Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Тимус 8
1.1.2 Внутритимусная дифференцировка Т-лимфоцитов 8
1.1.3 Взаимодействие тимоцитов с окружением 10
1.1.4 Эндокринная функция тимуса. Тимусные гормоны 12
1.1.4.1 Функции основных тимусных гормонов 13
1.1.4.2 Интеграция тимуса в нейроэндокринную систему организма 15
1.1.4.3 Влияние тимусных гормонов на клетки периферической иммунной системы 19
1.1.4.4 Некоторые сведения о механизмах действия тимусных гормонов 20
1.1.5 Инволюция тимуса и возрастные изменения состояния иммунной системы 21
1.1.5.1 Трансплантация как способ компенсации инволюции тимуса ! 22
1.2 Особенности функционирования иммунной и нейроэндокринной систем у зимнеспящих грызунов 25
1.2.1 Иммунная система при гибернации 26
1.2.1.1 Сезонная инволюция тимуса у гибернантов 27
1.2.1.2 Гормональный контроль инволюции тимуса 29
1.2.1.3 Состояние иммунокомпетентных клеток при гибернации 31
1.3 Роль иммунной системы и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси в регуляции воспалительного процесса 33
1.3.1 Феномен активации иммунокомпетентных клеток 33
1.3.2 Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая ось и ее роль в регуляции воспалительного ответа 38
1.3.2.1 Участие иммунной системы в формировании стрессового ответа 40
1.3.3 Молекулярные механизмы активации клеток. Сигнальные пути43
1.3.3.1 Сигнальный каскад NF-KB 44
1.3.3.2 Сигнальный каскад SAPK/JNK 45
1.3.3.3 Биологическое значение и связь каскадов NF-KB И SAPK/JNK 47
1.3.3.4 Влияние гормонов на сигнальные каскады 48
1.3.4'БТШ - защитная система клеток 49
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1 Животные и модели 54
2.2. Культура клеток и измерение их функциональной активности .59
2.3. Статистический анализ 62
Глава 3. Результаты и их обсуждение 63
3.1 Торможение возрастной инволюции тимуса путем использования алло- и ксенотрансплантации 63
3.2 Сезонные изменения активности иммунокомпетентных клеток у зимнеспящих 66
3.3 Ответ клеток иммунной системы на введение тимусных пептидов в нормальных условиях и при остром токсическом стрессе .71
3.4 Исследование защитных свойств тимулина и тимопентина в условиях хронической интоксикации 94
Глава 4. Заключение 97
Выводы 99
Список литературы 100
- Внутритимусная дифференцировка Т-лимфоцитов
- Инволюция тимуса и возрастные изменения состояния иммунной системы
- Культура клеток и измерение их функциональной активности
- Сезонные изменения активности иммунокомпетентных клеток у зимнеспящих
Введение к работе
Актуальность проблемы. Тимус, являющийся центральным органом иммунной системы, функционально связан с нейроэндокринной системой и иногда рассматривается как компонент гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси. Основой концепции о тесной связи между нейроэндокринной и иммунной системами является способность иммунных клеток формировать ответ на гормоны или на медиаторы, секретируемые, например, нервными клетками (Акмаев, 1996). Несмотря на важную роль тимуса, у большинства млекопитающих с возрастом происходит инволюция этого органа (Bodey et al, 1997). Биологическое значение возрастной инволюции тимуса пока остается неизвестным, но, кажется логичным, что, не в последнюю очередь, именно с инволюцией тимуса связаны возрастные изменения, проявляющиеся в виде недостаточной активности иммунных клеток. В связи с этим, актуальным представляется вопрос о возможности- замедления возрастной инволюции тимуса, например, путем трансплантации тканей и органов иммунной системы.
В этой области уже имеются некоторые достижения.. Например, трансплантация ткани эпифиза молодых крыс в тимус старых животных приводит к восстановлению структуры тимуса, свойственной молодым животным и к значительному увеличению продолжительности жизни (Maestroni et al., 1988; Pierpaoli, Regelson, 1994).
