Содержание к диссертации
Введение
1. Клетки иммунной системы 7
1.1. В-лимфоциты 8
1.2. Т-лимфоцнты 10
1.2.1. Т-хелперы 10
1.2.2. Т-супрессоры 12
1.2.3. Цитотоксические Т-лимфоциты 13
1.3. Естественные киллерные клетки 15
2. Особенности сезонных изменений в иммунной системе гибернирующих животных 21
3. Физические характеристики электромагнитных полей 26
4. Влияние электромагнитных излучений на иммунную систему животных 28
4.1. Иммуномодулирующие эффекты электромагнитных излучений ультра- и сверхвысоких частот на уровне целого организма 29
4.2. Влияние электромагнитных излучений крайне высоких частот 35
5. Влияние ЭМИ на изолированные клетки иммунной системы 40
5.1. Цитогенетические эффекты ЭМИ 40
5.2. Действие электромагнитных излучений на функциональную активность клеток иммунной системы 42
6. Материалы и методы исследования 46
6.1. Животные 46
6.2. Клеточные лини 46
6.3. Формирование солидной опухоли 46
6.4. Источники и характеристики излучения 46
6.5. Методика измерения сверхмалой плотности потока энергии 47
6.6. Выделение лимфоцитов 52
6.7. Разделение лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженной антителами к иммуноглобулинам {"пэштнг") 52
6.8. Выделение перитонеальных макрофагов 53
6.9. Определение концентрации ФНО-а 53
6.10. Измерение пролифератиной активности лимфоцитов 54
6.11. Измерение цитотоксической активности естественных киллерных клеток 55
6.12. Статистическая обработка данных
7. Исследование влияния низкой нтенсивпого ЧМ ЭМИ СВЧ и AM ЭМИ КВЧ на иролиферативиую и цитотоксическую активность лимфоцитов селезенки мышей 56
7.1. Исследования in vivo 57
7.2. Иммунный ответ в клетках иммунизированных мышей 62
7.3. Исследования in vitro 64
8. Влияние амплитудно-модулированного ЭМИ КВЧ на иммунную систему мышей с экспериментальными опухолями 68
8.1. Цитотоксическая активность естественных киллерных клеток селезенки мышей с опухолевым ростом при действии низко интенсивного AM ЭМИ КВЧ 69
8.2. Влияние низкоинтенсивного AM ЭМИ КВЧ на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов селезенки мышей с опухолевым ростом 71
8.3. Количество клеток в селезенке 74
9. Исследование чувствительности иммунных клеток зимнеспящих якутских сусликов к действию низкоинтенсивного ЧМ ЭМИ СВЧ в течение годового цикла 80
9.1. Зимняя спячка (январь-февраль) 80
9.2. Активный период (март-июнь) 84
9.3. Осенний период (октябрь) 85
Заключение 87
Выводы 90
- Т-лимфоцнты
- Влияние электромагнитных излучений крайне высоких частот
- Клеточные лини
- Иммунный ответ в клетках иммунизированных мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время одним из актуальных направлений в современной электромагнитной биологии является исследование нетепловых эффектов низкоинтенсивных электромагнитных излучений (ЭМИ). Биологические эффекты такого типа в основном зависят от частоты излучения и обнаруживаются при малых значениях плотности потока мощности (Голант, 1989). Было показано, что нетепловые эффекты ЭМИ могут проявляться на разных уровнях организации живой материи: от клеток и субклеточных структур до целого организма человека и животных и существенно влиять на функционирование основных регуляторных систем организма (Pakhomov et al., 1998). Более того, низкоинтенсивные ЭМИ, в частности миллиметровые волны, нашли широкое применение в медицинской практике для лечения и профилактики различных заболеваний (Бецкий, 1998, Rojavin et al. 1998). Тем не менее, механизмы действия ЭМИ низкой интенсивности на биологические объекты и системы еще мало изучены. Противоречивые сведения относительно нетеплового действия электромагнитных волн на организменном, клеточном и молекулярном уровнях организации позволяют пока высказать лишь предположения о закономерностях биологических эффектов электромагнитных волн с малой энергией кванта.
Считается доказанным, что одной из наиболее чувствительных систем в организме млекопитающих к воздействию ЭМИ является иммунная система (Walleczek, 1992). Особенно широко и детально были изучены эффекты высокоинтенсивных ЭМИ и электромагнитных полей (ЭМП). Нарушения, возникающие в организме после облучения ЭМИ при относительно высоких интенсив] і остях, могут привести к возникновению иммунопатологии и онкологических заболеваний. В связи с нарастающим техногенным "давлением" исследование иммунного статуса животных и человека при действии ЭМИ различных диапазонов в последнее время становится все более актуальной проблемой. Наименее изученным в этом плане остается выяснение эффектов низкоинтенсивных ЭМИ на иммунную систему животных в норме и патологии. В настоящее время показано, что ЭМИ нетеплового уровня действия влияет на функциональную активность макрофагов и нейтрофилов, пролиферацию и соотношение Т лимфоцитов CD4f/CD8+, вызывает активацию кератиноцитов и тучных клеток кожи и т. д. (Safronova et al., 2002; Запорожан и др., 1997, Szabo et al., 2001; Попов и др. 2001). В тоже время практически отсутствуют детальные и систематические исследования по влиянию низкоинтенсивных ЭМИ на функциональную активность таких клеток иммунной системы животных, как естественные киллерные клетки, Т- и В-лимфоциты, которые осуществляют эффекторные,
надзорные и регуляторные функции, направленные на уничтожение чужеродных субстанций и поддержание целостности организма. Изучение чувствительности различных звеньев клеточного и гуморального иммунитета организма животных к действию низкоинтенсивных ЭМИ, в норме и патологии, представляет большой научный и практический интерес.
