Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Представление о стрессе и адаптации 13
1.2. Участие эндокринной системы в стресс-реакции и адаптации 17
1.3. Пептид КНСС человека, его биологическое значение и роль в адаптации 28
ГЛАВА II. Предмет, объекты и методы исследования
2.1. Предмет исследования 39
2.2. Объекты исследования 39
2.3. Методы и методики исследования 43
2.3.1. Биохимический метод: получение и очистка пептида КНСС человека 43
2.3.2. Биологический метод: исследование активной концентрации пептида КНСС человека 46
2.3.3. Физиологический эксперимент: введение пептида КНСС человека и плавание в антиортастатическом положении 46
2.3.4. Кинетическое исследование: определение работоспособности мышей 48
2.3.5. Гистологические методики: приготовление препаратов и их микроскопическое исследование 49
2.3.6. Морфометрические исследования: определение весовых коэффициентов органов и изучение структурных компонентов 50
2.3.7. Иммунологический метод: получение антисыворотки против пептида КНСС человека и определение концентрации пептида КНСС в крови мышей 51
2.3.8. Гематологическое исследование: изучение лейкоцитарной формулы 54
2.3.9. Этологический метод: исследование поведения мышей в «открытом поле» 55
2.3.10. Математический анализ: расчет достоверности межгрупповых различий по распределению критерия Стьюдента и исследование межиндивидуальной вариабельности с помощью корреляционного анализа 58
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Исследование гистологических препаратов крыс после хронического введения пептида КНСС человека 59
3.1.1. Действие пептида КНСС человека на структуру почки крыс 59
3.1.2. Действие пептида КНСС человека на толщину слоев коры надпочечников крыс 62
3.1.3. Действие пептида КНСС человека на морфологию тимуса крыс. 64
3.1.4. Действие пептида КНСС человека на структурные компоненты селезенки крыс 66
3.1.5. Действие пептида КНСС человека на морфологию щитовидной железы крыс 67
3.2. Влияние физиологического эксперимента на морфологию надпочечников мышей 70
3.2.1. Действие физиологического эксперимента на коэффициент массы надпочечников мышей 70
3.2.2. Влияние физиологического эксперимента на структуру коры надпочечников мышей 72
3.3. Влияние физиологического эксперимента на морфологию тимуса мышей.79
3.3.1. Действие физиологического эксперимента на коэффициент массы тимуса мышей 79
3.3.2. Влияние физиологического эксперимента на структуру тимуса мышей 81
3.4. Действие физиологического эксперимента на коэффициент массы селезенки мышей 84
3.5. Действие физиологического эксперимента на лейкограмму мышей 86
3.6. Влияние пептида КНСС человека на работоспособность мышей 94
3.7. Изменение концентрации пептида КНСС в крови мышей 101
3.8. Влияние пептида КНСС человека и физиологического раствора хлорида натрия на индивидуальное поведение мышей 105
3.8.1. Оценка фармакологического влияния пептида КНСС человека... 107
3.8.2. Интерпретация результатов теста «открытое поле» с точки зрения стресс-реакции и адаптации 107
Заключение 128
Научно-практические рекомендации 141
Выводы 142
Список литературы 143
- Участие эндокринной системы в стресс-реакции и адаптации
- Биохимический метод: получение и очистка пептида КНСС человека
- Действие пептида КНСС человека на структуру почки крыс
- Влияние пептида КНСС человека на работоспособность мышей
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ:
В числе ведущих проблем современной биологии стоит изучение механизмов поддержания постоянства внутренней среды и адаптации животных и человека к постоянно изменяющимся условиям внешней и внутренней среды, отражающей уровень активности и стабильности систем организма.
В настоящее время уже раскрыты адаптогенные свойства гормонов гипоталамуса, надпочечников и других эндокринных органов, а также их синтетических аналогов (Науменко Е. В., Попова Н. К., 1975; Виру А. А., Кырге И. К., 1983; Меерсон Ф. 3., Пшенникова М. Г., 1988; Бобков А. И. и соавт., 1992; Судаков К. В., 1992; Шенкер Дж„ 1993; Швец С. И., 1991, 1994; Обут Т. А., 1992; Гончаров Н. П., Колесникова Г. С, 2002; Dirksen R. et al., 1981; Houdouin F. et al., 1991 и другие). В тоже время О. А. Гомазков (1999) отмечает, что регуля-торные пептиды (РП) до настоящего времени остаются слабо изученными. Основной принцип РП по О. А. Гомазкову - их полифункциональность, включающая соотношение универсальности и специфичности - «в принципе могу многое, но в данный момент ситуации делаю то-то» - был убедительно доказан на примере ангиотензинов, энкефалинов и некоторых других пептидов (Ашма-рин И. П., 1986). Однако многие известные РП, в силу их малого изучения, рассматриваются как вещества «единичных» функций, что ограничивает применение их на практике.
Данная работа посвящена экспериментальному исследованию одного из РП - филогенетически древнего пептида каудальной нейросекреторной системы (КНСС) человека, называемого в литературе уротензином II. Изучению строения и функций пептидов КНСС млекопитающих посвящено множество зарубежных изысканий. Однако в современной отечественной литературе рассмотрение данной темы ограничивается лишь исследованиями, проводимыми нашей лабораторией.
