Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I.I. Регуляция пролиферации в нормальных тканях 9
1.1.1. Контактное торможение размножения клеток
1.1.2. Кейлоны - тканеспецифические ингибиторы деления клеток 15
1.1.3. Эндогенные стимуляторы деления клеток 22
1.2. Свойства межклеточных контактов и реакция на уретан тканей мышей инбредныхлиний, отличающихся по генетической предрасположенности к возникновению ои
спонтанных опухолей
1.2.1. Предрасположенность мышей инбредных линий к возникновению опухолей 24
1.2.2. Свойства межклеточных контактов в тканях, отличающихся по генетической предрасположенности 28
1.2.3. Реакция на уретан тканей, отличающихся по генетической предрасположенности к возникновению спонтанных опухолей 29
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные животные 37
2.2. Объекты исследования: печень и легкие мышей инбредных линий 37
2.3. Препараты 38
2.3.1. Уретан 38
2.3.2. Контактин 40
2.4. Методы 42
2.4.1. Метод измерения силы сцепления клеток 42
2.4.2. Метод диспергирования 43
2.4.3. Метод радиоавтографии 45
2.4.4. Индукция опухолей уретаном 47
2.5. Примечание, математическая обработка... 47
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изменение механических свойств клеток в стенках альвеол у мышей чувствительной А и резистентной С57В1 линий в ответ на однократное введение уретана
3.2. Изменения силы сцепления клеток и числа выделяемых ядер в печени у мышей линии .
АНе и СВА в ответ на введение уретанаг
3.3. Пролиферативная активность легкого в чувствительной А/Не и резистентной С57В1
линии после введения уретана
3.5. Динамика реакции на уретан лимфоидных органов мышей линии А/Не
3.4. Корреляционный анализ изменений механических свойств и пролиферативной активноети легких у мышей
3.6. Действие контактина из легкого на силу сцепления и пролиферативную активность
клеток стенки альвеолы in vivo 78
3.6.1. Определение активных концентраций препаратов контактина
3.6.2. Действие контактина на синтез ДНК in vivo
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Оценка изменений прочности межклеточных контактов и клеточной поверхности по силе сцепления клеток и числу выделяемых ядер ностью пролиферации клеток в ткани легко 96
4.2. Связь между сцеплением клеток и интенсивностью
4.3. Отличия в динамике пролиферативной активности клеток и механических свойств тка
ней, генетически предрасположенных и устойчивых к возникновению спонтанных опухолей, после введения уретана 112
4.4.. Заключение 119
ВЫВОДЫ 120
ЛИТЕРАТУРА 122
- Регуляция пролиферации в нормальных тканях
- Объекты исследования: печень и легкие мышей инбредных линий
- Изменение механических свойств клеток в стенках альвеол у мышей чувствительной А и резистентной С57В1 линий в ответ на однократное введение уретана
- Оценка изменений прочности межклеточных контактов и клеточной поверхности по силе сцепления клеток и числу выделяемых ядер ностью пролиферации клеток в ткани легко
Введение к работе
У многоклеточных животных способность клеток делиться определяет такие важные для жизни процессы, как нормальный рост, регенерация и репарация повреждений. В многоклеточном организме деление клеток подчинено общей цели - сохранению и росту целого организма. Необходимое для организма поддержание постоянного состава и структуры тканей и органов решается целой системой механизмов регуляции деления клеток.
Контроль деления осуществляется на разных уровнях организации; тканевом, органном, организменном и клеточном.
Как осуществляется регуляция деления клеток, постоянство состава на тканевоорганном уровнях? Каковы элементарные клеточные механизмы, и что представляют собой молекулярные носители этого уровня регуляции?
К настоящему времени на разных экспериментальных моделях выявлены эндогенные тканеепецифические факторы, ответственные за специфическую адгезию клеток в эмбриональных (агрегационные факторы) и взрослых (контактины) тканях, и регуляцию пролиферации клеток в тканях (кейлоны, контактины), а также изучена роль контактных взаимодействий клеток в регуляции пролиферации в культурах (явление контактного торможения размножения).
Место действия реальных тканеспецифических ингибиторов деления клеток остается неясным.