Цели и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было проведение исследования иммунотропных эффектов частотно-модулированного (ЧМ) ЭМИ СВЧ (8,15-18 ГГц, режим качания, 1 Гц) и амплитудно-модулированного (AM) ЭМИ КВЧ (42,2 ГГц, амплитудная модуляция 10 Гц)» что могло бы служить основанием для разработки фундаментальной стратегии клинического использования электромагнитных волн.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние низкоинтенсивного ЧМ ЭМИ СВЧ и AM ЭМИ КВЧ на пролиферативную и цитотоксическую активность лимфоцитов мыши in vitro и in vivo.
Изучить влияние AM ЭМИ КВЧ на функциональную активность естественных киллер пых клеток, Т- и В-лимфоцитов селезенки мышей с экспериментальными опухолями.
Исследовать чувствительность перитонеальных макрофагов и Т-клеток селезенки зим неспящих якутских длиннохвостых сусликов Cite Uus Undulatus Pallas к действию низкоинтенсивного ЧМ ЭМИ СВЧ в течение годового цикла.
Научная новизна. Обнаружено, что при подборе определенных условий облучения in vivo низкоинтенсивные ЧМ ЭМИ СВЧ и AM ЭМИ КВЧ вызывают практически одинаковые изменения функциональной активности ЕКК, Т- и В-лимфоцитов селезенки здоровых животных. Показано, что ЧМ ЭМИ СВЧ, в сравнении с AM ЭМИ КВЧ, более эффективны в качестве фактора, вызывающего стимуляцию цитотоксической активности ЕКК селезенки в отдаленные сроки после окончания облучения животных.
Установлено, что длительное фракционированное облучение животных с опухолевым ростом низкоинтенсивным AM ЭМИ КВЧ приводит к угнетению реакций противоопухолевого иммунитета организма (подавление функциональной активности ЕКК и Т-лимфоцитов селезенки).
Впервые были обнаружены стимулирующие эффекты ЧМ ЭМИ СВЧ низкой интенсивности на функциональную активность иммуно компетентных клеток зимнеспяших якутских длиннохвостых сусликов Cilellus Undulatus Pallas. Были выяснены
закономерности иммукомодулируїощего действия низкоинтенсивного ЧМ ЭМИ СВЧ на клетки гибернирующих животных, находящихся в активном и в гипотермном состояниях.
Научно-практическая ценность. Результаты этой работы вносят существенный вклад в выяснение закономерностей воздействия низкоинтенсивными ЭМИ на биологические системы, а также могут быть использованы для разработки стратегии их применения в медицинской практике.
Т-лимфоцнты
Тимусзависимые лимфоциты, как и В-лимфоциты, образуются из стволовых клеток кроветворной ткани. Предшественники Т-лимфоцитов поступают в тимус, где происходит их созревание. Главная особенность специфических Т-клеток — это их гетерогенность (хелперные, супрессорные и цитотоксические Т-клетки). В тимусе происходят важные события, определяющие специфичность периферических Т-клеток организма. Было показано, что в тимусе может осуществляться элиминация клеток, способных реагировать против собственных антигенов, что приводит к возникновению состояния Т-клеточной толерантности. Столь же важными представляются некоторые явления положительного отбора, происходящие в тимусе. Из главных субпопуляций Т-лимфоцитов две — Т-хелперы и Т-супрессоры - обнаруживают комплексный тип антигенной специфичности, при котором имеет место одновременное распознавание чужеродного антигена и аутологичного мембранного белка, кодируемого главным комплексом гистосовместимости (МНС). Т-клетки, способные к одновременному распознаванию продуктов собственных МНС-генов вместе с чужеродными антигенами, могут подвергаться в тимусе положительному отбору. Вполне вероятно, что это происходит в результате распознавания ими собственных МНС-молекул на поверхности эпителиальных клеток тимуса. 1.2 Л. Т-хелперы Одна из наиболее важных регуляторных функций Т-лимфоцитов - это их способность стимулировать В-клетки к пролиферации и дифференцировке в антителообразующие клетки. Было показано, что ответ В-клеток на большинство белковых антигенов полностью зависит от помощи Т-клеток. Такие антигены обычно обозначают как тимусзависимые антигены, поскольку они не способны индуцировать ответ у мышей с врожденным отсутствием тимуса, у которых нельзя обнаружить периферические Т-лимфоциты. Хотя не исключено, что для других типов антигенов, таких как растворимые полисахариды и бактериальные липополисахариды (ЛПС), стимуляция антителообразования может происходить и без участия Т-клеток или их продуктов. Работы, проведенные сравнительно недавно, показали, что даже в таких случаях ответ зависит от влияния Т-клеток, по крайней мере, в определенных условиях (Goldsby et al„ 2002) Помощь Т-клеток может осуществляться, по крайней мере, двумя различными способами. Один из них требует прямого взаимодействия хелперной Т-клетки и В-лимфоцита (кошатная помощь).