В животном мире есть несколько видов млекопитающих, для которых характерна ежегодная сезонная инволюция и регенерация тимуса. Сезонные структурные изменения в тимусе были описаны у двух видов сусликов Cit.erythrogenys, Cit.citellus и сурка Marmota топах (Galletti, Cavalleri, 1972; Shivatcheva, Alexandrov, 1986; Shivatcheva, Hadjioloff, 1987). Тимус всех этих животных перед вхождением в спячку претерпевает почти полную инволюцию, а весной полностью восстанавливается. Интересно, что признаки возрастной инволюции тимуса у сусликов пока обнаружить не удалось.
Изучение коррелятивной связи между состоянием тимуса и активностью клеток периферической иммунной системы кажется перспективным в плане выяснения роли этого центрального органа иммунной системы в регуляции активности врожденного и адаптивного иммунитета. В этом смысле зимнеспящие животные с их ежегодным циклом инволюция/регенерация тимуса являются интересной природной моделью. Полагаем, что изучение возможности компенсации возрастной инволюции тимуса путем трансплантации стареющим животным ткани тимуса суслика, находящегося на стадии ежегодной регенерации этой железы, является перспективным направлением.
В качестве регуляторов активности периферических клеток иммунной системы целесообразно рассматривать не только тимусную ткань, но и продукты, вырабатываемые эпителиальными клетками тимуса, известные как тимусные гормоны. Влияния гормонов тимуса-на периферические иммунные клетки-' изучены недостаточно, а их исследование, учитывая очень тесные связи тимуса с системой стрессового ответа и другими' гормональными< системами, может быть весьма перспективным. Принимая во внимание высокую биологическую активность тимусных гормонов, целесообразно исследовать их влияние на иммунный статус организма не только в нормальных условиях, но и при патологиях, сопряженных с весьма стойкими формами иммунодефицита, таких, например, как острые и хронические воспаления.
Цель и основные задачи: Целью данной работы является.- изучение механизмов регуляции иммунных функций факторами тимусной природы и поиск способов компенсации' патологий, связанных с нарушениями работы иммунной системы. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1 Изучение возможности торможения возрастной инволюции тимуса у крыс методом трансплантации тимусной ткани в иммунопривелигированную область (переднюю камеру глаза) и сравнение эффективности использования в
данной модели аллотрансплантатов, полученных от молодых животных (крыс), и ксенотрансплантатов, полученных от зимнеспящих сусликов на стадии сезонной регенерации тимуса.
Изучение состояния иммунной системы зимнеспящих (по исследованию секреции фактора некроза опухолей лимфоцитами и макрофагами, а также уровня пролиферации Т лимфоцитов) в разные периоды их жизненного цикла, характеризующиеся разным состоянием регуляторных систем и, в частности, тимуса. Кроме оценки иммунного статуса зимнеспящих сусликов в течение годового цикла ставится задача исследования роли периферических клеток иммунной системы сусликов в физиологических процессах, сопровождающих кратковременные пробуждения животных в течение глубокой зимней спячки.
Изучение влияния двух гормонов тимуса - тимулина и тимопентина -на секреторную активность иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов и макрофагов) и на количество клеток в тимусе мышей. Исследование молекулярно-клеточных механизмов регуляторной роли тимусных гормонов путем оценки продукции цитокинов, оксида азота, защитных белков - БТШ70 и БТШ90, а также белков сигнального каскада NF-kB в иммунных клетках.
Изучение защитных свойств тимусных гормонов на моделях острого и хронического воспалений, индуцированных бактериальным токсином.