Впервые каудальная нейросекреторная система была описана P. Enami (1955) у костистой рыбы (Auguilla Japonica). Им в хвостовом отделе спинного
мозга были найдены крупные нервные клетки, содержащие секрет, который по аксонам транспортируется в вентральное выпячивание - урофиз. Позже этот орган КНСС был описан и у других видов рыб, а из их урофиза были выделены пептиды U I, U II и другие. Затем был раскрыт их аминокислотный состав (Moore G. et al., 1977; Pearson D. et al, 1980; Clark B. R. et al., 1982; Fryer J. et al., 1983; Ichikawa T. et al., 1984; Onstott D., Elde R., 1986 и др.). Советская ученая И. И. Саенко (I. I. Saenko) (1972; 1981; 1985; 1991) также описала функциональную морфологию КНСС у осетрообразных (Choudrostei) и костистых (Telestei) рыб.
Несмотря на то, что в 1961 г. D. Ganguli и A. Rey нашли признаки кау-дальной неиросекреции у ряда других позвоночных, в том числе у лягушки, в научном мире вплоть до 90-х годов XX столетия преобладало убеждение о наличии этой неиросекреции исключительно у рыб, а заявление D. Ganguli и А. Rey, ведущими учеными мира, занимающимися структурой КНСС, было воспринято с большим сомнением. Это, в свою очередь, препятствовало изучению функции КНСС у более высоко организованных в эволюционном плане позвоночных.
В 1972 г. А. П. Бахтиновым с соавторами было морфологически доказано наличие КНСС у человека. Позже теми же исследователями иммунофлюорес-центным и биохимическим методами была идентифицирована данная нейро-секреторная система и у ряда других позвоночных. В 1977 г. из КНСС человека впервые было получено вещество, обладающее кардиотоническим и гипертен-зивным действием (Рацпредложение БРИЗ ВГМИ № 316), пептидную природу которого доказала В. С. Бахтинова (1986). На основании данного метода пептиды КНСС были выделены также из спинного мозга лягушки-жерлянки, прудовой лягушки, курицы, кролика, собаки, кошки, быка, свиньи, крысы (Бахтинов А. П., Бахтинова В. С, Адамович Ю. В., Семенищенкова Т. А., Самохина-Лушкина С. А., 1979-2004). Общепринятое мнение большинства иностранных исследователей, что регуляторные пептиды КНСС являются продуктами секреции только спинного мозга рыб, было убедительно опровергнуто также
J. M. Conlon и соавторами в 1997 году на основе методов молекулярного клонирования и идентификации генов пептида КНСС миноги.
На сегодняшний день известно, что пептид КНСС человека обладает высокой активностью, проявляя в весьма низких концентрациях не только кардио-тоническое и гипертензивное действие, но также вызывает антиандрогенный и антиэстрогенный эффекты. Он влияет на поведение, изменение массы животных, работу почек и т. д. (Бахтинова В. С, 1986; Бахтинов А. П. и соавт., 1995, 1999, 2000; Бахтинов А. П., Адамович И. Ю., 2000). Зарубежные ученые показали, что эти РП участвуют в миграции видов рыб, осморегуляции, работе сердечно-сосудистой и репродуктивной систем (Kelsall С. J., Balment R. J., 1998; Couloarn Y., Jegou S. et al., 1999).
Кроме этого, в современной научной печати появляются отрывочные данные о влиянии пептидов КНСС на стресс-реакцию и процессы адаптации. Так, в работах С. Cioni с соавторами (1997) в функционировании КНСС костистой рыбы Oreochromis niloticus доказано участие молекул NO, способных, как известно, вызывать высвобождение кортикотропин-рилизинг фактора и антидиуретического гормона - самых сильных либераторов адренокортикотропного гормона. С. J. Kelsall и R. J. Balment (1998) опубликовали данные, что U II повышает стероидную активность АКТГ у камбалы, что выражается в секреции кортизола. А. П. Бахтинов (1997), изучая иммунохимические показатели периферической крови студентов в стрессовых ситуациях, отметил изменение концентрации эндогенного пептида КНСС человека.
Как видно из современной научной литературы, физиологическое действие пептидов КНСС оказалось полифункциональным. Это роднит их с другими филогенетически древними РП и в достаточной мере обоснованно. В то же время, влияние пептида КНСС человека на стресс-реакцию и сопутствующие ей процессы адаптации исследовано эпизодично и бессистемно, что и побудило нас к дальнейшему изучению этого вопроса.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: провести анализ влияния пептида каудальнои неиросекреторнои системы человека на резистентную (стрессорную) адаптацию грызунов. Для достижения поставленной цели нами решались следующие ЗАДАЧИ:
1. Выяснить реакцию надпочечника, тимуса, селезенки и почки крыс на хроническое введение пептида каудальнои неиросекреторнои системы человека в дозе 25 мкг/кг.
Проанализировать влияние введения мышам пептида каудальнои неиросекреторнои системы человека в дозе 2,5 мкг/кг «в покое» и после антиортаста-тического плавания на лейкограмму, морфологические особенности тимуса и надпочечников, весовые коэффициенты этих органов, а также селезенки.
Оценить действие пептида каудальнои неиросекреторнои системы человека в дозе 2,5 мкг/кг на сезонное изменение работоспособности мышей.