Другой способ заключается в секреции и действии Т-клеточных цитокинов, которые важны для активации В-лимфоцитов (Parker, 1993). Как уже известно, взаимодействие между Т- и В-клетками представляет собой двунаправленный процесс: В-клетки презентируют антиген Т-клеткам и, в свою очередь, получают от них сигналы к делению и днфференцировке. Центральное, специфическое взаимодействие происходит при этом между комплексом молекула МНС класса П-антиген и Т-клеточным рецептором; оно усиливается за счет связывания LFA-3 с CD2, а также ICAM-1 или ICAM-3 с LFA-1. В процессе участвуют и другие молекулы клеточной поверхности: В7-1 и В7-2 на В-лимфоцитах взаимодействуют с CD28, что ведет к стабилизации мРНК для ИЛ-2 и других цитокинов в Т-клетках и в результате к продлению периода, в течение которого хелперная Т-клетка генерирует сигналы активации (Clark, Ledbetter, 1994; Lenschowet al., 1996). К настоящему времени установлено, что наиболее мощный сигнал для активации В-клеток обеспечивает молекула CD40 (Banchereau et al., 1991; Stout et al., 1996). Данный сигнал (связывание CD40 с CD40L) имеет важное значение для формирования центров размножения и развития гуморального иммунного ответа на Т-зависимые антигены. Подтверждением этого служит развитие иммунодефицитного заболевания - синдрома гипериндукции IgM - в результате мутации гена CD40L (Boise et al., 1995; Renshaw et al,, 1994). Данное расстройство характеризуется тем, что Т-хелперы не оказывают «помощи» В-клеткам и в результате образуется только низкоаффинные антитела IgM и отсутствует переключение синтеза иммуноглобулинов на продукцию высокоаффинных IgG или IgA (Foy et al., 1996). Хелперная функция Т-клеток в активации В-клеток может осуществляться также путем образования растворимых хелперных факторов, часто называемых цитокинами. При взаимодействии Т- и В-клеток Т-лимфоциты могут секретировать ряд цитокинов, оказывающих сильное действие на В-клстки. Такими цитокинами служат ИЛ-2 (индуктор пролиферации Т- и В-клеток), ИЛ-4 (действует на ранней стадии активации и пролиферации В-клеток), ИЛ-5 (мощный активатор В-клеток у мыши, но не у человека) и ИЛ-6 (эффективный стимулятор В-клеточной дифференцировки). Кроме того, хелперные Т-клетки синтезируют ФНО-а и ФНО-р\ Имеются сообщения о том, что эти молекулы важны для роста В-клеток. Активацию В-лимфоцитов вызывают и другие цитокины, в частности ИЛ-11 и ИЛ-13, по характеру действия сходный с ИЛ-4 (Goldsby et al., 2002; Ройт и др., 2000). Как теперь установлено, существует две субпопуляции Т-хелперов CD4+, различающихся по профилю синтезируемых ими цитокинов, и от этого набора зависит, какой из двух основных типов иммунного ответа будет реализован. У человека ТЫ-клетки, как правило, продуцируют ИФ-у, ФНО-р, ИЛ-2 и участвуют в опосредованных клетками воспалительных реакциях. Некоторые из цитокинов, выделяемые ТЫ, обладают провоспалитслъной активностью, а также стимулируют цитотоксические клетки и Т-эффекторы гиперчувствительности замедленного типа. В противоположность Thl-клеткам клетки Тп2 синтезируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10 и ИЛ-13 и усиливают образование антител, особенно класса IgE. В результате они стимулируют гиперпродукцию антител и аллергические реакции. Помимо всего прочего, цитокины, выделяемые ТЫ-клетками, подавляют активность Th2, и наоборот. Таким образом, любой иммунный ответ развивается в направлении либо ТЫ-, либо Тп2-типа. Более того, недавно были выявлены различия между ТЫ- и ТЪ2-клетками по маркерам поверхности. Для клеточной мембраны ТЫ характерно наличие LAG-3-антигена, относящегося к суперсемейству иммуноглобулин-подобных молекул. Клетки Th2 экспрессируют в гораздо большем количестве по сравнению с ТЫ-клетками маркер CD30, относящийся к семейству рецепторов для ФНО (Goldsby et al., 2002) 1.2.2.
Т-супрессоры Другая важная регуляторная функция Т-клеток состоит в их способности угнетать иммунный ответ. Это супрессорная активность - свойство популяции супрессорных Т-клеток. Доказано также, что Т-клетки, как CD4+, так и CD8+, способны подавлять иммунный ответ либо путем прямого питотоксического действия на антигенпрезентирующие клетки, либо путем выделения "супрессивных" цитокинов, либо путем передачи сигнала отрицательной регуляции (при связывании CTLA-4 с его лигандами), либо посредством идиотип-антиидиотипических сетевых взаимодействий. Функции Т-супрессоров (Ts) заключаются в подавлении пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов, что, следовательно, приводит к торможению выработки антител различных классов; обеспечении эффекта конкуренции антигенов; угнетении развития реакций гиперчувствительности замедленного типа, формировании цитотоксических Т-лимфоцитов, а также поддержании иммунологической толерантности. Различают специфические и неспецифические Ts. Действие первых специфично для конкретного антигена. Они накапливаются при повторных воздействиях и под влиянием больших доз антигена. Ts, проявляющие неспецифическую супрессию, накапливаются под влиянием повторных воздействий чужеродных антигенов или митогенов (ФГА или Кон А), при развитии реакции трансплантант против хозяина, при опухолевом росте, при аутоиммунной патологии, старении, паразитарных инфекциях и др. Они тормозят развитие различных иммунных реакций, пролиферацию клеток, накопление эффекторных лимфоцитов (Romangani, 1994; Ройти др. 2000) Было установлено, что супрессорная система состоит из трех клеточных популяций Т-клеток, обозначаемые как Tsi, Ts2 и Т$з. Клетки TSi специфичны к антигенам и вырабатывают специфический фактор TsFl, который обладает антиген связывающей активностью. Фактор TsFl как выяснилось, необходим для активации следующей субпопуляции Т-супрессоров, Ts2- Как было показано в работе Гермайна, в некоторых случаях специфичность Ts2 направлена не против антигена, как у клеток Tsi, а против идиотопов, имеющихся как у клеток TsFl, так и антител, против той антигенной детерминанты, которая стимулировала субпопуляцию Tsi(Germain et al., 1981).