Внутритимусная дифференцировка Т-лимфоцитов
Процесс дифференцировки Т-лимфоцитов обеспечивается сложным комплексом взаимодействий, начинающимся с попадания предшественников Т-клеток в тимус, и заканчивающимся выходом зрелых клеток из тимуса. Дифференцировка включает в себя регуляцию экспрессии различных мембранных протеинов. Ключевым мембранным протеином является Т-клеточный рецептор (ТКР), который в клеточной мембране физиологически связан с молекулярным комплексом, называемым CD3. ТКР представляет собой гетеродимер, образуемый конфигурацией цепей еф или уб. Около 99% тимоцитов экспрессируют цепи еф, и лишь 1% - уб. Различные стадии дифференцировки Т-лимфоцитов. также определяются такими молекулами, к&к CD4, CD8, CD25 и протеогликан CD44. Главный момент в дифференцировке Т-клеток состоит в том, что после перераспределения генов начинают экспрессироваться все пептидные цепи ТКР, формируя огромное разнообразие рецепторов.
Коротко процесс дифференцировки Т-лимфоцитов можно описать следующим образом: Попадающие в тимус предшественники Т-лимфоцитов не несут на мембране ни один из перечисленных выше маркеров, за исключением CD44 (т.е. их фенотип описывается как CD3"CD4"CE)8rCD25" CD44+). По мере дифференцировки на мембране незрелых тимоцитов появляется маркер CD25 и клетки приобретают фенотип CD44+CD25+, а потом последовательно теряют маркеры CD44 и CD25. Затем клетки приобретают сразу два маркера CD4 и CD8 (дважды позитивные CD4+CD8+ тимоциты). Такие клетки в тимусе наиболее распространены и составляют 80% всех тимоцитов. На этой стадии происходит перераспределение генов ТКР, и на клеточной мембране начинают с небольшой плотностью появляться ТКР: Клетки с ТКР получают возможность взаимодействовать, с пептидами, презентируемыми на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС), находящихся- на мембранах нелимфоидных клеток. Такое взаимодействие приводит к положительной или отрицательной селекции, которое необходимо для нормальной дифференцировки. При положительной селекции незрелые, короткоживущие CD4+CD8+ тимоциты избегают запрограммированной гибели, и превращаются в зрелые, долгоживущие тимоциты. Этот процесс сочетается с процессом выбора линии - т.е. определением, того, каким будет готовый лимфоцит - CD4+ или CD8+ в зависимости от класса молекулы МНС, с которой, взаимодействует ТКР. Отрицательная селекция способствует выработке толерантности популяции Т-лимфоцитов к собственным пептидам организма.. Отрицательную селекцию проходят как дважды позитивные тимоциты, так и монопозитивные (CD4+ или CD8+) клетки. Прошедшие отбор монопозитивные тимоциты экспрессируют на мембране большое количество комплекса TKP/CD3 и покидают тимус, образуя подавляющее большинство1 Т-клеток периферической иммунной системы.
Нужно отметить, что дифференцировка тимоцитов происходит в ходе миграции клеток между долями тимуса. Большая часть незрелых тимоцитов, включая фенотипы CD3"CD4 CD8" и CD3+CD4+CD8+ локализована в корковой зоне тимуса, а зрелые клетки CD3+CD4+CD8" и CD3+CD4"CD8+ расположены в мозговом слое.
В ходе миграции и дифференцировки тимоциты взаимодействуют с различными компонентами своего окружения - трехмерной сети, образуемой эпителиальными клетками, макрофагами, дендритными клетками, фибробластами и компонентами внутриклеточного матрикса. Эти взаимодействия всегда временные, поскольку большинство клеток окружения - прикрепленные, а тимоциты мигрируют в ходе дифференцировки.
Между дифференцирующимися тимоцитами и клетками окружения происходят взаимодействия различного типа. Одно из, ключевых взаимодействий - это взаимодействие комплекса TKP/CD3, экспрессируемого дифференцирующимися тимоцитами, с молекулами МНС классов I- или II, расположенными на мембранах клеток, окружения в комплексе с распознаваемым эндогенным пептидом. Авидность этого взаимодействия является определяющим показателем для положительной или отрицательной селекции. Тимоциты, проявляющие высокую авидность, отсеиваются отрицательной селекцией и удаляются апоптозом. При этом погибает большое число потенциально аутореактивных Т-клеток. Положительную- селекцию проходит небольшая доля тимоцитов с промежуточным значением авидности к эндогенным пептидам. По-видимому, за положительную селекцию отвечают, главным образом, эпителиальные клетки тимуса (ЭКТ), а за отрицательную дендритные клетки гематопоэтического происхождения, хотя ЭКТ также задействованы в этом процессе (Andersen, 1996, Nossal, 1994).