Исследовать концентрацию пептида каудальнои неиросекреторнои системы в крови мышей после антиортастатического плавания и введения им пептида каудальнои неиросекреторнои системы человека в дозе 2,5 мкг/кг.
Изучить динамику поведения мышей методом «открытого поля» при получении ими на протяжении трех суток пептида каудальнои неиросекреторнои системы человека в дозе 2,5 мкг/кг.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате проведенных исследований впервые:
Доказано влияние пептидов КНСС позвоночных на регуляцию резистентной (стрессорной) адаптации.
Усовершенствована формула коэффициента подвижности Е. Н. Нестеровой (1997).
Обосновано использование времени, приходящегося на совершение одного двигательного акта и сверхредкого паттерна мышей «убегание в норку» в тесте «открытое поле», как показателя стрессореактивности грызунов.
Разработана и опробована схема иммунизации кролика для получения антисыворотки против пептидов КНСС позвоночных.
5. Предложен экспресс-метод полуколичественной оценки концентрации пептида КНСС в периферической крови животных с помощью реакции прямой гемагглютинации (РПГА).
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Анализ результатов исследования позволил расширить представления о полифункциональном действии пептида КНСС человека. Прослежено регуляторное действие этого пептида при формировании резистентной (стрессорной) адаптации. Обнаружена способность пептида КНСС человека - модулировать двигательную активность мышей и связанную с ней стрессоустойчивость в разные сезоны года.
С помощью корреляционного анализа обоснованно использование изменения объемов паттернов и интегральных характеристик в тесте «открытое поле» для оценки исходной стрессореактивности мышей и влияния на них стресс-факторов. Применение наших рацпредложений: «Практическое использование показателя времени, приходящегося на совершение одного двигательного акта в тесте «открытое поле»», «Усовершенствование определения коэффициента подвижности мышей в тесте «открытое поле»», «Идентификация и использование сверхредкого паттерна мышей «убегание» в норку в тесте «открытое поле»» сможет помочь более объективно оценить изменение структуры поведения грызунов.
Обнаруженный нами факт снижения концентрации эндогенного пептида КНСС мышей при экспериментальном стрессе может рассматриваться как прогностический критерий процветания или регресса популяций с помощью иммунологической оценки степени «напряжения» в данных условиях обитания, которую можно осуществить, применив наши рацпредложения: «Способ иммунизации кролика для получения антисыворотки против пептида КНСС свиньи» или «Ускоренный способ иммунизации кролика для получения антисыворотки против пептида КНСС человека», материалы которых вошли в состав заявки на изобретение «Способ получения и хранения антисыворотки против пептидов каудальной нейросекреторной системы (КНСС) млекопитающих», а также
и «Экспресс-метод исследования концентрации пептидов КНСС в крови мышей путем реакции прямой гемагглютинации».
Все эти рацпредложения были внедрены в научно-исследовательской лаборатории «Структура и функция КНСС позвоночных» при работе над диссертацией и применялись на протяжении 2002-2004 г. Материалы проведенного исследования использовались в учебном процессе на кафедре зоологии и анатомии БГУ им. акад. И.Г. Петровского с 2002 г.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
В формировании резистентной (стрессорной) адаптации участвует эндогенный регулятор - пептид каудальной нейросекреторной системы позвоночных.
Влияние пептида каудальной нейросекреторной системы человека на адаптацию организма грызунов носит фазный характер. На начальном этапе этот пептид проявляет себя как стресс-реализующий, а при дальнейшем ее развитии - как стресс-лимитирующий фактор.
Под действием экспериментального стресса концентрация эндогенного пептида каудальной нейросекреторной системы в крови мышей снижается.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ:
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии на рубеже третьего тысячелетия и пути их решения» (Брянск, 1999), международной научно-практической и учебно-методической конференции «Наука и образование - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Брянск, 2000), региональной научно-технической конференции «Вклад ученых и специалистов в национальную экономику» (Брянск, 2001), 1-ой молодежной научно-практической региональной конференции «Проблемы природопользования и экологии Брянской области» (Брянск, 2002), П-ой Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2003), Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функциологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), Междуна-
родной научно-практической конференции «Актуальные проблемы охраны здоровья учащейся молодежи» (Брянск, 2004).
Диссертация апробирована на совместном заседании кафедр: анатомии и физиологии человека и животных; теоретических основ физического воспитания; психофизиологии и клинической психологии Брянского государственного университета, а также кафедры нормальной и патологической физиологии, зоогигиены и радиобиологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии (2003).
ПУБЛИКАЦИИ:
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ. Послана 1 заявка на изобретение с приоритетом от 24.10.2003 г. Получены удостоверения БГУ им. акад. И. Г. Петровского на 6 рацпредложений.