Влияние электромагнитных излучений крайне высоких частот
В последние годы все больший интерес привлекают работы, посвященные влиянию электромагнитных волн миллиметрового диапазона на иммунную систему животных. Такое положение дела связано в основном из-за широкого применения миллиметровых волн в медицинской практике для диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний (Девяткови др., 1987; 1991). Первые экспериментальные исследования по биологическим эффектам ЭМИ КВЧ (30-300 ГГц) на кроветворную и иммунную системы млекопитающих были выполнены Севастьяновой Л.А. (Севастьянова и др., 1969; 1970а; 19706; 1973). Ею были получены первые результаты по ослаблению с помощью ЭМИ КВЧ последствий рентгеновского облучения на костный мозг, а также проведена оценка глубины проникновения миллиметрового излучения в кожу животных и выяснен характер распределения мощности этого излучения для животных и человека (Севастьянова и др., 1980; 1985; Севастьянова, 1983), Оценка реакций кроветворной и иммунной систем проводилась по количеству и состоянию клеток костного мозга и селезенки мышей и крыс. В ходе многочисленных экспериментов было выявлено, что одной из особенностей биологического эффекта ЭМИ КВЧ, которая проявляется in vivo и in vitro, является пороговый характер зависимости эффекта от плотности потока мощности. Так, при увеличении плотности потока мощности от 0,01 до 0,1 мВт/см2 эффект ЭМИ КВЧ возрастал и достигал определенного максимального значения, которое не менялось даже при 10 мВт/см2. Данная зависимость подтверждается результатами работы по влиянию миллиметровых волн на функциональную активность нейтрофилов мышей (Гапеев и др. 1996). Плотность потока мощности в большинстве известных работ, проводимых как на целом организме, так и на изолированных клетках иммунной системы, не превосходила нескольких единиц или долей мВт/см2. Тот факт, что количественная стабилизация биологического эффекта наступала, как правило, при использовании плотностей мощности, которые не могут вызвать тепловые эффекты, свидетельствует о сугубо специфическом избирательном действии электромагнитных волн на биологические объекты. В отличие от других частотных диапазонов, действие ЭМИ КВЧ носит "острорезонансный 1 характер действия, т.е. биологические эффекты этого вида излучения, проявляются в узких интервалах частот. Таких частотных полос, чередующихся с полосами, в которых биологических эффектов не наблюдается, может быть довольно много, что и было показано в разных лабораториях (Grundler et al., 1983; Pakhomov et al., 1997a; Pakhomov et al., 19976, Pakhomov et al., 1997в).
Так, например, предварительное облучение мышей миллиметровыми волнами 6,7; 6,85; 7,09-7,16; 7,26; 7,7 мм приводило к почти полному восстановлению общего числа клеток костного мозга, подвергшиеся разрушению рентгеном. Эффект носил острорезонансный характер, при изменении длины волны на 0,01 мм защита от рентгеновских лучей не наблюдалась. Механизм подобного явления не нашел пока четкого достаточного объяснения (Севастьянова и др., 1969; Севастьянова, Виленская, 1973; 1974). При экспозиции мышей в зоне действия миллиметровых волн с диапазоном частот 41,14; 41,34; 41,54 ГГц и интенсивностью 1 мВт/см2 в течение 30 мин/сут была обнаружена стимуляция фагоцитарной активности макрофагов. Максимальный эффект наблюдался при действии излучения с частотой 41,34 ГГц (Смолянская и др., 1979). Напротив, в другой работе было показано, что облучение мышей ЭМИ КВЧ (41,95 ГГц, 150 мкВт/см ) в течение 20 мин подавляло фагоцитарігую активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови. Значительное снижение уровня фагоцитоза отмечалось уже через 3 часа после 20-ми нутного облучения животных (Гапеев и др., 2000). При исследовании влияния непрерывного ЭМИ КВЧ низкой интенсивности (42,0 ГГц, 150 мкВт/см , 20 мин/день) на показатели гуморального иммунного ответа мышей не было обнаружено достоверных отличий в количестве антителообразующих клеток селезенки и титре гемагглютинирующих антител после одно - и пятикратных воздействий КВЧ-излучения. Однако, после серии воздействий в течение 20 суток хроническое облучение вызывало снижение числа клеток тимуса и селезенки. (Лушников и др., 2001). Напротив, при подборе определенных условий экспозиции животных, фракционированное миллиметровое излучение (40,0 ГГц, 1 мкВт/см2, 1,5 ч/день) приводило к снижению титра антител к карбоангидразе эритроцитов быка в сыворотке крови у иммунизированных мышей. При этом депрессивный эффект ЭМИ КВЧ был существенно выражен в процессе развития вторичного иммунного ответа к данному антигену (Sinotova et al., 2003). Еще одной характерной особенностью миллиметровых волн является их низкая проникающая способность в биологические ткани ( 1мм). Так, например, при облучении животных миллиметровые волны поглощаются практически полностью в тонком слое кожи толщиной примерно 0,3 - 0,5 мм в зависимости от используемой частоты излучения (Девятков и др., 1991; Gandhi et al., 1986; Gandhi, 1983). Поэтому основными мишенями при воздействии миллиметровых волн на биологические объекты, в том числе на организм человека, являются: плазматические мембраны клеток, цитозоль, капилляры кровеносной системы, рецепторные структуры кожи, связанные с основными регуляторними системами организма. Действительно, недавно было показано, что локальное воздействие низкоинтенсивным ЭМИ КВЧ (42,0 ГГц, 50 мкВт/см2) на проекцию точки акупунктуры лапы крысы приводило in vivo к дегрануляции тучных клеток дермы (Попов и др., 2002). Однако in vivo де грануляция тучных клеток наблюдается не только при действии ЭМИ КВЧ, но и при использовании низкоинтенсивного лазерного излучения с длинами волн 632 нм и 820 нм (Вержбицкая, 1988, Sayed, Dyson, 1996). Кроме того, было установлено, что миллиметровое излучение с частотой 61,22 ГГц повышало секрецию провоспалительного цитокина ИЛ-1р в кератиноцитах человека (Szabo et al., 2001). Известно, что хемотокси чески е агенты, выделяемые н процессе дегрануляции, привлекают к месту активации тучных клеток многие другие клетки, в частности, эозинофилы, нейтрофилы и мононуклеарные клетки, включая лимфоциты.