В настоящее время трудно понять взаимоотношения между разными элементами регуляции размножения клеток, поскольку они установлены для качественно разных систем (контактное торможение размножения - соединительно-тканные клетки в культуре; адгезионные факторы - губки и эмбриональные клетки; ограничение деления в кусочке ткани - эпителиальные культуры; кейлоны - различные ткани взрослых организмов). Почти не исследовано действие факторов агрегации на пролиферацию и не изучены морфогенетическая активность и другие свойства кейлонов. Из всех выделенных к настоящему времени факторов только для контактинов были найдены отчетливые корреляции между изменением контактных взаимодействий клеток и их пролиферативной активностью. На основании этих данных Маленковым и соавт. было высказано предположение, что регуляция пролиферативной активности эпителиальных тканей осуществляется путем изменения контактных взаимодействий клеток, которое проявляется в изменении прочности сцепления их друг с другом. Эксперименты с контактинами были проведены ia vitro. Однако, существование той или иной регуляции в условиях ia vitro еще не означает, что она будет наблюдаться и in vivo. Исследования ia vitro выявляют только потенциальные возможности клеток или тканей реагировать на те воздействия, которым они подвергаются. In vivo, где условия существования клеток и тканей стабилизированы значительно лучше, таких изменений может не происходить, а, следовательно, и соответствующие потенции клеток могут не проявляться.
Целью настоящей работы является выяснение следующих вопросов:
Возможна и происходит ли в эпителиальных тканях регуляция пролиферативной активности клеток путем изменения контактных взаимодействий клеток?
Имеются ли различия такого рода регуляции в тканях, отличающихся по прочности сцепления клеток и соответственно по предрасположенности к возникновению спонтанных опухолей?
В качестве объекта исследований мы выбрали легкое мышей. Эпителий легкого является обновляющейся тканью и в нормальных условиях в ней поддерживается определенный уровень пролифератив- ной активности клеток, что дает возможность изучать влияние различных факторов на этот процесс.
В качестве воздействий, изменяющих контактные взаимодействия клеток в легком были выбраны: контактин из легкого и уретан. Было известно, что введение препаратов контактина мышам вызывает временное изменение силы сцепления клеток (32, 43), а уретан в первые часы после введения ослабляет механическую прочность ткани легкого (33).
Дополнительный интерес представляло сопоставление изменений контактных взаимодействий и пролиферативной активности клеток в легких мышей инбредных линий, отличающихся по механической прочности межклеточных контактов, что коррелирует с генетической предрасположенностью к возникновению спонтанных и индуцированных опухолей. Линия А/Не характеризуется низкой силой сцепления клеток и высоким уровнем возникновения спонтанных аденом легких, а однократное введение уретана приводит к более быстрому возникновению множественных аденом. Мыши линии С57В1 /б - высокорезистентны, аденомы легких у них могут возникнуть только при многократном введении уретана (25, 26, 27, 20) и они характеризуются большой величиной силы сцепления клеток легкого (30).
Процесс химического бластомогенеза включает в себя как непосредственное действие канцерогена на орган-мишень, так и подавление системы иммунитета. Уретан, способный индуцировать аденомы легких у чувствительной линии А/Не, оказывает ингибирующее действие на иммунную систему, в частности, - вызывает повреждение тимуса (63). Для выявления роли динамических изменений прочности сцепления клеток и пролиферативной активности ткани в развитии процесса бластомогенеза интересно было сопоставить реакцию на уретан в чувствительной линии А/Не органе-мишени - легких и лимфоидных органов.
Основные задачи исследования заключались в следующем: - Изучить влияние на пролиферативную активность легкого in vivo введения разных доз контактина и временные соотношения между эффектами этого препарата на механическую прочность межклеточных контактов и индексом меченных клеток,
Изучить реакцию на уретан печени и легких у мышей инбред-ных линий, отличающихся по силе сцепления клеток и предрасположенности этих органов к возникновению спонтанных и индуцированных опухолей.
Изучить динамику и коррелятивные связи между изменением механических свойств и пролиферативной активностью клеток стенки альвеолы у мышей А/Не и С57В1 /б в ответ на однократное введение уретана.
У чувствительной линии А/Яе сравнить динамическое поведение после введения уретана органачйишени - легких и лимфоидных органов.
Научная новизна.
В результате настоящего исследования впервые проведен анализ коррелятивных связей в условиях in vivo между изменением механических свойств эпителиальных тканей и пролиферативной активностью клеток.
Показано, что временное увеличение силы сцепления клеток в легком in vivo, вызванное введением контактина из легкого, сопровождается также временным обратимым снижением доли ДНК-синтезирующих клеток в стенке альвеолы.
После введения уретана в легких у мышей чувствительной А/Не и резистентной С57В1 /б линий были обнаружены изменения прочности сцепления и пролиферативной активности клеток в стенках альвеол. Между изменением этих показателей наблюдается обратная зависимость. Показано, что наблюдаемое снижение средней величины силы сцепления клеток в легких А и С57В1 и высокоамплитудные колебания этой характеристики (с периодом в 5-7 суток) определяются разными механизмами. Тем не менее оба эти изменения отражаются на доли ДЖ-синтезирующих клеток в ткани.