Участие эндокринной системы в стресс-реакции и адаптации
В настоящее время установлено, что первичная реакция на стресс формируется в лггмбико-ретикулярных структурах ЦНС (Судаков К. В., 1997). В активации стрессовой реакции важную роль играет также миндалевидный комплекс лимбической системы мозга, повышающий адренокортикальную активность гипофиза (Glavin G., 1985), ретикулярная формация среднего мозга, а также гиппокамп вместе со структурой амигдала (Корнеева Е. А., 1993; Крыжа-новский Г. Н., 1997; Bealieu S. et al., 1987), под их регуляторным контролем находится также ГТНС (Крыжановский Г. Н., 1997; Магамаева С. В., 1993; Gray Т. S., 1991). Известно, что у женских особей, в отличие от противоположного им пола, в различных областях мозга и, в первую очередь, в гипоталамусе (Demarest К. et al., 1984) и амигдале (Arbogast L., Voogt Y., 1990) обнаруживаются более высокие уровни катехоламинов и синтезирующих их ферментов. Вместе с тем, существует прямая зависимость между интенсивностью катехо-ламинового метаболизма в мозге и устойчивостью к повреждениям сердечнососудистой системы при стрессе (Романова Т. П., 1990; Маслова Л. Н. с со-авт., 1990; Горбунова А. В., Каштанов С. И., 1990).
Влияние катехоламинов на чувствительность ГТНС к стрессам связано, прежде всего, с их стимулирующим эффектом в отношении синтеза и секреции кортикотропин-рилизинг фактора (КРФ) (Кассиль Г. Н. с соавт., 1978; Молотков О. В. с соавт., 1999; Al-Damluji S., 1988; Tsagarakis S. et al., 1988). Кроме того, катехоламины способны не только стимулировать, но и тормозить активность ГТНС. Показано, что при снижении уровня катехоламинов в мозге уменьшается чувствительность гипоталамуса к обратной тормозной связи (Kaneko М., Hiroshige Т., 1978). Этот факт позволяет предположить, что у самок уровень этого гормона в постстрессовом периоде нормализуется более быстро. Секрецию КРФ запускают не только катехоламинергические, но и другие моноаминергические нейроны. Ингибируется же выделение КРФ по ГАМК-опосредованному механизму (Bagdy G. A. et al., 1989; Palkovitz М. et al., 1995).
Доказано, что нейропептиды (НП) также оказывают модулирующее влияние на секрецию КРФ. Ингибирующее влияние, например, опиоидных пептидов на КРФ-секрецию связано с их антидофаминергическими эффектами по отношению к парацеллюлярным нейронам паравентрикулярного гипоталамуса (Stratakis С. A., Chrousos J. P., 1995). Сопряжение между стресс-реализующей и опиоидной системами является весьма прочным, так как оно детерминировано на генетическом уровне и определяется тем, что адренокортикотропный гормон (АКТГ) и Р-эндорфин синтезируются в клетках гипофиза в виде общего белка-предшественника - проопиомеланокортпина (ПОМК), содержащего наряду с кортикотропинподобным пептидом АКТГі.з9 и «пептидами сна»: АКТГ18.39 (СЫР), дез-ацетил-а-МСГ (дез АКТГыз) - а-, р и у-меланотропины, Р-эндорфин, а также р-липотроиин (Бабичев В. И., 1998). Вторая ступень сопряжения реализуется на регуляторном уровне и состоит том, что выделяющийся под влиянием АКТГ кортикостерон по механизму обратной связи ограничивает синтез АКТГ и эндорфинов в гипофизе (Амелин А. В. с соавт., 2000; Dirksen R. et al., 1981). Причем активация надпочечников не ограничивается выбросом катехоламинов, она зависит также от высвобождения из них мет-энкефалина, который образуется из проэнкефалина А, содержащегося в клетках надпочечников вместе с катехоламинами (Тигранян Р. А., Вакулина О. П., 1984; Van Loon G. et al., 1985). Кроме этого, образование ПОМК и высвобождение из него ряда пептидов и гормонов вызывает выделение серотонина (Chastrette N. et al., 1988, 1990; Cespuglio R. et al., 1990, 1992), который, как известно, участвует в процессах адаптации, влечения и влияет на настроение (Куликов А. В. с соавт., 1985; Houdouin F. et al., 1991). Серотонин обнаружен у всех организмов, от одноклеточных простейших до млекопитающих (Леонов Б. В., 1979), и даже в оплодотворенных яйцеклетках, где он принимает участие в дроблении и последующих стадиях эмбрионеза морских ежей (Бузников 1967). Клименко В. М. и Зубарева О. Е. (1999) показали, что серотонинергические системы опосредуют нарушение пищевого и коммуникативного поведения при стрессе.
К. А. Шемеровский (1999) предупреждает, что усиление активности кишки серотонином и гастрином происходит при одновременном ингибиро-вании активности ЖКТ и приводит к его язвобразованию. В. А. Отеллин (1999) отмечает участие центральной серотонинергической системы в регуляции других вегетативных функций: кровообращения, терморегуляции и в патогенезе нервно-психических расстройств. Известно, что адаптация к повторным стрессовым воздействиям, кроме прочего, сопровождается повышением содержания и резервных возможностей синтеза серотонина и дофамина (Голанов Е. В. с соавт., 1986; Kvetnansky R. et al., 1975 и др.). В различных областях мозга у самок были обнаружены более высокие уровни серотонина, чем у самцов (Carlson М., Carlson А., 1988). Согласно представлениям А. Г. Резникова (1982), Борисовой Н. А. с соавторами (1988), половые различия в концентрациях серотонина в мозговых структурах определяются изменениями уровня андрогена в критическом неонатальном периоде. При длительном стрессе у самок уровень серотонина в крови повышается, в то время как у самцов -снижается (Молодцова А. И. с соавт., 1978).