Более того, недавно было установлено, что некоторые цитокинм (ИЛ-5, ИЛ-8, ИФ-сс), выделяемые тучными клетками при их дегрануляции, также служат сигналами для активации хемотаксиса и активации воспалительных клеток (Gordon el al., 1990). Активированные моноциты секрети руют воспалительные пито кипы, такие как ФІЮ-сс, ИЛ-1 и ИЛ-б, что, в свою очередь, вызывает активацию лимфоцитов. Можно полагать, что реакция тучных клеток кожи может служить усилительным механизмом в каскаде событий, ведущих к системному отклику организма на воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения. Среди всех используемых излучений, ЭМИ КВЧ отличается наиболее широким использованием в медицинской практике (Голант, 1989; Betskii et al,, 2000). Анализируя экспериментальные работы по нммуномодулирующему действию миллиметровых волн, можно выделить ряд эффектов ЭМИ КВЧ на состояние иммунной системы человека и животных при различных патологиях и экспериментальных моделях. Данные многочисленных исследований показали, что ЭМИ КВЧ повышает фагоцитарную активность макрофагов (Хоменко и др., 1995; Rojavin et al., 1997), стимулирует пролиферацию и восстанавливает соотношение Т лимфоцитов CD4+/CD8+ (Куценок, 1994, Островский и др., 1995, Постовит, 1989, Запорожан и др., 1997), нормализирует продукцию иммуноглобулинов и увеличивает количество В-клеток (Bakalyuk et al„ 1997, Постовит, 1989). Существует ряд работ, в которых также показано, что ЭМИ КВЧ нормализует соотношение Т-клеток CD4VCD8+ в крови больных с сердечно-сосудистыми, онкологическими и др. заболеваниями (Кабисов, 1997; Девятков и др., 1995; Pletnev, 2000). Более того, применение ЭМИ КВЧ с частотой 42,2 ГГц восстанавливало количество и функции Т-лимфоцитов, повышало первичный иммунный ответ, опосредованный через Т-клетки (Logani, Ziskin, 1997). Облучение иптактных мышей ЭМИ КВЧ (42,19 ГГц, 15-17 мВт, 25 мин/сут) перед у-облучением (6,5 Гр) повышало выживаемость животных в 2 раза и увеличивало среднюю продолжительность жизни в 1,5 раза. Предварительное КВЧ-облучение было также эффективным для предотвращения развития гриппозной инфекции у мышей. У животных, облученных до заражения, увеличивалась степень выживаемости и средняя продолжительность жизни, причем наибольший эффект был получен при длительном периоде воздействий (17 сут).
