Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Электрическая активность нервных клеток 7
1.1.1 Микротоковые флуктуации в одиночных ионных каналах 7
1.1.2 Изменения мембранного потенциала 12
1.1.3 Изменения интегральных свойств нейронов при возбуждении 16
1.2 Вейвлет-анализ 17
1.2.1 Общие сведения 17
1.2.2 Примеры применения вейвлет-анализа 23
1.3 Фрактальный анализ 25
1.3.1 Фрактальные множества 25
1.3.2 Фрактальные меры 26
1.3.3 Монофрактальный анализ 27
1.3.4 Мультифрактальный анализ 30
1.3.5 Примеры применения 31
1.4 Концепция самоорганизованной критичности 33
2 Цели и задачи исследования 36
2.1 Цели исследования 36
2.2 Задачи исследования 36
3 Материалы и методы 37
3.1 Препараты. Растворы и реактивы 37
3.1.1 Приготовление препаратов нервной системы пиявки 37
3.1.2 Приготовление препаратов нейронов прудовика и катушки 37
3.1.3 Приготовление препарата миелиновых нервных волокон 38
3.1.4 Блокирование К+ каналов тетраэтиламмонием 38
3.1.5 Культивируемые клетки почечного эпителия Vero 39
3.2 Регистрация активности Са2+-зависимых К+ каналов 39
3.3 Внеклеточная регистрация потенциалов действия 40
3.4 Регистрация изменений количества Са2+, связанного на мембране 41
3.5 Метод лазерной интерференционной микроскопии 42
3.6 Вейвлет-анализ временных рядов 45
3.6.1 Описание метода 45
3.6.2 Пример применения вейвлет-анализа 46
3.7 Расчет спектров мультифрактальности 50
3.7.1 Описание метода 50
3.7.2 Пример расчета спектров мультифрактальности 51
3.8 Расчет показателей Гёльдера 52
3.8.1 Описание метода 52
3.8.2 Пример расчета показателей Гёльдера 56
4 Результаты 58
4.1 Фрактальный анализ клеточных процессов 58
4.1.1 Анализ последовательностей времен жизни ионных каналов 58
4.1.2 Анализ серий потенциалов действия 64
4.1.3 Анализ флуктуации содержания мембраносвязанного Са2+ 68
4.1.4 Анализ изменений локального показателя преломления цитоплазмы и мембраны нейронов 72
4.2 Моделирование активности ионного канала 76
4.3 Вейвлет-анализ локальных изменений показателя преломления цитоплазмы и мембраны нейронов 83
5 Заключение 89
6 Выводы 92
Список литературы 93
- Микротоковые флуктуации в одиночных ионных каналах
- Примеры применения вейвлет-анализа
- Приготовление препаратов нейронов прудовика и катушки
- Анализ последовательностей времен жизни ионных каналов
Введение к работе
Основной задачей клеточной биофизики является изучение организации, регуляции и взаимодействия процессов различной природы в клетке. Максимальное разнообразие процессов сопровождает генерацию и проведение электрической активности нервных клеток, проявляющейся в изменениях мембранного потенциала, ритма возбуждения и длительности «пачек» импульсов.
В настоящее время наиболее полно изучены колебательные процессы в нейронах, что обусловлено развитым математическим и физическим аппаратов описания колебательных систем. Благодаря методу вейвлет-анализа [1], оказалось возможным получить локализованную во времени информацию о спектральных свойствах исследуемого сигнала. Этот метод позволяет исследовать нестационарные ритмические процессы, протекающие в нервной клетке. Вейвлет-анализ уже применялся для исследования ЭЭГ и ЭКГ, а так же данных функциональной магнитно-резонансной томографии [2-4]. Однако метод вейвлет-анализа пока мало используется при исследовании ритмического возбуждения и других видов активности нервных клеток.