Серотонин оказывает фазные влияния на стрессорные реакции: активирует гипофизарно-надпочечниковый комплекс и секрецию пролактина (Нау-менко Е. В., 1971; Petroglia F. et al., 1985), выступая в качестве стресс-реализующего фактора. С другой стороны, его относят к стресс-лимитирующим механизмам (Сапронов Н. С, 1998; Томилова И. Н. с соавт, 2004). Это обусловлено его реципрокными взаимодействиями с катехоламинами в регуляции ГГНС (Хомуло П. С. с соавт., 1991; Ковальзон В. М. с соавт., 1997), а также участием его в реализации обратной тормозной связи (Alema G. et al., 1988).
Баланс между отрицательными и положительными эмоциями в организме поддерживают опиоидные нейропептиды. В области лимбической системы найдено более 200 нейропептидов (Орлова Н. Н., 2003). Исследование их структуры и физиологического эффекта, в том числе и участие этих биогенных соединений в процессах, адаптации идет довольно широко. Однако самым изученным остается Р-эндорфин, который является классическим стресс-лимитирующим фактором (Меерсон Ф. 3., Пшенникова М. Г., 1988; Dirksen R. et al., 1981). Эндорфин и его синтетический аналог даларгин (Бобков А. И. с соавт., 1992; Швец С. И., 1994) повышают пролиферативную реакцию клеток эпителиальных тканей при стрессе и препятствуют падению концентрации но-радреналина в первые часы стресса.
Известно, что опиоидные пептиды в малых дозах стимулируют ГГНС, а в больших дозах подавляют ее (Buckingham J., 1986). В данном случае они оказывают фазные влияния на стресс-реакцию, выступая на начальных этапах в качестве сресс-реализующего фактора, усиливая эмоциональные реакции, стимулируя секрецию кортикотропина, пролактина, вазопрессина (Ашмарин И. П., Каменская М. А., 1988), а по мере развертывания стрессорной реакции - в качестве ее ограничителя (Самсоненко Р. А. с соавт., 1988; Кузьмин А. Ю., 2001). Защитный эффект опиоидных пептидов в отношении сердечно-сосудистой системы осуществляется за счет прямого их действия на миокард путем снижения активации ПОЛ (Лишманов Ю. Б. с соавт., 1991). Опиоидные пептиды могут ослабить и даже устранить стрессовые изменения в слизистой ЖКТ (Виноградов В. А., Полонский В. М., 1985; Дворцин Г. Ф., Шаталов В. Н., 1991). В первой фазе стресса работает та часть эндорфиновой системы, которая усиливает продуктивное мышление, затем в коре головного мозга нарастает торможение (Кузьмин А. Ю., 2001; Haier R. et al., 1981).
Биохимический метод: получение и очистка пептида КНСС человека
Далее А. П. Бахтинов с соавторами (1999) показали, что ежедневное, в течение 22-х дней, введение по 32 мкг/кг пептида КНСС человека в 1 мл физиологического раствора в лимфатический мешок зеленой прудовой лягушки вызывает у этих животных снижение подвижности, что ранее было отмечено у крыс методом «открытого поля». Инъекция пептида КНСС человека в дозе 8 мкг/кг вызывала у них начальную реакцию «оглушения» (Бахтинов А. П., Бахтинова В. С, 1995). Кроме изменения поведения у лягушек на 8-11 день происходило увеличение массы тела по сравнению с контролем, что авторы связывают с отеком тканей, вызванным изменением функции почек. У лягушек обоего пола с 5-го дня эксперимента, также происходило побледне-ние брачной окраски кожи спины и особенно «бородавок» передних лап самцов, что исследователи объясняют влиянием пептида на функцию мела-ноцитов путем связывания антистероидного гормона (пептида КНСС) со специфическими эстрогеновыми и андрогеновыми рецепторами кожи, регулирующими брачную окраску амфибий.
А. П. Бахтинов и И. Ю. Адамович (1999) на выметанной и оплодотворенной икре зеленой лягушки показали, что пребывание ее в течение часа в воде, содержащей 32 мкг/л пептида КНСС быка, полностью ингибирует процесс развития зиготы икры и выклев из нее головастиков, тогда как в контрольной порции икры того же вида, взятой одновременно с экспериментальной от того же вида лягушек, через 14 дней выклев головастиков составил 98%. Позже А. П. Бахтинов и соавторы (2000) также доказали ингиби-рующее действие пептида КНСС кролика на развитие зародыша яиц курицы. При этом инкубирование яиц кур в течение 15 минут в растворе пептида КНСС с концентрацией от 3,75 мкг/кг до 25 мкг/кг уменьшало их выклев пропорционально росту концентрации пептида. Таким образом, как видно из литературы, физиологическое действие пептидов КНСС оказалось полифункциональным, что свойственно регуляторным пептидам и в достаточной мере продемонстрировано на изучаемом нами пептиде КНСС человека. Вместе с тем известно, что введение пептида КНСС в составе гомогената пояснично-крестцового отдела спинного мозга человека вызывает фазное влияние на развитие стресс-реакции, что характерно для многих ныне изученных гормонов и пептидов. При этом вклад очищенного от примесей пептида КНСС человека в стресс-реакцию и сопряженный с ней процесс адаптации до настоящего времени изучался бессистемно и не отражал полной картины этого процесса.