Помимо описанного взаимодействия, тимусное окружение влияет на миграцию и дифференцировку тимоцитов и другими путями. Например, ЭКТ экспрессируют классические молекулы клеточной адгезии, такие как ICAM-1 и LFA-3, которые связываются, соответственно, с молекулами LFA-1 и CD2, присутствующими на тимоцитах (Nonoyama, 1989, Vollger, 1987, Patel, 1993). Во взаимодействии ЭКТ с тимоцитами могут принимать участие лиганды межклеточного матрикса, такие как фибронектин и ламинин и соответствующие интегриновые рецепторы VLA-4/VLA-5 и VLA-6 (Savino, 1993, Lannes, 1993, Villa Verde, 1994). Вероятно, внеклеточный матрикс формирует сложный макромолекулярный субстрат, по которому тимоциты мигрируют в пределах тимуса, следуя заданному пути, как на конвейере (Savino, 1996).
Клетки окружения также способны влиять на дифференцировку и пролиферацию тимоцитов при помощи растворимых полипептидов. Так, и ЭКТ, и дендритные клетки продуцируют цитокин интерлейкин-1 (ИЛ-1), стимулирующий пролиферацию тимоцитов (Le, 1987). Фактически, тимусный эпителий способен производить множество цитокинов, таких как ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, фактор стимуляции колоний гранулоцитов, фактор стимуляции колоний гранулоцитов и макрофагов, трансформирующий фактор роста-сс, трансформирующий фактор роста-р, фактор, ингибирующий лейкемию и фактор стволовых клеток (Le, 1993, Schluns, 1995). Например, было показано, что ИЛ-7 очень важен для дифференцировки. Он способствует перестройке генов ТКР, повышая продукцию и активность рекомбиназ (Muegge, 1993).
Инволюция тимуса и возрастные изменения состояния иммунной системы
Признаки инволюции тимуса начинаются с первого года жизни, и до достижения взрослого состояния организм теряет примерно по 3% клеток тимусного окружения в год. Далее скорость инволюции замедляется до 1% в год. Если экстраполировать эти данные, то получается, что полная, утрата тимусной ткани должна наступить у человека только к 120 году жизни. Сходные изменения претерпевает и продукция тимусных гормонов. Уровень тимулина в крови человека начинает заметно уменьшаться в 20-летнем возрасте и к 50-60 годам становится неопределимым (Анисимова, 1994, Bodey et al, 1997). Уровень тимозина-а и тимопоэтина начинает падать уже с 10-летнего возраста. Инволюция тимуса - это физиологический процесс, находящийся под контролем как нейроэндокринной системы, так и самих эпителиальных клеток тимуса. Эксперименты с трансплантацией тимусной ткани молодых животных старым показали, что скорость инволюции трансплантированной ткани определяется самой этой тканью, а не возрастом реципиента, т.е., скорее всего, является генетически детерминированной (Bodey et al, 1997). Вместе с тем, с возрастом возможности иммунной системы также претерпевают изменения, которые можно назвать разбалансировкой. Эта разбалансировка связана, в частности, с продукцией цитокинов. Так, показано, что секреция ряда цитокинов (ИЛ-1р\ ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНОа) культивируемыми макрофагами стареющих животных в ответ на введение липополисахарида снижена по сравнению с молодыми животными (Vega, 2004). В-клетки при стимуляции эндотоксином могут вообще не производить антитела, что также объясняется нарушениями в функционировании макрофагов (Chelvarajan, 2005). Таюке показано, что макрофаги старых животных плохо отвечают на стимуляцию интерфероном-у (Yoon, 2004). При старении также возникают нарушения в ответе Т-клеток и естественных киллерных клеток (Solana & Mariani, 2000). Результатом разбалансировки работы иммунной системы является повышенная чувствительность стареющего организма к инфекции и сепсису. Так, инъекция липополисахарида стареющим животным приводит к значительно более сильному повышению уровня цитокинов в крови, чем у молодых, и смертность среди стареющих животных также существенно выше (Saito, 2003).