Клеточные лини
В работе использовали следующие клеточные линии: клетки хронической миелоидной лейкемии К562, обладающие высокой чувствительностью к воздействию естественных киллеров; и клетки фибробластов мыши L929, использованных в качестве клеток-мишеней в цитотоксическом тесте для определения концентрации ФНО-а; клетки асцитноЙ карциномы Эрлиха, трансплантацией которых индуцировали рост солидных опухолей у мышей, 6.3. Формирование солидной опухоли Для инициации опухолевого роста использовали клетки асцитной карциномы Эрлиха в концентрации 2 105 клеток в 200 мкл физиологического раствора (0,87% NaCl) на мышь. Трансплантацию клеток асцитной карциномы Эрлиха проводили в заднюю конечность животного для образования солидной опухоли. Предварительно было проведено наблюдение за динамикой роста опухолей и гибелью животных. В этих условиях животные погибали за 75 дней. 6.4. Источники и характеристики излучения В качестве источника ЭМИ СВЧ использовали генератор качающейся частоты Я2Р -7612 (Россия) с диапазоном частот 8,15 — 18 ГГц, режим качания, I Гц, Генератор был оснащен аттенъюаторами для регулировки выходной мощности. Средняя плотность потока энергии составляла 1 мкВт/см . Облучение проводили в камере из оргстекла размером (25x25x40 см) на расстоянии 80 см от объекта до основания рупора антенны "П6-23А" с апертурой (25x34 см). Источником ЭМИ КВЧ служил генератор Г4-141 (Россия) с несущей частотой 42,2 ГГц, амплитудная модуляция (меандр) 10 Гц и средней плотностью энергии 1 мкВт/см2. Облучение животных проводили на расстоянии 40 см от рупора антенны с апертурой (35x45 мм). Мыши свободно передвигались по камере и получали пищу и воду ed lib на протяжении всего периода облучения. Выделенные иммунокомпетентные клетки (перитонеальные макрофаги, Т- и В-лимфоциты) облучались в чашках Петри (50x10 мм). Рупор генератора располагали по центру над пластиковой чашкой с клетками на расстоянии 40 (AM ЭМИ КВЧ) и 80 см (ЧМ ЭМИ СВЧ). Температура в помещении, где производилось облучение, составляла 21-22С. 6.5. Методика измерения сверхмалой плотности потока энергии Измерения проводили в 2 этапа. На первом этапе для более грубого измерения использовали Измеритель плотности потока энергии "ПЗ-18" (Россия). Измерения проводили с помощью антенны измерителя диаметром 13 см, которую фиксировали и устанавливали на нужном расстоянии от антенны генератора, как показано на рис. 1. Антенну измерителя постепенно сдвигали от центра в двух перпендикулярных направлениях с шагом 1 см, измеряя на каждом шаге показатели мощности (табл.2). Следует отметить, что чувствительность "Измерителя "ПЗ-18" не слишком высока, поэтому измерения проводили при достаточно высокой мощности генератора.
На втором этапе после измерения распределения потока на поверхности, проведенного при высокой выходной мощности генератора, измеряли точно величину этой мощности в центре поля с помощью высокочувствительной магнитной головки, закрепленной через волновод (при демонтированной антенне генератора) (рис. 2). После предварительных расчетов устанавливали нужную (пропорционально меньшую) выходную мощность генератора, обоснованно полагая, что средняя мощность на тестируемой поверхности уменьшается пропорционально, Зависимость интенсивности облучения (S) от расстояния между рупором и объектом, представлена на рис. 3. Максимальная ППЭ составляла 3 мкВт/см2 (в центре области облучения объекта) и минимальная - 0,1 мкВт/см2 (20 см от центра). Животное умерщвляли цервикальной дислокацией. Смазывали 70-ным раствором этанола, аккуратно разрезали брюшко и извлекали селезенку. Освобожденный орган немедленно переносили а наполненную средой DM ЕМ маленькую чашку Петри для отмывания. После этой процедуры селезенку переносили в стеклянный гомогенизатор, заполненный средой DMEM (4-5 мл) и гомогенизировали с помощью стеклянного или тефлонового пестика. Гомогенат, содержащий в основном лимфоциты аккуратно отбирали пастеровской пипеткой и переносили в стерильные пробирки (15 мл). Клетки селезенки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Для удаления эритроцитов к осадку клеток добавляют 3 мл изотонического раствора хлористого аммония (рН=7,2) и выдерживали 5 минут при комнатной температуре. После гемолиза эритроцитов клетки селезенки трижды отмывали большими объемами DMEM, чтобы избавиться от содержания NH4CI. Затем к осадку клеток добавляли 2 мл среды RPMI-1640, содержащая 10% ЭТС и тщательно ресуспензировали с помощью шейкера. Клетки подсчитывали в камере Горяева, предварительно окрасив в 0,1%-ном растворе трипанового синего, что позволяет выявить долго жизнеспособных клеток. На последнем этапе суспензию клеток селезенки доводили до определенной концентрации и переносят в чашки Петри для разделения лимфоцитов на субклассы с помощью "пэининга". 6.7. Разделение лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженной антителами к иммуноглобулинам ("пэннинг") Гетерогенную популяцию лимфоцитов фракционировали с помощью антител анти-Ig мыши (которые связываются с поверхностпьши антителами В-клеток), адсорбированные на поверхности пластика ("иэшшнг") (Wysocki and Sato, 1978). Для этого в полистироловую чашку Петри (100 15 мм) вносили по 8 мл PBS, содержащего 200 мкг/мл афинно-очищенных антител к иммуноглобулинам (Ig) мыши, и оставляли на ночь при 4С для адсорбции. Чтобы снизить неспецифическую адгезию клеток, в каждую чашку добавляли по 5-6 мл PBS с 0,2% БСА и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. БСА заполняет свободные места на поверхности пластика. Поверхность чашки промывали PBS, затем помещали по 2-4 10 клеток, суспендированных в 6 мл DMEM с 0,2% БСА и инкубировали 60 мин при 4С. По истечении половины срока инкубации содержимое чашек осторожно перемешивали круговым движением. Неприкрепившуюся фракцию клеток, которую в основном составляют Т-лимфоциты, осторожно ресуспендировали и сливали в стерильные пробирки.