Практическая сторона изучения пептида КНСС человека, как эндогенного фактора регуляции адаптации заключается в высокой селективности его действия, проявляющейся в очень низких дозах. Они не накапливается в организме и не обладают токсичными и прочими вредными эффектами. При этом действие РП не ограничивается их инактивацией, так как они образуют, как было показано выше, сложные регуляторные цепи и каскады, иерархически соподчиненных «подэффектов» с другими медиаторными субстанциями, что было названо И. П. Ашмариным и М. Ф. Обуховой (1986) «пептид-регуляторным континуумом». Несмотря на то, что многие РП имеют период полураспада, измеряющийся минутами, после однократного введения в организм они способны вызывать многочасовые и даже многосуточные эффекты. Это происходит благодаря тому, что каждый из РП обладает способностью индуцировать выход в кровь, цереброспинальную жидкость и в межклеточные среды организма целого ряда других РП. Каждый РП, выход которого индуцирован другим пептидом, в свою очередь может индуцировать выход ряда следующих РП, при этом возникает цепной, каскадный регуляторный процесс. Биологический смысл существования подобных длительных регуляторных цепей, складывающихся из кратковременных звеньев, в том, что такая система является более гибкой к постоянно меняющимся факторам внешней и внутренней среды (Нейрохимия, 1996). геле и тонкослойной хроматографии на геле. В настоящее время Л. П. Бахти-новым и А. А. Бахтиновым разработан более совершенный метод получения пептидов КНСС (заявка на Изобр. № 2001120729/14(022058) от 24.07.2001). Он требует применения более сложной аппаратуры. Однако полученные новым и предыдущими способами пептиды КНСС проявили абсолютно одинаковую специфическую биологическую активность, выявленную у ряда животных: крыс, мышей, быков, свиней, котов, кроликов, собак, лягушек и куриц (Бахтино-ваВ. С, 1986; Бахтинов А. П., Адамович И. Ю., 1999; 2000; Душкина С. А., 2002; Пушкина С. А., Бахтинов, 2002; Пушкина С. А., Изотова О. Е., 2002). Поэтому мы ограничились получением пептида КНСС первым способом.
Для этого замороженный спинной мозг освобождали от твердой и мягкой мозговых оболочек. Гомогенизировали в дистиллированной воде, содержащей 0,05 М ЭДТА в соотношении 1:5. Полученный водный гомогенат ткани спинного мозга смешивали с хлороформом в соотношении 1:1 и сохраняли в холодильной камере при температуре +8 С в течение часа, периодически встряхивая смесь для полной денатурации высокомолекулярных белков и лучшей экстракции пептида. Затем, при помощи лабораторной центрифуги ЦЛН-2 при 8000±10% об/мин в течение 30 минут отделяли хлороформенную фракцию, а денатурированный белок и воду отбрасывали. Хлороформенный экстракт с помощью вентилятора высушивали в чашках Петри при температуре 15-18 С. Сухой хлороформенный экстракт гомогенизировали с дистиллированной водой. Полученную взвесь дважды осаждали сульфатом аммония. При первом 10%-ном насыщении сульфатом аммония взвесь освобождали от высокомолекулярных белков и липидов. Вторым 40%-ным насыщением сульфатом аммония в течение 8-10 часов при 5-10 С осаждали биологически активный пептид КНСС человека. Его осадок собирали на мелкопористом бумажном фильтре и растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия. Ввиду того, что препарат пептида КНСС человека термолабилен, его диализ против дистиллированной воды проводили в холодильной камере при температуре 0-4 С в стерильной стеклянной посуде в присутствии паров тимола.
Действие пептида КНСС человека на структуру почки крыс
Общеизвестно, что введение экзогенных веществ может рассматриваться в качестве стрессора. По Г. Селье, стресс характеризуется усилением секреции не только кортикотропина и глюкокортикоидов, но и соматотропина и минералокор-тикоидов. Однако в течение ОАС может нарушаться нормальное соотношение этих групп гормонов, что может привести к развитию болезней адаптации. Результатом преобладания количества «провоспалительных» гормонов может быть гипертония и нефросклероз. Это происходит благодаря избыточности защитных реакций, которые при системном дефиците энергии и массы обусловливают нарушение гомеостазе, приобретая свойство патогенности. Кроме того, в 1977 г. О. И. Кириллов экспериментально определил, что перегрузка организма синтетическим минералокортикоидным гормоном - деэсщжкортикссгеронацетатом (ДОКА), аналоги которого, как известно, выделяются при стрессе, односторонняя нефроэк-томия и диета, богатая хлористым натрием, также вызывают нефросклероз.
Исследование А. П. Бахтинова (1975) показало, что гомогенат, полученный из спинного мозга трупа 3-х месячного ребенка, у самок белых крыс на третий день эксперимента после его однократного парентерального введения вызывал набухание клеток почек, увеличение их объема и стертость характерного рисунка, что сопровождалось кариопикнозом и кариорексисом клеток почечных телец. На пятый день в почках отмечался некроз эпителия канальцев и гибель капилляров клубочков. Спустя 15 дней эпителий почечных канальцев принимал обычный вид, участки погибших телец Мальпиги заполнялись элементами соединительной ткани. Причем уже начало снижения клубочковой фильтрации сопровождается отчетливой тенденцией к повышению напряжения сердечно-сосудистой системы, выраженной в повышении артериального давления (Борисов И. А., 1999).