Известно, что динамика многих детерминированных нелинейных систем не поддается описанию в терминах классических колебательных систем, но и не является случайной, стохастичной. Для адекватного описания таких процессов и систем необходимо использования специальных методов — фрактального анализа [5, 6]. В биологии основное внимание в настоящий момент уделяется анализу строения биологических объектов, но не процессов, протекающих в клетках. Основным результатом фрактального анализа временных рядов является т.н. показатель Хёрста, определяющий степень регулярности и масштабной инвариантности исследуемого процесса. Нестационарное поведение показателя Хёрста требует использования методов мулыпифрактального анализа [7].
Мультифрактальный анализ уже применяется, например, для исследования флуктуации сердечного ритма [8, 9], однако на данный момент более распространен монофрактальный анализ биологических процессов, в том числе спонтанной генерации потенциалов действия нейронами, ЭЭГ, последовательностей времен жизни ионных каналов [10-14]. Известно, что серии длительностей открытого или закрытого состояний нескольких типов ионных каналов обладают фрактальными свойствами. Очевидно, что эти данные не могут быть объяснены с позиций традиционных моделей активности ионных каналов. В литературе от-
мечается, что активность ионных каналов может обладать мультифрактальными свойствами, но мультифрактальный анализ последовательностей времен жизни ионных каналов не проводился.
Вероятно, фрактальность динамики ионных каналов может приводить к модуляции проведения серий потенциалов действия нервными волокнами, что в настоящее время практически не исследовано. Известно, что микротоковые флуктуации одиночных ионных каналов лежат в основе интегральных ионных токов, формирующих ритмическое возбуждение нерва, которое сопровождается изменением состояния мембранных белков и липидов, перераспределением мембраносвязанного Са2+ и изменениями в динамике примембранной цитоплазмы [15-19]. В связи с этим является важным исследование фрактальных свойств спонтанных флуктуации проводимости ионных каналов, возбудимости мембран нейронов, концентрации мембраносвязанного Са2+ и динамики примембранной цитоплазмы. Проведение такого исследования в настоящей работе стало возможным благодаря использованию нового метода лазерной интерференционной микроскопии, позволяющего регистрировать динамику локальных значений показателя преломления мембраны и цитоплазмы клеток. Очевидно, что необходимо применение современных методов анализа временных рядов для идентификации отдельных ритмических и нерегулярных процессов в изменениях показателя преломления.
Известно, что нерегулярная активность нервных клеток характеризуется долговременными корреляциями, 1//а-характером спектра мощности, степенными законами в распределениях значений и т.п. Бак с соавт. [20, 21] предложили концепцию самоорганизованной критичности для объяснения феномена 1//а-шума, свойственного широкому кругу природных систем. В основе этой концепции лежат представления о локальных взаимодействиях между компонентами системы и наличии большого количества метастабильных состояний. Системы, обладающие этими свойствами самопроизвольно приходят в состояние, аналогичное состоянию фазового перехода второго рода, когда можно наблюдать кооперативные изменения вплоть до размеров системы и когда теряются любые характерные линейные или временные масштабы. По-видимому, многие процессы, приводящие к фрактальной биоэлектрической активности можно представить согласно концепции самоорганизованной критичности, что позволит получить новые данные о свойствах возбудимости нервных клеток. Биологические системы хорошо соотносятся с представлениями самоорганизованной критичности, что позволяет искать объяснение фрактальным свойствам клеточной активности именно в рамках этой концепции.
Микротоковые флуктуации в одиночных ионных каналах
Основой функционирования нервных клеток являются изменения их мембранного потенциала. Возбуждение мембраны нервных клеток в первую очередь определяется: в фазе деполяризации — входящим током ионов Na+, в фазе гиперполяризации — выходящим током ионов К+ [22-26]. В основе изменений мембранного потенциала лежат микроскопические токи через ионные каналы плазматической мембраны клеток [15, 27].
Визуально представить и количественно описать динамику ионных каналов позволила регистрация токов через одиночные ионные каналы, осуществляемая с помощью стеклянной микропипетки, образующей плотный контакт с плазматической мембраной (пэтч-клямп) [28]. Усовершенствованная методика этого метода [29] быстро стала применяться и отечественными исследователями [30]. Фундаментальная значимость пэтч-метода состоит в том, что он позволяет непосредственно в эксперименте изучать конформационные переходы в белковых молекулах, а именно переходы между открытыми (проводящими) и закрытыми (непроводящими) состояний ионных каналов и описывать кинетические свойства этих переходов.