Все это указывает на необходимость дальнейшего изучения роли тимусных гормонов в регуляции активности иммунных клеток. Как уже отмечалось выше, снижение эндокринной активности тимуса с возрастом играет ключевую роль в возрастных дисфункциях иммунной системы. Наличие связи между дефектами иммунной системы и широким кругом возрастных патологических процессов позволило даже сделать предположение о том, что старение иммунной системы может ограничивать продолжительность жизни (Walford, 1969).
Компенсация возрастных нарушений эндокринных функций тимуса может иметь перспективы, поскольку показано, что заместительная терапия введением гормонов способна частично восстановить различные иммунные функции в старости (Zatz, Goldstein, 1985). Одним из методов такой компенсации может стать трансплантация. В этой области уже существует ряд успешных работ. Например, трансплантация кусочков эпифиза молодых крыс в тимус старых животных приводит к восстановлению структуры тимуса, свойственной молодым животным и к значительному увеличению продолжительности жизни. (Maestroni et al., 1988; Rozencwaig et al 1987; Pierpaoli et al., 1991; Pierpaoli, Regelson, 1994). Однако данный метод имеет определенные сложности, поскольку чужеродная донорская ткань отторгается иммунной системой организма-реципиента, в связи с чем трансплантацию можно проводить только на фоне иммуносупрессии.
Тем не менее, известно, что некоторые области организма млекопитающих обладают свойствами относительной иммунопривилегированности. Это позволяет проводить пересадку клеток и тканей в эти участки без применения иммуносупрессивной терапии или минимизировать ее. К иммунопривилегированным зонам, в первую очередь, относят некоторые отделы головного мозга, переднюю камеру глаза и семенник. Связано это с особым строением гисто-гематических барьеров этих областей, в норме не пропускающих иммунокомпетентные клетки. Те же активированные иммунные клетки, которые все же проникают в иммунопривилегированные области, элиминируются под действием Fas-лиганда (Fas-L), экспрессированного в этих участках. Функционально активный Fas-L обнаружен также в эпителии и эндотелии роговицы, радужной оболочке глаза и в мозге, где Fas/Fas-L - система также протектирует иммунологическую привилегированность (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).
Если в мозг пересаживали, в основном, ткань ЦНС, то в переднюю камеру глаза (ПКГ) трансплантировали ткани самой различной природы, от нейрональных и опухолевых до эндокринных (Hoffer, Seiger, 1974, Adeghate,1998; Adeghate, Donath, 2000).
Несмотря на длительную историю трансплантации ткани в область ЦНС и переднюю камеру глаза успешных работ по компенсации нейрональных или эндокринных или иммунологических деффектов после пересадки соответствующих структур в эти области долгое время не было. Первые удовлетворительные результаты по компенсации недостатка дофамина с помощью аллотрансплантации в мозг реципиента дофаминсинтезирующих нейронов, на примере модели болезни Паркинсона у крыс, были получены лишь в 1979 году (Perlow et al., 1979; Bjorklund, Stenevi, 1979). В настоящее время накоплен значительный клинический опыт в области нейротрансплантации при болезни Паркинсона, начаты операции при других нейродегенеративных заболеваниях ЦНС (Lindval et al., 1994; Olanow et al., 1997). Несмотря на значительное количество экспериментальных и клинических работ по трансплантации тканей в относительно иммунопривилегированные зоны организма, в этой области осталось еще большое количество нерешенных проблем.