В 1999 г. А. П. Бахтинов с соавторами также показали изменения в функции почек зеленых прудовых лягушек под действием ежедневного, в течение 22 суток, введения в лимфатический мешок пептида КНСС человека в дозе 32 мкг/кг. При этом экспериментальные животные с восьмого дня эксперимента начали увеличиваться в объеме, разница которого на 6-13-й день варьировала от 6% до 13% по сравнению с интактной группой, что, видимо, можно связать со стрессогенным действием пептида КНСС человека и отеком тканей. Подобные изменения в функционировании выделительной системы при стрессе наблюдали многие ученые, например Н. С. Верхратский с соавторами (1985), Л. С. Воропанова (1995), Т. Williams с соавторами (1985) и другие, что объяснялось ими выделением большого количества антидиуретического гормона. Общеизвестно, что АДГ вызывает реабсорбцию воды из просвета собирательных канальцев нефрона, что концентрирует конечную мочу и препятствует выведению почками воды. Другой причиной падения водного диуреза можно считать спазм приносящих артериол нефронов в результате адренергической стимуляции сосудистой стенки, имеющей место при стрессе, а также непосредственное воздействие пептида ЮНСС человека (БахтиноваВ. С, 1986).
Важным подтверждением стрессогенности исследуемого пептида на выделительную систему лягушек служит тот факт, что при хронической почечной недостаточности возникает закономерное нарушение трансмембранного потока жидкости и ионов. Оно сопровождается нарастанием внутриклеточного содержания натрия, снижением содержания калия, что может быть также связано с влиянием пептида КНСС человека на калиевые каналы (Бахтинова В. С, Бахтинов А П, 1983). При этом возникает гипергидратация клеток и падение трансклеточного электрического потенциала. При этом существенно изменяется функциональная способность эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, клеток скелетной мускулатуры, что можно соотнести с развитием анемии, склонностью к инфекциям, гемор-рагиям, миопатиям и т. д. Если же клетки почек неспособны в достаточной мере обеспечивать водно-электролитный баланс, то в организме возникает тотальная гипергидратации. При этом нарушения возникают не только в периферической, но и в центральной нервной системе (Борисов И. А., 1999).
Наши гистологические исследования также указывают на стрессогенный характер действия пептида КНСС человека при его хроническом ежедневном получении в дозе 25 мкг/кг в течение сорока суток (см. 2.2). У крыс, задействованных в этом эксперимента, при получении ими исследуемого пептида КНСС, была также отмечена утрата сосудистых клубочков в почечных тельцах, которые выглядели пустыми. В поле зрения, равном 134,03 мкм2, в корковом веществе этих экспериментальных животных количество склерозированных клубочков возрастало в 3,33 раза (Р 0,01), а число функционирующих почечных телец уменьшалось в 1,34 раза (Р 0,01) по сравнению с контролем (табл. 5).
То есть, по нашим данным, пептид КНСС человека в большей степени влияет на сосудистый клубочек, что подтверждается более ранними исследованиями А. П. Бахтинова и В. С. Бахтиновой (1983-1997), которые определили, что этот пептид КПСС человека, сходно с СНС, активно влияет на тонус кровеносных сосудов, а это, в свою очередь, может привести к ухудшению кровоснабжения клубочков и их редукции.
Оптимальная регуляция сложных биохимических и физиологических процессов в организме животных в значительной степени обеспечивается состоянием эндокринной системы (Деев Н. Г., 2000). Надпочечники, как по происхождению, так и по своим функциональным свойствам, являются сложной железой, гормоны которой играют жизненно важную роль в процессах метаболизма и физиологической адаптации организма к меняющимся условиям окружающей среды. Поэтому состояние микроструктуры надпочечников, синтез и секреция кортикостероидов, адреналина и норадреналина является общепринятыми показателями стресс-реакции и адаптации, отражающими ее продолжительность, глубину и стадийность (Г. Селье, 1960; Кассиль Г. Н. и Матлина Э. Ш., 1973; Швалев В. Н. и со-авт., 1985; Сидорова О. Г., 2001 и др.).
Явление гиперкортицизма за счет увеличения пучковой зоны, секретирую-щей глюкокортикоиды, стало классическим маркером напряжения адаптационных процессов организма (Новицкий А. А. с соавт, 1998). Оно сопровождается изменениями ультраструктуры кортикоцитов, приводящими к повышению способности синтезировать кортикостероиды. Результаты перестройки заключаются в том, что при непредельных нагрузках степень активации этого звена и, соответственно, «выброс» кортикостероидов и повышение их содержания в крови в тренированном организме значительно меньше, «экономнее» (Кассиль Г. Н. и соавт., 1978; Виру А. А., 1981; Коплик Е. В. с соавт., 1995 и др.). Вместе с тем, продолжающийся под действием стресс-факторов рост коры надпочечников является классическим маркером истощения физиологических параметров этих желез, поскольку имеющихся в организме опытных животных физиологических систем все еще недостаточно для поддержания функциональной активности на необходимом для стресса уровне. В тоже время снижение радиуса коры надпочечников при стрессе свидетельствует по В. М. Ковальзону (1999) об «антистрессовом сдвиге» в этих железах, наблюдаемом у предварительно адаптированных животных.