Ионные каналы, как правило, селективны по отношению к какому-либо типу ионов. Основываясь на этом свойстве, выделяют основные типы каналов: Na+, К+, Са2+ и С1+каналы [15]. Вероятность нахождения канала того или ионного типа в открытом или закрытом состоянии зависит от устройства канала и внешних факторов. Выделяют потенци-алзависимые и лиганд-оперируемые каналы, переход первых между открытым и закрытым состояниями зависит от мембранного потенциала, примером могут служить потенциалза-висимые Na„, К„ и Са„ каналы. Открывание и закрывание лиганд-оперируемых каналов определяется химическими факторами, как, например, в случае NMDA-рецепторов и аце-тилхолиновых рецепторов.
Многие типы потенциалзависимых каналов при сохранении мембранного потенциала постоянным, способны к спонтанным переходам между открытым и закрытым состояниями, которые выглядят как случайные [31]. Изменение мембранного потенциала приводит к изменению соотношения времен, которые проводит канал в том или ином состоянии. Такие переходы традиционно интерпретируют в рамках теории Эйринговской теории абсолютных скоростей реакций [31-33]. В простейшем случае, переход между закрытым (С) и открытым (О) состояниями определяются простым марковским процессом:
Такие переходы могут быть полностью охарактеризованы распределениями времен жизни канала (РВЖ) в последовательностях времен жизни (ПВЖ) {т0} и {тс} как у?0(т) = ксехр(-кст) и Рс(т) = к0ехр(—к0т) соответственно. Однако экспериментальные распределения по временам жизни обычно плохо описываются одной экспоненциальной функцией. Обычное объяснение этому находят в существовании нескольких неразличимых подсосто-яний открытого и/или закрытого состояний, что приводит к необходимости использовать несколько экспоненциальных компонент для аппроксимации РВЖ [31, 33-38]. Поскольку в каждый момент в экперименте невозможно выделить все состояния, но можно только определить их класс (открытое или закрытое), такие процессы называются агрегированными марковскими процессами [39-42]. При достаточном количестве экспоненциальных компонент удается очень точно аппроксимировать практически любые экспериментальные распределения. Благодаря простоте интерпретации и точности аппроксимации подход к количественному описанию динамики ионных каналов с использованием марковских моделей получил широкое распространение в электрофизиологии. Введение дополнительных экспоненциальных компонент стало обычной практикой при аппроксимации экспериментальных РВЖ. Данный подход основывается на следующих положениях [43]: 1. Белок ионного канала имеет небольшое счетное число стабильных конформаций 2. Энергетические барьеры между этими конформациями фиксированы и не меняются со временем 3. Между этими конформационными состояниями возможны переходы, которые происходят в силу случайных причин: температурных колебаний или присоединения лиганда
Как следствие, можно определить вероятность перехода между состояниями, но момент перехода не может быть предсказан. Другими словами, априорно предполагается стохастический, нескоррелированныи режим работы ионных каналов и считается, что время, которое канал проводит в данном состоянии не зависит от длительности предыдущих.
Основной задачей при данном подходе является нахождение (1) числа различных закрытых и открытых конформаций и (2) константы скоростей перехода между каждыми состояниями. Объектом исследования при этом служат распределения по временам жизни закрытых и открытых состояний. Известно, что для агрегированных марковских процессов такие распределения должны представлять собой сумму экспоненциальных функций, то есть: N p{t) = Y, ihe kit, (1.2) где N — это число конформаций данного рода (открытых или закрытых), а — весовые коэффициенты, и к — константы переходов. Поэтому распределения по временам жизни аппроксимируют необходимым и достаточным набором экспоненциальных функций, по результатам аппроксимации судят о числе состояний и о характерных временах жизни каждого. В настоящее время существует достаточно большое количество методов, которые позволяют проводить эффективную экспоненциальную аппроксимацию и оценивать число необходимых экспонент [35, 37, 40, 44-50].