Несомненный интерес представляет возможность пролонгировать выживание трансплантата путем помещения его в те области, в которых в силу анатомического строения и выработки иммуномодулирующих агентов они могут функционировать длительное время. Такое помещение трансплантата позволяет проводить не только аллогенную, но и ксеногенную. трансплантацию.
Ксеногенная трансплантация вызывает особый интерес, поскольку у некоторых видов животных, в частности, зимнеспящих, тимус по своей природе способен подвергаться обратимой сезонной инволюции и регенерации, и можно предположить, что продукты, выделяемые тимусом в период регенерации, будут обладать биологической активностью в плане торможения возрастной инволюции тимуса нормотермных животных (например, крыс).
Культура клеток и измерение их функциональной активности
Для анализа состояния тимуса животных декапитировали, вскрывали грудную полость, извлекали тимус и помещали его в солевой раствор Хенкса без фенолового красного с глюкозой (5 мМ/л) и антибиотиком (гентамицин, 10 мкг/мл), содержащий 20 ммоль/л HEPES ("Serva", США) рН 7.2, температуры 37С.
Анализ количества клеток в тимусе. Тимусы протирали через капроновый фильтр, однократно отмывали после центрифугирования (700 g, 5 мин) и ресуспендировали в растворе Хенкса или RPMI-1640 ("Serva", США) до концентрации в интервале 105-108 клеток в 1мл. Концентрацию клеток определяли подсчетом в камере Горяева. Клетки инкубировали либо в пластиковых чашках Петри, либо в ячейках 96-луночного плоскодонного планшета).
Поскольку для биологической активности тимулина необходимо связывание с цинком, перед введением его подготавливали следующим образом: К раствору сывороточного тимического фактора (FTS) («American Peptides», США) добавлялась эквимолярная концентрация ZnCb с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение 5 мин. (Dardenne, 1982). В данных экспериментах мыши получали внутрибрюшинную инъекцию этого раствора (15 мкг/100 г массы тела) за полчаса до введения LPS или физиологического раствора. Раствор тимопентина («American Peptides», США) вводили внутрибрюшинно в дозе 15 мкг/100 г массы тела за полчаса до введения LPS или физиологического раствора. В экспериментах с острым токсическим стрессом использовали следующие группы мышей: 1. Получавшие 2 инъекции физиологического раствора с интервалом в полчаса. 2. Получавшие инъекцию физиологического раствора и, через полчаса - ЛПС. 3. Получавшие инъекцию тимулина и, через полчаса -физиологического раствора. 4. Получавшие инъекции тимопентина и, через полчаса -физиологического раствора. 5. Получавшие инъекции тимулина и через полчаса - ЛПС. 6. Получавшие инъекции тимопентина и через полчаса - ЛПС. После инъекций ЛПС и до начала экспериментов ни одно животное не погибло. Контролем служили животные, получавшие внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора.
Кроме этого проводили измерение продукции ФНО-а нормальными перитонеальными макрофагами мышей при добавлении в культуральную среду 1) тимулина (5 нг/мл), 2) ЛПС (1 мкг/мл), 3) тимулина и ЛПС (одновременно, те же концентрации).
Поскольку для биологической активности тимулина необходимо связывание с цинком, перед введением его подготавливали следующим образом: К раствору сывороточного тимического фактора (FTS) («American Peptides», США) добавлялась эквимолярная концентрация ZnCl2 с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение 5 мин. (Dardenne, 1982). Животные были разделены на три группы: 1) мыши, получавшие ЛПС согласно описанному протоколу. 2) мыши, получавшие ЛПС согласно описанному протоколу (раздел 2.1.3) и, одновременно, ежедневные инъекции тимулина (3 мкг/100 г веса тела). 3) мыши, получавшие ЛПС согласно описанному протоколу (раздел 2.1.3) и, одновременно, ежедневные инъекции тимопентина (3 мкг/100 г веса тела). Животные, получавшие гормоны, получали их, как и ЛПС, в течение 11 дней. Через 11 дней введение всех препаратов прекращали, и за животными вели наблюдение еще 20 дней после отмены, регистрируя динамику гибели животных. 2.2. Культура клеток и измерение их функциональной активности.