Прилипшие к пластику антиген-позитивные клетки содержали В-лимфоциты. Полученные фракции Т- и В-клеток промывали средой DMEM, подсчитывали и разводили до концентрации 2,5x10 клеток/мл в среде RPMI-1640, содержащей 0,02 % гентамицина, 1% L-глютамина, 5хЮ"5М Р-меркаптоэтанола и 10% эмбриональной тсльячей сыворотки (ЭТС). 6.8. Выделение перитонеальных макрофагов Животное умерщвляли цервикальной дислокацией. Смазывали 70%-ным раствором этанола и удаляли кожу с брюшка, не прокапывая брюшную стенку. Делали инъекцию 2,5-3 мл среды (DMEM с 5% ЭТС) с некоторым количеством воздуха в брюшную полость. При этом брюшко мышки вздувается, затягивая место инъекции. Затем с помощью хирургического пинцета или лопаточки массировали брюшную стенку в течение 1 мин для отделения макрофагов в суспензию. Используя шприц, отсасывали жидкость с боковой стороны брюшной полости и затем переносили в стерильные пробирки (15 мл). Перитонеальные макрофаги разделяли по адгезивное, чтобы избавиться от сопутствующих клеток. Для этого клетки перитонеалыюго смыва суспензировали в концентрации 2x106 клеток/мл в среде RPMI-I640, содержащей 10 мМ HEPES, 10% ЭТС и помещали в полистироловые 24-луночные планшеты по 1 мл на лунку, оставляя на 1 ч при 37С и 5% СОг. Затем непри липшие клетки осторожно удаляли, а монослой макрофагов промывали один раз средой DMEM. Жизнеспособность клеток определяли с помощью 0,1% триианового синего. Макрофаги инкубировали в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 в течение 24 ч при 37С и 5% ССЬ. По окончании инкубации клетки лизировали 3-х кратным замораживанием - оттаиванием и полученные лизаты хранили при -20С. 6.9. Определение концентрации ФНО-а Продукцию ФНО определяли по цитотоксическому действию клеточных лизатов (макрофаги, Т лимфоциты) на клетки-мишени линии L929 (Rosental and Corsini, 1995). Клетки L929 культивиров&чи и плоскодонных 96-луночных планшетах по 3x10 клеток на лунку в среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС, 1% L- глютамина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37С и 5% ССЬ. Через 24 ч культивирования к образованному монослою клеток L929 добавляют 1 мкг/мл актином ицина D (Sigma, США), чтобы остановить рост клеток-мишеней и добавляли по 100 мкл клеї очного лизата па лунку.
Иммунный ответ в клетках иммунизированных мышей
Для оценки физиологической роли стимулирующего действия частотно-модулированного ЭМИ СВЧ провели исследование пролиферативной активности Т-лимфоцитов селезенки мышей, подвергнутых антигенной стимуляции путем внутрибрюшинного введения Кон А (иммунизированные мыши). Результаты, представленные на Рис. 8., свидетельствуют о том, что 5-часовая экспозиция животных ЧМ ЭМИ СВЧ вызывает точно такую же стимуляцию активности Т-лимфоцитов, что и введение мито гена. Более того, была обнаружена аддитивность действия двух факторов, каждый из которых вызывал повышение уровня пролиферации Т-клеток. Повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов иммунизированных мышей коррелировало с увеличением числа этих клеток в селезенке (рис. 9). Интересно отметить, что низкоинтенсивное ЧМ ЭМИ СВЧ, напротив, не вызывало заметных изменений количества Т-клеток селезенки. Таким образом, ЧМ ЭМИ СВЧ вызывает только функциональные, но не структурные изменения субпопуляции Т-лимфоцитов. Для того чтобы выяснить вопрос о том, способно ли частотно-модулированное ЭМИ СВЧ оказывать непосредственное воздействие на лимфоидные клетки, бьии проведены эксперименты, в которых изолированные Т- и В-лимфоциты были подвергнуты облучению in vitro в течение 1 часа, В этом случае также было обнаружено увеличение скорости бласттрансформации Т- и В-лимфоцитов, причем эффекты стимуляции клеток были практически одинаковыми, независимо от способа облучения - in vitro или in vivo. Действительно, после экспозиции лимфоцитов селезенки уровень митоген-вызвашюй пролиферации Т-клеток повышался примерно в 2 раза (рис. 10в), а иммунный ответ облученных В-клеток -до 135% по сравнению с пеоблученными лимфоцитами (рис. Юг), Интересно отметить, что облучение естественных киллеров селезенки мышей в течение 1 часа не вызывало каких-либо достоверных изменений цитотоксической активности этих клеток (рис. 1 16). Эти эксперименты позволили обнаружить удивительные факты. Так, если при использовании ЧМ ЭМИ СВЧ были выявлены только стимулирующие эффекты на функциональную активность клеток, независимо от способа экспозиции, то в случае использования AM ЭМИ КВЧ направленность эффектов была разной, в зависимости от того, подвергался ли экспозиции целый организм, либо изолированные клетки.