Примеры применения вейвлет-анализа
Вейвлет-анализ широко применяется в разных областях там, где необходимо частотно-временное представление сигнала или анализ изображений. Примеры применения вейвлет анализа в различных областях можно узнать, например из книги [119] или (не столь подробно) из обзорной статьи в одном из российских журналов [116]. Далее будут рассмотрены примеры применения вейвлет-анализа для исследования биоэлектрической активности нервных клеток.
В одной из первых публикаций по вейвлет-анализу применительно к электрической активности Пржибыжевский применял непрерывное вейвлет-преобразование для анализа паттернов ПД в нейронах сетчатки глаза [120]. В этой работе записи ПД, вызванных короткими вспышками света, анализировались с помощью модифицированного вейвлета в виде второй производной функции Гаусса. В записях выявлялись и анализировались ритмические компоненты.
В работе Левалле и соавт. [98] рассматривается опыт применения вейвлет-анализа для исследования серий ПД в обонятельном нерве земноводных, регистрируемых с помощью макроэлектродов. Использовались вейвлеты, представляющие собой первую и вторую производные функции Гаусса (gi и д% соответственно), позволяющие выделить в сигнале фазы резкого нарастания или спада и локальные пики (спайки) соответственно. Авторы предложили несколько оригинальных методик для выделения значимой информации о пачках ПД из скейлограммы вейвлет-преобразований. Ими было продемонстрировано наличие двух характерных диапазонов длительностей событий в исследованных записях, которые зависели от стимуляции обонятельных рецепторов различными раздражителями. Благодаря применению авторами вейвлет-преобразования оказалось возможным выделить как отдельные ПД, так и пачки ПД в вызванной активности нерва. С помощью вейвлет-анализа было также показано, что наблюдаемые пачки ПД организованы в группы, амплитуда которых резко возрастала при предъявлении раздражителей.
Хасти с соавт. [121] исследовали колебания возбудимости быстро адаптирующихся механорецепторов млекопитающих. С помощью вейвлет-разложения с использованием дч вейвлета были проанализированы регулярные составляющие флуктуации возбудимости ме-ханочувствительных нейронов. Были показаны колебания частоты флуктуации, выявлено несколько характерных мод активности, соответственно около 0,18 Гц и 0,5 Гц. Авторами было показано, что частота осцилляции возбудимости не зависит от частоты стимуляции, но уменьшается при понижении температуры, таким образом предполагая наличие метаболических процессов, лежащих в основе флуктуации возбудимости.
В работах Ли [122, 123] анализировалась синхронизация активности нейронов моторной коры при целенаправленной двигательной активности приматов. Для определения когерентности работы нейронов регистрировались параллельные последовательности ПД, которые затем анализировались с помощью кросс-вейвлет спектров. Если для двух сигналов / и д определены вейвлет-разложения (Т f)(a,b) и (Т д)(а,Ь), то кросс-спектром будет результат умножения (Г /)(Г д) , где звездочка обозначает комплексное сопряжение. Если вейвлет-коэффициенты двух сигналов отличаются по фазе, то результат их перемножения будет невелик, таким образом вейвлет кросс-спектры, использованные Ли, оказались удобным инструментом анализа нестационарных последовательностей ПД. Теоретический анализ применения вейвлет-преобразования для исследования синхронизации нейрональной активности был проведен Квиеном [124] и протестирован на нейронных моделях, внутричерепных записях активности больных эпилепсией и обычных ЭЭГ.
Расчет вейвлет кросс-спектров был также использован Бургессом и соавт. [125] и Ца-ем с соавт. [126] для выявления связи между активностью почечного симпатического нерва и артериального давления. Вейвлет-анализ также использовался Содерстрёмом и соавт. [127] для исследования связи между активностью подкожных симпатических нервов и локальным кровотоком в коже. Авторы показали, что активность симпатических нервов проявляется во флуктуациях кровотока кожи в частотном диапазоне 0,02-0,05 Гц.
