также демонстрировали практически полное исчезновение EOG по сравнению с контролем при стимуляции широким набором одорантов (Chen et al., 2000). Результатом экспериментов на животных с удаленным геном, кодирующим ОМР, явилось не отсутствие, а лишь незначительное (на 25-40%) снижение амплитуды ответов EOG, а анализ кинетики нормированных EOG выявил замедление кинетики фронта и восстановления, что, вероятно, приводило к обнаруженному у животных снижении способности обнаруживать повторный стимул в паре (Buiakova et al., 1996; Ivic et al., 2000). При этом кратковременная экспрессия ОМР у нокаутных животных приводила к восстановлению этой способности (Ivic et al., 2000).
Факты практически полного исчезновения EOG у генетически измененных животных с блокированными звеньями цепи обонятельной трансдукции подтверждают, с одной стороны, предположение о том, что EOG - это ответ популяции ORN (Ottoson, 1956), не исключающее возможного вклада в EOG и других клеток обонятельного эпителия, которые могут быть активированы как непосредственно стимулом запаха, так и ответом ORN. С другой стороны, рассмотренные примеры успешного анализа изменений амплитуд и кинетики EOG, как следствий генетических манипуляции и/или воздействий ингибиторов, позволяют рассматривать регистрацию EOG как потенциальное средство обнаружения и исследования активности эпителиальных клеток других субпопуляций (кроме ORN).
На роль таких клеток, в первую очередь, претендовали опорные клетки обонятельного эпителия, базальные клетки и клетки боуменовых желез. Вклад опорных клеток в потенциал EOG, как следует из рассмотрения их электрических свойств, не является основным. Стимуляция запахом вызывает генерацию слабой положительной полуволны, опережающей мощный негативный фронт EOG, которую связывают с активностью базальных клеток (Gold, 1999), но механизм её генерации не изучен. Вклад этой полуволны в EOG также пренебрежимо мал (менее 1% амплитуды пика EOG). Регистрация EOG у мышей с нокаутом CNGA2, показала, что эти мыши способны различать только запахи феромонов (2-гептанона и диметилпиразина), причем вклад в потенциал EOG вносили микровиллярные ORN (Lin et al., 2004). Изучение изменений потенциалов EOG мышей дикого типа, вызванных ингибиторами аденилатциклазы и фосфолипазы, в ответ на стимуляцию феромонами и другими веществами позволил также установить, что эта субпопуляция микровиллярных ORN использует фосфоинозитидный каскад трансдукции (Lin et al., 2004).
Регистрация ответов обонятельного эпителия
Таким образом, проведенные эксперименты (Рис.8-12) свидетельствовали о том, что в обонятельном эпителии функционирует субпопуляция хемосенсорных клеток, которые экспрессируют G-белок гастдуцин, сопрягающий рецептор запахов с фосфолипазным каскадом, и что гастдуцин-положительные клетки специализируются в распознавании феромонов, по крайней мере, 2-гептанона. Исходя из этих представлений, мы разработали математическую модель электрического ответа обонятельного эпителия на запахи, которую использовали в дальнейшем для анализа экспериментальных данных. В простейшем варианте модель предполагала, что электроолфактограмма является аддитивной суммой поверхностных потенциалов, генерируемых за счет суммарной электрической активности, соответственно, обонятельных нейронов и неканонических хемосенсорных клеток, например, гастдуцин-положительных. Моделирование электроолфактограммы. Исходные положения модели.
Как отмечалось выше, результаты проведённых нами экспериментов свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что в генерации ответов МОЕ на синтетический феромон мышей 2-гептанон кроме ORN принимают участие гастдуцин-положительные рассеянные рецепторные клетки. Для проверки данной гипотезы и оценки вклада этих клеток в кинетические характеристики EOG было предпринято математическое моделирование ответов.
При моделировании амплитуды EOG исходили из принятого при моделировании электрических полей тканей представления, что каждая клетка (или элемент мембраны) может рассматриваться как токовый диполь, расположенный в проводящей среде, и создающий в этой среде меняющееся во времени электрическое поле (Жадин, 1984; Плонси и Барр, 1992). Пространственное распределение вызванного этим диполем потенциала удовлетворяет уравнению Лапласа и зависит от момента диполя, его координат и ориентации относительно точки регистрации, а также проводимости среды, которая, в общем случае, является неоднородной. Тогда, на основе принципа суперпозиции, потенциал, генерируемый эпителием, будет представлять собой интегральный потенциал совокупности клеток как совокупности взаимно независимых синхронных диполей. Поскольку МОЕ морфологически представляет собой однослойную упорядоченную структуру нейронов с одинаково ориентированными дендритами, оканчивающимися на апикальной поверхности, то вполне правомерно представить её в виде плоского слоя, заполненного дипольными источниками, ориентированными перпендикулярно слою и генерирующими электрический ток, текущий поперек этого слоя, так, что при этом одна граничная поверхность слоя будет поверхностью источников, а другая - стоков. Протекание тока в окружающей этот слой проводящей среде и изменение во времени плотности тока будет приводить к возникновению потенциала - регистрируемой на поверхности эпителия EOG. Высокая плотность ORN и упорядоченность структуры МОЕ позволяют заменить истинное распределение дискретных диполей непрерывным и равномерным по слою эпителия. Малые линейные размеры ORN и неровностей эпителия по сравнению с поперечными размерами МОЕ и остальных расположенных под ним тканей, позволяют рассматривать эпителий как бесконечный плоский слой точечных диполей. Распределение потенциала, созданного слоем, равномерно заполненным малыми токовыми диполями, ориентированными перпендикулярно поверхности слоя, идентично вне и внутри него распределению потенциала, созданного двойным электрическим слоем (Жадин, 1984). Это позволяет, при сделанных выше допущениях, рассматривать потенциал двойного электрического слоя в качестве модели амплитуды EOG.