Действительно, при воздействии in vitro AM ЭМИ КВЧ в течение 1 часа на изолированные Т- и В-клетки обнаружили угнетающий эффект облучения, при этом уровень бласттраисформации Т-лимфоцитов достоверно снижался на 22% {рис. Ша), а ЛПС-индуцированная пролиферация облученных В-лимфоцитов была подавлена примерно на 25% (рис, 106). С другой стороны, в этих же условиях была значительно повышена активность ЕКК (рис. Па). Стимулирующий эффект AM ЭМИ КВЧ на активность ЕКК крови был обнаружен другими исследователями при экспозиции клеток ш vitro в зоне действия низкоиитенсивных миллиметровых волн (37,5 ГГц) в течение 1 - 2 ч, (Федорчук и др., 1992). Известно, что в отличие от ЭМИ СВЧ, КВЧ-излучение не проникает глубже, чем на 1 мм, поэтому были попытки объяснить эффекты миллиметровых волн процессами, происходящими в клетках кожи. По этой причине основными мишенями при воздействии миллиметровых волн на биологические объекты являются: плазматические мембраны клеток, цитозоль, капилляры кровеносной системы, рецепторыые структуры кожи, связанные с основными регуляторными системами организма. Действительно, недавно было показано, что локальное воздействие низкоинтенсивным ЭМИ КВЧ (42,0 ГГц, 50 мкВт/см2) на проекцию точки акупунктуры лапы крысы приводило к дегрануляции тучных клеток дермы (Попов и др., 2001). Однако дегрануляция тучных клеток наблюдалась не только при действии ЭМИ КВЧ, но и при использовании низкоинтенсивного лазерного излучения с длинами волн 632 им и 820 нм (Вержбицкая, 1988, Sayed, Dyson, 1996). Кроме того, было установлено, что миллиметровое излучение с частотой 61,22 ГГц повышало секрецию про воспалительного цитокина ИЛ-ір в кератин оцитах человека (Szabo et al., 2001) Известно, что хематоксические агенты, выделяемые в процессе дегрануляции, привлекают к месту активации тучных клеток многие другие клетки, в частности эозинофилы, нейтрофилы и мононуклеарные клетки, включая лимфоциты. Более того, некоторые цитокины (ИЛ-5, ИЛ-8, ИФ-а), выделяемые тучными клетками при их дегрануляции, также служат сигналами для активации хемотаксиса и активации воспалительных клеток (Gordon ct al., 1990). Активированные моноциты секретируїот воспалительные цитокины, такие как ФНО-а, ИЛ-1 и ИЛ-6, что в свою очередь вызывает активацию лимфоцитов. Можно полагать, что реакция иммунных клеток кожи (тучные клетки, кератиноциты и др.) может служить катализатором в каскаде событий, ведущих к системному отклику организма на воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения. Действительно, мы обнаружили, что после непрерывного воздействия ЭМИ СВЧ и КВЧ диапазонов в течение 5 ч наблюдалось резкое повышение пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов селезенки мышей. Более того, в настоящей работе показано, что воздействие частотно-модулированного ЭМИ СВЧ вызывало такой же иммунный ответ лимфоцитов, что и внутрибрюшинное введение Т-клеточного митогена - конканавалина А. В этих условиях не было обнаружено существенных изменений активности ЕКК. Как показано в данной работе, цитотоксическая активность ЕКК существенно повышалась при 24 ч экспозиции животных в зоне действия AM ЭМИ КВЧ, а затем восстанавливалась до нормального физиологического уровня через сутки после прекращения облучения. Возможно, что за этот период времени происходит снижение уровня ответных реакций активированных моноцитов и лимфоцитов на воздействие ЭМИ КВЧ, что приводит к снижению концентрации воспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИФ-а, р% у, ФНО-а) в крови и восстановлению цитотоксичекой активности ЕКК до исходного уровня. В качестве одного из возможных механизмов стимулирующего эффекта электромагнитных волн можно рассматривать повышение экспрессии стрессовых белков. Недавно в нашей лаборатории было обнаружено повышение экспрессии белка теплового шока 70 (БТШ 70) в Т лимфоцитах селезенки мышей после облучения in vivo и in vitro ЧМ ЭМИ СВЧ, когда интенсивность излучения была на несколько порядков меньше "теплового" уровня, составляя в среднем 1 мкВт/см2 (Глушкова, 2002).
Раннее такой же эффект был выявлен Гудман и др. при использовании низкочастотных магнитных полей (МП) с малой магнитной индукцией (0,8 jiT - 80uT) (Goodman et al., 1998). Авторами было показано, что после 20 мин непрерывного облучения клеток грызунов in vitro происходит резкое увеличение уровня БТШ 70 и постепенное снижение его до контрольных значений через 3 часа после воздействия МП (Carmody et al., 2000). Между тем известно, что экспрессия БТШ приводит к повышению противораковой и противовирусной резистентности (Przepiorka., Srivastava, 1998; Haviv et al., 2001). Таким образом, результаты, представленные в этой главе, указывают па то, что при однократном облучении in vivo низкоинтенсивные ЧМ ЭМИ СВЧ и AM ЭМИ КВЧ вызывают практически одинаковые изменения в функциональной активности ЕКК, Т- и В-лимфоцитов селезенки здоровых животных. Результаты показали, что воздействие ЧМ ЭМИ СВЧ является более эффективным в качестве фактора, вызывающего стимуляцию функциональной активности ЕКК. Глава 8. Влияние амплитудно-модулированного ЭМИ КВЧ на иммунную систему мышей с экспериментальными опухолями Канцерогенез представляет собой одну из самых тяжелых патологий, встречающихся у млекопитающих. Клинический прогноз в отношении этого заболевания в значительной степени зависит от состояния иммунной системы организма. В течение многих десятилетий проводятся интенсивные исследования проблемы иммунопатогенеза, сопровождающего развитие злокачественных опухолей, результаты этих работ приведены во многих публикациях (Во ct al., 2001; Booth et al., 2001; Inagawa et al., 1998). Анализ сведений, касающихся изменений функций клеток иммунной системы в процессе опухолевого роста, позволяет выделить несколько основных признаков иммунопатогенеза. Во-первых, появление продуктов, секретируемых собственно опухолевыми клетками, что вызывает подавление функций нормальных клеток в микроокружении опухоли. Очевидно, что этот процесс направлен на защиту опухоли путем блокирования иммунного ответа организма, стремящегося к ее отторжению.