Хулата и соавт. [128] использовали вейвлет-разложение для выделения и сортировки ПД, записанных с двумерных сетей нейронов. Авторы утверждают, что их метод превосходит известные им аналоги по выделению значимого сигнала из шума и определения наложенных друг на друга спайков. Ким и Ким [129] также использовали вейвлеты для детекции единичных ПД малой амплитуды в зашумленных записях: для некоторых объектов невозможно сделать чистую запись ПД и предложенный авторами метод позволил решить эту проблему. Вейвлеты использовались Лаубахом для предварительной обработки последовательностей ПД перед проведением линейного дискриминационного анализа, используемого для распознавания паттернов активности [130], в качестве объекта использовались записи серий ПД в моторной коре млекопитающих.
Вейвлет-разложение широко применяется для анализа электроэнцефалограмм (ЭЭГ), в том числе для анализа вызванных потенциалов [2, 131, 132], для предсказания эпилептических припадков [133, 134] и диагностировании болезни Альцгеймера [135].
В современном анализе ЭКГ также применяется вейвлет-разложение, что описано в работах, например, Джонса с соавт., Морле и соавт., Грамматикова и соавт. [136-139], а также в обзорах [140, 141]. Оригинальные исследования были проделаны Кимурой и соавт. [142], Хаменом и Негахдарипуром [143] и Саламалекисом с соавт. [144]—в этих исследованиях с помощью вейвлет-анализа изучались сердечные ритмы зародышей во время беременности.
Кроме того, вейвлет-анализ применяли для исследования электромиограмм [145, 146] и при функциональной магнитной ядерной томографии [147-152]. Примеры использования вейвлет-анализа для исследования биомедицинских сигналов различной природы суммированы также в общих обзорах [3, 153, 154].
Приготовление препаратов нейронов прудовика и катушки
Регистрацию суммарных потенциалов действия нерва осуществляли с помощью биполярного внеклеточного отведения потенциала [210]. Во время регистрации нерв находился в экспериментальной камере с влажной атмосферой, раздражающие электроды прикладывали к проксимальному участку нерва, а регистрирующие — к дистальному. Участок нерва между возбуждающими и проводящими электродами располагался в заземленном отсеке камеры, заполненным раствором Рингера —для отсечения артефакта возбуждения и для поддержания нормального функционирования нерва.
Возбуждение проводили с выхода ЦАП платы L-Card L-154, регистрация проводилась с помощью ЦАП этой же платы, сигнал от нерва предварительно проходил через преду-силитель основе инструментального усилителя INA 12IP. Запись велась под управлением операционной системы Linux с помощью специально разработанной нами программы lmeas, работающей с открытыми драйверами плат производства L-Card, частота дискретизации была 10 кГц. Описанная организация экспериментальной установки позволяла управлять параметрами возбуждения нерва с компьютера. Стимуляция производилась прямоугольными импульсами шириной 0,1 мс и частотой 100 Гц. Перед регистрацией длительных серий потенциалов действия (ПД) находили кривую зависимости амплитуды ПД от амплитуды прикладываемого стимула. Далее при каждой из выбранных амплитуд стимула и указанных параметрах частоты и длительности стимула производили пять последовательных записей ритмического возбуждения (РВ) нерва в течение 120 с. За это время нерв проводил около 120 х 100 = 12000 ПД. Между записями нерв выдерживался в состоянии покоя в течение одной минуты. Опыты проводились при температуре 22 С.
Параметры единичных ПД в экспериментальных записях получали при помощи разработанного нами набора программ spikean. Серии амплитуд и времен проведения единичных ПД далее обрабатывали с помощью фрактальных методов анализа. Поскольку длина проводящего участка нерва оставалась неизменной, флуктуации времени проведения напрямую коррелировали со скоростью проведения нервного импульса.