Животных декапитировали. Кровь собирали в пробирки во время декапитации животных. Образцы крови выдерживали в течение 3-5 ч при температуре 4С, центрифугировали при 2000 об/мин и отбирали супернатанты.
Все дальнейшие процедуры проводили в стерильных условиях. Селезенку гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе, клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 минут. После избирательного гемолиза эритроцитов с использованием изотонического раствора хлористого аммония лимфоциты трижды отмывали большими объемами среды DMEM («Sigma», США). Полученные популяции клеток подсчитывали и разводили до концентрации 2.5x106 клеток/мл среде RPMI 1640 («Sigma», США), содержащей 0.5% гентамицина, 1% L-глютамина, 5хЮ-5 М Р-меркаптоэтанола («Sigma», США) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, ЭТС, («Sigma», США).
Макрофаги выделяли из перитонеального экссудата мышей. Перитонеальные клетки осаждали, трижды промывали в среде DMEM," 1.5x106 кл/мл суспензировали в среде RPMI 1640, содержащей гентамицин HEPES («Sigma», США) и 10% ЭТС, и помещали в 24 луночные планшеты по 1 мл на лунку, оставляя на 2ч при 37 в 5%ном СОг- Надосадочную. жидкость осторожно удаляли, прикрепившиеся клетки промывали средой RPMI 1640 и монослой макрофагов оставляли инкубироваться в 1 мл среды в течение 24 ч при 37 в атмосфере, содержавшей 5% СОг. По окончании инкубации клеток в качестве образцов использовали лизаты клеток, полученные 3-кратной процедурой замораживания- оттаивания. 2,2.3.Измерение продукции интерлейкинов, ФНО-а и интерферона-/.
Для измерения продукции цитокинов Т-лимфоциты суспендировали в среде БІРМІ 1640, содержащей 1% L-глутамина, HEPES, 0.5% гентамицина, 5х10"5 М Р-меркаптоэтанола (Sigma, США) и 10% ЭТС и инкубировали 1,5 х 106 клеток/мл в 24-луночных планшетах в течение 72 ч при 37 в атмосфере, содержащей 5% СОг- По окончании инкубации супернатанты хранили при температуре -20С.
Концентрацию цитокинов в супернатантах лимфоцитов, лизатах макрофагов и в сыворотке крови мышей определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В работе использовали следующие антитела: кроличьи поликлональные антитела к мышиному ФНО-а; кроличьи поликлональные антитела к мышиному ИЛ-1а; кроличьи поликлональные антитела к мышиному ИЛ-2; кроличьи поликлональные антитела к мышиному ИЛ-6; кроличьи поликлональные антитела к мышиному ИЛ-10; кроличьи поликлональные антитела к мышиному интерферону-у. Все антитела и белки-цитокины были получены из «PeproTech» (США). В качестве вторичных антител использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с биотином («StessGen»), а затем применяли- раствор, содержащий стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена («ИМТЕК», Россия). После инкубации с комплексом стрептавидин-пероксидаза хрена наносили по 100 мкл зеленого красителя. ABTS («Sigma»), растворенного в 0.05 М цитратном буфере, рН 4.0, с 0.01% Н202, и после развития стабильной окраски реакцию останавливали добавлением-, 1.5 мМ NaN3, растворенного в 50 мМ цитратном буфере, рН 4.0. Оптическую плотность измеряли при 405 нм на спектрофотометре для планшетов. Каждый этап ИФА сопровождался многократным промыванием лунок PBS с 0.05% Tween 20.
Сезонные изменения активности иммунокомпетентных клеток у зимнеспящих
В первой части нашей работы было показано, что трансплантат тимуса, вероятнее всего, через секрецию низкомолекулярных веществ, способен оказывать иммунорегуляторное действие на тимусную ткань реципиента. Это позволяет предположить, что тимус может играть иммунорегуляторную роль и в отношении периферических компонентов иммунной системы.