На основе проведённых рассуждений, эпителий, состоящий из сенсорных клеток только одного типа, может быть представлен бесконечным плоским слоем (Рис.14), толщиной Ь, наполненным диполями со средним моментом Ми плотностью т. Слой расположен перпендикулярно оси координат z, так, что плоскости z=±b/2 образуют его границы, причем, плоскость z=-b/2 является границей слоя с полубесконечной однородной проводящей средой z -b/2. Плотность тока через границы слоя равна ]. Сверху этот слой накрыт плоским слоем однородной проводящей слизи толщиной а-Ь/2 и проводимостью 1/р. Плоскость z=a является границей полубесконечного непроводящего пространства. Тогда потенциал такой системы будет равен сумме потенциалов V(z) - двойного электрического слоя +b/2 z -b/2, расположенного в бесконечной однородной проводящей среде и потенциала V(2a-z) - его зеркального отражения в границе z=a, расположенного в интервале (2a-b)/2 z (2a+b)/2 (Жадин, 1984): где: р - удельное сопротивление среды, j=mM - плотность тока через границу двойного слоя. Если клеточная система образована несколькими независимыми популяциями клеток, то, согласно принципу суперпозиции, потенциал гетерогенной системы будет равен сумме потенциалов двойных электрических слоев, генерируемых каждой из этих популяций. Вклад отдельно взятой популяции будет пропорционален моменту данного типа клеток, взвешенному на относительную плотность клеток (Гутман, 1980), и суммарный потенциал будет равен (Рис. 14): Vl(z)=pb2fi"tM,), (3)
Такого представления было бы достаточно для адекватного описания олфактограммы, но на сегодня даже качественно не установлены звенья сигнальной цепи рассматриваемых рассеянных хемосенсорных клеток, а оценки параметров элементов трансдукционного каскада канонических обонятельных нейронов у разных исследователей значительно расходятся (например: Lowe, Gold, 1993; Zufall, 1990). Это обстоятельство делает невозможным прямое моделирование клеточных токов (моментов). Тем не менее аддитивность вклада различных клеточных субпопуляций в электрический потенциал упорядоченной ткани, которая следует из качественного анализа, позволяет использовать иной подход для количественного анализа ответов обонятельного эпителия на запахи.
Моделирование электроолфактограмм. Исходные положения модели
Использование разбавленных растворов веществ, как способ получения разбавленных паров непосредственно на выходе сатуратора, может показаться наиболее простой и очевидной альтернативой созданию стимулятора дроссельно-реометрического типа. Однако этот способ обладает рядом свойственных только ему проблем, кроме рассмотренных выше инструментальных погрешностей (свойственных любым типам стимуляторов и вызванных девиацией расходов и температуры). Во-первых, невозможно подобрать растворитель без запаха, пригодный для растворения любых веществ. Для водорастворимых пахучих веществ, а их количество невелико, вода пригодна в качестве растворителя, но большинство таких веществ нестабильны в воде (например, эфиры медленно гидролизуются до кислот и спиртов). Для пахучих веществ, слабо растворимых в воде, в большинстве случаев применяется парафиновое масло, пропилен гликоль (высокой чистоты) и иногда высоко очищенные медицинские сложные эфиры, такие как, бензилбензонат. Такие растворители подавляют слабые запахи по причине, вероятно, присутствующих в них остаточных загрязнений. Во-вторых, существуют термодинамические сложности при определении силы стимула. Концентрация пахучего вещества в стимуле - т.е. в воздухе над поверхностью раствора - пропорциональна концентрации пахучего вещества в растворе и коэффициенту активности. Этот коэффициент различен для различных пахучих веществ в одинаковом растворителе, он меняется для различных растворителей и, для многих веществ, непостоянен при изменении концентрации раствора (Cometo-Muniz et al., 2003). В-третьих, потенциально существуют кинетические проблемы при продолжительной непрерывной генерации стимула в виде паров пахучего вещества, испаряющегося из раствора. Концентрация пахучего вещества довольно быстро истощается в поверхностном слое раствора, таким образом действительная концентрация вещества в серии стимулов, за исключением начальных, будет уменьшаться, и для ее определения потребуются дополнительные измерения. Концентрация пахучего вещества у поверхности пополняется за счет его диффузии из объёма раствора к поверхности. Для получения постоянной концентрации паров над раствором необходимо, чтобы этот процесс был соизмерим с процессом удаления вещества из объёма над раствором. Это может быть достигнуто энергичным перемешиванием раствора или пробулькиванием воздуха через раствор, что позволит поддерживать примерно одинаковую концентрацию вещества у поверхности. Необходимо отметить, что пробулькивание становится причиной образования аэрозолей, наличие которых затруднит подсчет концентрации вещества в приготовленной смеси. Перечисленные проблемы вызывают неопределенность концентрации стимулов, что существенно усложняет интерпретацию данных экспериментов. Поэтому, разбавление раствора вещества как способ получения разбавленных стимулов практически не применяется в стимуляторах, несмотря на кажущееся удобство использовать вместо сложного стимулятора просто набор ёмкостей-сатураторов с растворами веществ в разных концентрациях для оценки запахов и используется редко, только для простых, предварительных экспериментов.