Выявлено неизвестное ранее отличие в реакции на уретан органов, предрасположенных (легкие мышей А, печень мышей GBA) и резистентных (печень мышей А, легкие мышей С57В1 ) к возникновению спонтанных опухолей. Оно состоит в возникновении высоко-амплитудных "околонеделъных" колебаний прочности сцепления клеток в чувствительных тканях.
Научно-практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты способствуют пониманию механизмов регуляции пролиферативной активности клеток в эпителиальных тканях in vivo и открывает новый подход к поиску веществ» обладающих рострегули-рующей активностью на основе их действия на механическую прочность межклеточных контактов.
Появление высокоамплитудного 5-7 суточного ритма, обнаруженного нами в органе предрасположенном к патологии при воздействии на него внешнего фактора, провоцирующего развитие патологии, может быть использовано для разработки новых подходов к ранней диагностике развития патологических процессов. На основе анализа динамического поведения различных удобных для диагностики параметров, отражающих состояние данного органа (уровень гормонов в моче, биофизических свойств кожи в зонах по инервации соответствующих внутренних органов и т.п.).
Регуляция пролиферации в нормальных тканях
Регуляция пролиферативной активности клеток в ткани может осуществляться на разных уровнях: организменном, органном, тканевом и клеточном.
На тканевом уровне регуляция пролиферативной активности осуществляется с помощью межклеточных взаимодействий. Взаимодействие клеток в тканях может осуществляться как локально с помощью межклеточных контактов, так и дистанционно с помощью специфических веществ, выделяемых одними клетками и переносимыми по кровяному руслу к другим клеткам. В настоящее время обнаружено влияние обоих типов клеточных взаимодействий на пролифе-ративную активность ткани.
Локальная регуляция пролиферативной активности клеток была обнаружена при изучении роста монослойных культур in vitro, и в настоящее время продолжается изучение этого вопроса в основном на тех же системах - клеточных культурах.
Представление о существовании тканеспецифических ингибиторов деления клеток - кейлонов сложилось при изучении вопроса о том, каким образом в тканях поддерживается постоянство клеточного состава. В I960 году О.Иверсен впервые предложил для объяснения этого явления применить принцип отрицательной обратной связи. Суть этой гипотезы заключается в том, что каждая ткань состоит из пролиферирующих и дифференцированных клеток, и для поддержания равновесного состояния между ними необходима связь (72). Согласно О.йверсену, она может осуществляться химическими молекулами - ингибиторами, которые синтезируются "зрелыми" клетками, а воспринимаются пролиферирующими. Предполагается, что в этом случае концентрация ингибитора клеточного деления становится определяющей в поддержании тканевого гомеостаза. Действительно, уменьшение концентрации ингибитора, которое может быть вызвано гибелью или старением клеток, приводит к немедленному увеличению пролиферации и последующему восполнению дефицита.
Таким образом, принцип отрицательной обратной связи явился теоретическим обоснованием существования кейлонов, которые впоследствии и были открыты.
Долгое время исследования двух аспектов регуляции деления клеток в тканях с помощью межклеточных контактов и специфических веществ развивались независимо и практически не пересекались. Мы рассмотрим основные результаты каждого из этих направлений и остановимся на данных, указывающих на возможную связь между ними.
Объекты исследования: печень и легкие мышей инбредных линий
В работе были использованы мыши, как самцы, так и самки трех линий (А/Не, С57В1/6 и СВА) в возрасте 1,5-2,5 мес, (весом 20-28 г) . Мышей содержали в клетках по 10 штук. Диета включала натуральные корма (ежедневно: 5 г зерносмеси; 1,3 г хлеба; 1,2 г творога; 3,4 г каши; 2,0 г овощей), брикетированные корма (2-3 раза в неделю по 8 г) и воду в неограниченном количестве.
Мыши линии А/Не были получены в 1973 году из лаборатории экспериментальных биологических моделей АМН СССР ("Светлые горы", Московская обл.) и затем до 1981 г, поддерживались в виде стада в виварии БОНД АМН СССР. В условиях такого разведения 30-40% мышей линии А к 12 мес. имеют спонтанные опухоли легкого (собственные данные).
Мышей линии С57В і и СВА получали из питомника "Столбовая", содержали некоторое время на карантине, где они подвергались профилактической осповакцинации, и затем брали их в опыт, У 80-90% мышей линии СВА к году возникают гепатомы. У мышей линии С57В1 спонтанных опухолей печени и легких практически не возникает (20,27) .