Как уже отмечалось ранее, тимус зимнеспящих ежегодно претерпевает сезонную инволюцию и регенерацию. Вместе с тем, в литературе почти нет данных об изменении состояния периферических иммунных клеток зимнеспящих по сезонам.
В связи с этим нами была поставлена задача изучить сезонные изменения активности иммунных клеток сусликов. Для этого мьг изучали уровень продукции фактора некроза опухолей (ФНО) в перитонеальных макрофагах и Т-лимфоцитах селезенки зимоспящих якутских длиннохвостых сусликов Citellus Undulatus, находящихся на разных стадиях сезонного цикла. Параллельно с измерением продукции ФНО тестировали сезонные изменения; уровня пролиферативного ответа в Т-клетках селезенки животных.
Макрофаги. Функциональную активность макрофагов суслика оценивали по их ФНО-секретирующей способности. Результаты проведенных исследований показали весьма, высокий уровень продукции ФНО-а в перитонеальных макрофагах гибернантов в активный период (Рис. 3-3). Если сравнивать показатели продукции ФНО-а в макрофагах теплокровных грызунов с таковыми у суслика, то соотношение этих величин равно приблизительно 1:4. Т-лимфоциты. Продукция ФНО-(3 в Т-клетках селезенки сусликов в активный период в течение четырех месяцев не изменяется (Рис. 3-3), а ее уровень примерно такой же, как в Т-клетках теплокровных животных.
Известно, что осенью наступает время активной подготовки животных к зимней спячке. В это время в организме гибернантов происходят значительные перестройки метаболизма, запасание энергоемких субстратов и другие процессы, направленные на то, чтобы обеспечить выживание организма во время зимней спячки.
Исследуя состояние системы клеточного иммунитета зимоспящих сусликов в этот переходный период мы выявили ряд закономерностей, свидетельствующих о том, что функциональная активность и реакции клеток животных имеют много общего с таковыми именно в зимний, а не в весенне-летний сезон. Так, уровень продукции ФНО-а в макрофагах был того же порядка (даже несколько ниже), что и в период глубокого оцепенения, тогда как при пробуждении зимой, а также весной и летом в этих клетках наблюдали очень высокую величину секреции этого лимфокина (Рис. 3-3). Кроме того, Т-клетки активных сусликов в октябре отличались весьма низкой пролиферативной активностью (уровень включения ЗН-тимидина был в этот период самым невысоким в течение года - значительно ниже, чем весной-летом и даже чем во время зимней спячки) (Рис. 3-4).
Таким образом, можно заключить, что в осенний период наблюдается значительный спад функциональной активности иммунокомпетентных клеток гибернантов до уровней, близких к таковым зимой (а по некоторым показателям даже ниже).
Известно, что нормальная температура тела суслика составляет 37-39 С, однако во время спячки она колеблется в пределах нескольких градусов около 0С Кроме снижения температуры, зимняя спячка сусликов сопровождается резким снижением сердечного ритма и метаболизма. Глубокое оцепенение зимой у животных сохраняется 15-19 дней, после чего примерно на один день все показатели поднимаются до нормы, и животное при этом пробуждается, однако во время; таких пробуждений оно не потребляет пищи. У истинных гибернантов, каковыми являются длиннохвостые якутские суслики, продолжительность баутов (периодов глубокого оцепенения) постепенно уменьшается с приближением теплых сезонов: они составляют в среднем 14 дней в феврале и 6 дней в марте. Такая, же вариабельность характерна и для температуры тела и продолжительности периодов входа в спячку и выхода из нее: в сентябре-октябре температура тела гибернантов в спячке выше, а время вхождения в состояние оцепенения короче, чем в период с ноябряшо февраль (Wang, 1987).
![Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс]](/i/i/4438/203060.png "Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс] Омельченко Наталья Дмитриевна")