Насыщение газа парами жидкостей реализуется барботированием газа через жидкость или продуванием газа над большой поверхностью вещества (Cheesman & Kirkby, 1959). Барботирование - прокачивание несущего газа через тонкий стеклянный фильтр, погружённый в жидкость, является очень эффективным способом получения хорошего контакта между жидкостью и газом. При лопаний пузырьков газа на поверхности происходит образование аэрозолей, поэтому барботирование использовалось для генерации аэрозолей (Blanchard, 1954, Day, 1963). Так, при пропускании одного пузырька через жидкость в среднем формируются пять-шесть взвешенных частиц диаметром менее микрона. В результате этого в потоке газа на выходе барботера содержатся насыщенные пары вещества и большое количество вещества в виде захваченных несущим газом частиц жидкого вещества. При помощи фильтров можно уменьшить количество аэрозольных частиц, но, поскольку ни один фильтр не может задерживать все частицы самых мелких размеров, то полное удаление аэрозолей невозможно. Использование фильтров создает некоторые трудности регулировки расходов в системе из-за сопротивления фильтрующих элементов. Аэрозоли могут накапливаться на фильтрах, поэтому очень важно поддерживать температуру фильтра равной температуре жидкого пахучего вещества: повышение температуры фильтра вызовет испарение задержанных аэрозольных частиц и, соответственно, повышение концентрации паров вещества. Понижение температуры фильтра, наоборот, вызовет конденсацию паров вещества. Таким образом, стимуляторы, в которых используется такой принцип насыщения паров, требуют точной настройки и внимания при эксплуатации, в них предпочтительно использовать слаболетучие вещества, пороговая чувствительность к которым небольшая, а также, чтобы избежать трудностей в работе, необходимо следить за возможным наличием аэрозолей в стимулах (Dravnieks, 1975).
Измеренные в серии аналоговых экспериментов времена фронта и спада стимула для нагретого воздуха используются нами для оценки кинетики концентрации в струе стимула. В идеальном газе число Прандтля (отношение кинематической вязкости к температуропроводности) Рг=1, что означает совпадение относительных полей скорости газа и его температуры (Сунцов, 1959; Лойцянский, 1970). В реальных газах (в частности, в воздухе) Рг=(0,б8-0,70) 1, т.е., коэффициент переноса импульса в струе меньше коэффициента переноса тепла (Сунцов, 1959), и падение относительной температуры вдоль оси струи происходит быстрее, чем падение относительной скорости, при этом ширина теплового «следа» струи в поперечном сечении больше ширины динамического «следа» (Вулис, Кашкаров, 1965). В реальном эксперименте струя стимула несет вместо избыточного тепла избыточную концентрацию паров дозируемого вещества, и поэтому характеристикой такого процесса будет диффузионное число Прандтля PrD, равное отношению кинематической вязкости к коэффициенту диффузии. Для паров большинства летучих веществ при комнатной температуре PrD =(1,5-2,0) 1, т.е., коэффициент переноса импульса больше коэффициента диффузионного переноса вещества. Распространение концентрационного возмущения вдоль оси будет затухать медленнее, чем динамическое возмущение, а ширина концентрационного «следа» струи меньше динамического. Следовательно, концентрационный фронт будет несколько опережать скоростной, и это опережение будет тем существенней, чем меньше скорость струи (Вулис, Кашкаров, 1965), что указывает на адекватность выбранного метода оценки кинетики концентрации. Реальные величины времени фронта температуры (81±10,5 мс) получились меньше по сравнению с наблюдаемыми у потенциалов EOG (224±7% (п=8) для изоамилацетата, и 195±8% (п=7) для 2-гептанона и не должны вносить существенную погрешность в кинетику ответов в реальных экспериментах.