Регистрацию изменений количества ионов Са2+, связанных на плазматической мембране производили с помощью методов микрофлуориметрии. Одним из наиболее распространенных флуоресцентных зондов на количество ионов Са2+, связанного на клеточных мембранах, является хлортетрациклин (ХТЦ) ( C22H23O8N2CI), [211-213]. Максимум поглощения ХТЦ — 380-400 нм, максимум излучения — 520-530 нм. При рН 6 молекула ХТЦ ионизуется и может присоединять один ион Mg2_l H два иона Са2+. В водном растворе вблизи гидрофобной мембраны существует ряд равновесий: ХТЦ (Q0 + Са2+ ХТЦ-Са2+ (Q2) ХТЦ (Qi) + мембрана = ХТЦ-мембрана (Q3) ХТЦ-Са2+ (Q2) + мембрана ХТЦ-Са2+-мембрана (Q4) ХТЦ (Qi) + Са2+-мембрана ХТЦ-Са2+-мембрана (Q4)
В водном растворе квантовый выход ХТЦ Qi незначителен, но он повышается при связывании катионов (Q2 Qi) и еще сильнее увеличивается при проникновении комплекса ХТЦ -катион в гидрофобную область (Q3 Qi, Q4 » Q3, Q2 Qi)- В неполярной фазе сродство ХТЦ к ионам Са2+ намного выше, чем к ионам Mg2+. При этом комплекс ХТЦ-Са2+ лучше связывается с мембраной, чем свободный зонд: установлено, что в присутствии Са2+ практически весь ХТЦ погружен в мембрану и квантовый выход флуоресценции увеличивается в 200-400 раз [214]. Увеличение квантового выхода происходит, вероятно, потому, что при погружении ХТЦ в мембрану уменьшается тушащее действие молекул воды на флуоресценцию ХТЦ.
Для возбуждения флуоресценции ХТЦ использовали галогенную лампу накаливания КГМ 12-100 при комбинации светофильтров ФС-1-6 и СЗС 21-2. Регистрацию флуоресценции ХТЦ проводили с помощью люминесцентного микроскопа Люмам И-3 (Ломо) и фотометрической насадки ФМЭЛ-1 с использованием интерференционных светофильтров с максимумом пропускания в области 520 нм. Сигнал от ФМЭЛ-1 А передавался через повторитель на основе инструментального операционного усилителя INA121P на АЦП L-Card L-154. Регистрация флуоресценции производилась в течение 30 с и оцифровывалась с частотой дискретизации 1000 Гц. Как и в случае регистрации потенциалов действия нервов, запись результатов на компьютер осуществлялась с помощью программы lmeas. Зондовую микрофлуориметрию с зондом ХТЦ применяли для исследования флуктуации содержания ионов Са2+, связанных на плазматической мембране нейронов пиявки.
Лазерная интерференционная микроскопия применяется для изучения оптических свойств клеток и основана на измерении изменений фазы луча при его прохождении через объект [112, 113]. Применение лазера необходимо для получения монохроматического и когерентного пучка света, позволяющего проводить измерения с высоким латеральным и фазовым разрешением. Принципиальная схема интерференционного микроскопа показана на рис. 3.1. Лазерный луч делится на диссекторе на контрольный (опорный) и объектный лучи. Контрольный луч отражается от зеркала и идет на детектор, объектный луч проходит через объект (клетку), отражается от зеркала, проходит через объект и также приходит на детектор. При прохождения света через объект набегает изменение фазы объектного луча за счет оптической разности хода лучей. По интерференции лучей на детекторе оценивают разность фаз контрольного и объектного лучей.
Анализ последовательностей времен жизни ионных каналов
Фрактальность последовательностей времен жизни одиночных каналов обсуждалась в главе 1.3.5. В настоящей работе впервые осуществлен расчет спектров мультифрактально-сти для последовательностей времени жизни (ПВЖ) ионных каналов. Исследовались времена жизни Са2+-активируемого К+ канала большой проводимости в открытом и закрытом состояниях при различных значениях трансмембранного потенциала. Проводился анализ исходных ПВЖ и рандомизованных ПВЖ — последовательностей со случайной перестановкой элементов.