Изменение механических свойств клеток в стенках альвеол у мышей чувствительной А и резистентной С57В1 линий в ответ на однократное введение уретана
В первой серии опытов было сопоставлено выделение ядер из ткани легкого мышей линии А и С57В1 в первые 40-50 часов после введения уретана.
Уретан вводили подкожно в растворе Хенкса мышам А в дозах: 1,0 мг/г; 0,5 мг/г; 0,25 мг/г; 0,125 мг/г и мышам С57ві - в дозе 1,0 мг/г. В качестве контроля вводили раствор Хенкса по 0,2 мл на мышь.
На рис, ЗД.показано количество ядер, выделяемых из I мг легкого мышей А и С57В1 в первые 50 часов после введения разных доз уретана.
Под влиянием уретана сильно увеличивается выделяемость ядер и этот подъем характерен как для высокораковой, так и для низкораковой линии; у мышей линии С57в1 была использована доза уретана в 8 раз большая (I мг/г), чем для мышей линии А (0,125 мг/г).
Все используемые дозы уретана вызывают увеличение выделяв-мости ядер из легкого мышей А в максимумах на 50-60$. У мышей С57Б1 при максимальной дозе уретана I мг/г число выделяемых ядер увеличивается на 35$ от контроля, а по продолжительности эффекта эта доза соответствует дозе 0,25 мг/г для мышей линии А.
Чем меньше доза уретана, тем позднее наблюдается увеличение выделяемоети ядер и тем меньше продолжительность эффекта.
Полученные различия в реакции двух линий в ответ на введение канцерогена поставили вопрос, а какова же кинетика этих изменений дальше? Поскольку первый пик при дозе I мг/г у С57в1 длится приблизительно 30 часов, то было ясно, что изменения исследуемого показателя надо смотреть с интервалом не реже суток с тем,чтобы отрезок времени оказался достаточным, чтобы проследить последовательность изменений этого показателя.
Первичный эффект уретана на выделение ядер у мышей С57В1 при дозе уретана I мг/г наиболее близок к эффекту уретана на легкое мышей А при дозе 0,25 мг/г (рис, 3,1,), поэтому в дальнейшем мы сравнивали долговременные эффекты уретана у мышей А и С57В1 при этих дозах
Оценка изменений прочности межклеточных контактов и клеточной поверхности по силе сцепления клеток и числу выделяемых ядер ностью пролиферации клеток в ткани легко
В нашей работе мы оценивали два механических свойства ткани: силу сцепления клеток, измеряемую с помощью микроманипулятора, и число ядер, выделяемых из I мг сырого веса ткани при стандартной процедуре диспергирования. Рассмотрим какие заключения о прочности межклеточных контактов и клеточной поверхности можно сделать на основании этих данных.
Межклеточный контакт представляет собой сложную органеллу, в состав которой входят разнородные по структуре и функциям соединения: простые, плотные, щелевые и десмосомы. К настоящему времени получены данные, показывающие, что отрыв гепатоцитов от ткани струей жидкости (при жидкостной дезинтеграции) (4, 24) и при деформации ткани сжатием (41) происходит по смешанному типу: в участках простых соединений и десмосом клетки разделяются адгезионно, а в участках плотных и щелевых соединений - когезион-но, т.е. с разрушением прилежащих участков плазматических мембран и кортикальной цитоплазмы» Трудно ожидать, что при отрыве клеток к печени с помощью микроманипулятора разрыв связи между клетками будет происходить иным способом. Вклад когезионной составляющей в силу сцепления клеток наблюдается, по-видимому, и в легких; тем более, что сила сцепления клеток в легких выше, чем в печени. В печени у мышей инбредных линий сила сцепления клеток принимает значения от 0,056 до 0,160 мг/кл., а в легких - от 0,230 до 0,450 мг/кл. (31).
Таким образом,сила сцепления клеток в ткани является интегральным показателем, в который вносят вклад все ультраструктуры межклеточного контакта, плазматических мембран и связанные с ними элементы цитоскелета. В связи с этим изменение силы сцепления клеток в ткани может происходить как за счет изменения когезионной прочности клеток поверхности в участках, прилежащих к плотным и щелевым соединениям межклеточных контактов (отрыв которых происходит когезионно), так и за счет изменения адгезионной прочности межклеточного контакта.
Число ядер, выделяемых из ткани при стандартной процедуре диспергирования, определяется в основном прочностью клеточной поверхности. Одновременное определение обоих показателей на одном и том же образце ткани в ряде случаев позволяет сделать заключение связаны ли наблюдаемые изменения силы сцепления клеток с изменением прочности межклеточных контактов или прочности клеточной поверхности.
В таблице 4.1 представлены возможные варианты сочетаний изменений значений измеряемых показателей и попытка их интерпретации в простейшем варианте.