Характерные последовательности времен жизни Са2+-активируемого К+ канала в закрытом и открытом состояниях представлены на рис. 4.1, можно видеть, что времена жизни принадлежат широкому диапазону значений, что сильнее проявляется для закрытых состояний. Более наглядно широкий диапазон значений, которые способны принимать времена жизни ионных каналов можно представить на распределении времен жизни по длительности. Примеры распределений времен жизни в открытом и закрытом состояниях Са2+-активируемого К+ канала показаны на рис. 4.2. На этих графиках времена жизни и плотности их вероятности отложены в логарифмическом масштабе. Видно, что времена жизни принимают значения в пределах нескольких порядков, при этом начальный фрагмент распределения, что более заметно для времен жизни в закрытом состоянии, спрямляется в двойных логарифмических координатах. Таким образом, в распределениях по временах жизни наблюдаются степенные соотношения, которые характерны для фракталов.
Широкий диапазон значений, которые могут принимать элементы временного ряда предполагает наличие мультифрактальности, обусловленной разницей в сингулярностях, создаваемых соседними во времени значениями. Но является ли широкий диапазон значений, которые принимают времена жизни канала единственным источником мультифрактальности? Ответ на этот вопрос может быть получен путем сравнения ширины спектра мультифрактальности для исходных и рандомизованных последовательностей — при рандомизации происходит утеря всей информации, которая содержится в нативном порядке следования времен жизни в последовательности, но вклад широкого распределения значений в муль-тифрактальность остается. Поэтому сдвиг положения максимума спектра рандомизованной в закрытом (а) и закрытом (б) состояниях, отложенные в двойном логарифмическом масштабе. последовательности к h = 0,5 относительно спектра нативной последовательности свидетельствует о наличии долговременных корреляций в исходной последовательности, а сужение спектра — о том, что мультифрактальность исходной последовательности является следствием сложной динамики, которая лежит в основе изучаемой последовательности, а не только широкого распределения по значениям.
На рис. 4.5 показаны характерные мультифрактальные спектры для нативных и ран-домизованных ПВЖ канала в закрытом и открытом состояниях. Максимумы спектров f(h) исходных последовательностей приходятся на h « 0,7, что свидетельствует о наличии долговременных корреляций, тогда как максимумы спектров f(h)r рандомизованных последовательностей располагаются около h = 0,5, указывая на разрушение корреляций. Спектры f(h)r уже, чем спектры f(h), следовательно мультифрактальность последовательностей времен жизни определяется особенностью динамики ионных каналов, а не ширины распределения по временам жизни. Сужение спектров на приведенных графиках более выражено для последовательностей времен жизни закрытых состояний, хотя в целом таких отличий между различными состояниями не было обнаружено и сужение спектров для открытых и закрытых состояний наблюдалось примерно в равной мере. Количественная оценка такого сужения спектра мультифрактальности при рандомизации анализируемой последовательности, выраженная в отношении ширины исходного спектра к ширине спектра рандомизованной последовательности представлена в табл. 4.1.
Расчеты спектров f(h) для ПВЖ при потенциалах на участке мембраны в диапазоне —10. ..ЗОмВ выявили зависимость фрактальных свойств последовательностей времен жизни от мембранного потенциала (рис. 4.5 б), которая могла быть модулирована изменением концентрации Са2+ в экспериментальной камере с внутренней стороны мембраны. При низкой концентрации Са2+— 3 мкмоль/л — последовательности времен жизни в открытом состоянии характеризовались тенденцией к увеличению долговременных корреляций с увеличением мембранного потенциала, тогда как последовательности времен жизни в закрытом состоянии обнаруживали обратную зависимость. При этом если при относительно низких значениях мембранного потенциала (-10 мВ, 0 мВ) главный показатель Хёрста ПВЖ в открытом состоянии был достоверно меньше, чем у ПВЖ в закрытом состоянии, но при высоких значениях МП (20-30 мВ) это различие в последовательностях терялось. При увеличенной концентрации ионов Са2+ (33 мкмоль/л) наблюдалась тенденция к смещению максимума мультифрактального спектра в сторону больших значений при увеличении МП для ПВЖ как в открытом, так и в закрытом состоянии. При повышенной концентрации кальция в растворе с внутренней стороны мембраны наблюдалось также увеличение разброса значений по сравнению с низкой концентрацией Са2+. В случае высокой концентрации Са2+ средние положения максимума спектра мультифрактальности для времен жизни в открытом состоянии для всех потенциалов лежат ниже таковых для времен жизни в закрытом состоянии.