В 1975 г. А. П. Бахтинов отметил, что у самок белых крыс на однократное парентеральное введение гомогената из спинного мозга трупа 3-х месячного ребенка на третий день эксперимента в надпочечниках возникали сходные со стрессом изменения.
Влияние пептида КНСС человека на работоспособность мышей
Для моделирования гипердинамии животных нами было избрано плавание в антиортастатическом положении, предложенное О. М. Авакяном и Э. А. Шириня-ном (1977). Плавание, как один из способов стрессирования животных, отличается простотой воспроизведения эксперимента (Саратиков А. С, 1974; Dawson С, 1970; Porsolt et al., 1979). Имеются две модификации: свободное плавание и плавание с дополнительным грузом. Однако эти варианты, в отличие от используемых нами, имеют ряд существенных недостатков. Во-первых, как замечают О. М. Авакян и Э. А. Ширинян (1977), мыши обладают хорошей плавучестью, чему способствует обильный шерстяной покров, который адсорбирует пузырьки воздуха, образуя своеобразные «воздушные подушки», и могут оставаться на поверхности воды без видимых движений. Во-вторых, особи одной породы, пола, возраста и массы существенно разнятся по плавательной выносливости. Наблюдаемый при этом большой разброс является результатом состояния «предрабочих» биохимических реакций (Виру А. А., 1976), степени тренированности организма (Froberg S. О., 1971), соотношения массы плотных тканей и жира, влияющих на погружающую силу массы в воде (Dobeln W., Holmer J., 1974).
Выбранный нами метод моделирования стресса основан на безусловных рефлексах, проявляющихся в воде в виде интенсивной мышечной деятельности. Животные совершают плавательные движения в том случае, если касаются лишь мордочкой и кистями передних лап поверхности воды, находясь в вертикальном положении головой вниз (рис. 1). При прекращении мышечной деятельности часть головы (рот и нос) оказываются под водой. То есть, они могут «отдыхать» лишь ценой задержки дыхания на несколько секунд, что и указывает на утомление.
Работоспособность - способность организма реагировать на нагрузку и выполнять, таким образом, определенную работу. Известно, что на работоспособность оказывает влияние окружающая среда: время суток, температурный режим и другие экологические факторы, в том числе и времени года (Ульмер Г., 1986). Проведенное нами исследование охватило два сезона - лето (июль) и зиму (январь). Ее оценка независимо от времени года проводилась однотипно (см. 2.3.3 и 2.3.4). Результаты изучения работоспособности представлены в таблице 14. Известно, что во время тяжелой работы, когда организм вынужден переходить на анаэробный тип окисления, возникает избыток молочной кислоты, что ведет к развитию чувства утомления (Арустамов Э. А. с соавт., 2000). Утомление -это состояние, вызываемое тяжелой работой и связанное с пониженной работоспособностью. Оно может быть физическим, то есть мышечным, или психическим. Нервно-психическое утомление, которое моделировалось в нашем эксперименте, связано, прежде всего, с функционированием ретикулярной формации, активность которой изменяется не только при интенсивной умственной работе, но и под влиянием однообразной деятельности (Ульмер Г., 1986).
Нередко при стрессе угнетается секреция андрогенов у самцов и эстрогенов у самок (Кириллов О. И., 1977; Алешин Б. В., Бондаренко Л. А., 1984; Маевская Л. П. с соавт., 1992). При этом избыток глюкокортикоидов в сочетании с недостатком андрогенных гормонов может оказывать различное патогенное влияние на организм, в частности, приводить к подавлению механизма иммунологической защиты (Madden К., Felten D., 1995). Кроме этого, содержание тестостерона прямо коррелирует с двигательной активностью (Чирков А. М. с соавт., 1993). Есть мнение, что корреляции между фазами полового цикла и работоспособностью нет (Astrand Р.- О, Rodahl К., 1977 и др.). Другие исследователи утверждают обратное: изменение функции яичников при стрессе определяется фазой овуляторного цикла (Гончаров Н. П. с соавт., 1977; Молодцова А. И. с соавт., 1978). Так, Ф. А. Иорданская (1999) определила, что максимальных спортивных успехов женщины достигают в предменструационный и менструационный период. В нашем эксперименте также бьша определена тенденция влияния астрального цикла самок мышей на продолжительность их плавания. При этом максимальная работоспособность отмечалась в период течки зимой при получении животными физиологического раствора хлорида натрия, а также пептида КНСС человека. Летом самое длительное пребывание животных в воде наблюдалось после получения ими физиологического раствора в тот же эстральный период. Пептид КНСС человека увеличивал работоспособность самок мышей в фазе межтечки. К сожалению, достоверных отличий в этом случае нам выявить не удалось ввиду малой выборки вариантов реакции животных в исследуемых группах, но в данном исследовании мы не ставили перед собой подобной задачи. Отметим, однако, что изменение показателей работоспособности при различных фазах полового цикла самок мышей, под действием исследуемых нами веществ, несомненно, заслуживает дальнейшего рассмотрения. Для исключения влияния полового цикла на результаты работоспособности по тесту плавания у самок в данном исследовании мы брали среднее значение времени утомления животных каждой фазы цикла во всех группах животных.
Как указывает Ф. И. Фур дуй (1986), в пределах каждого помета существуют вариации стрессоустойчивости и стрессореактивности к одному и тому же воздействию, что А. П. Дубов (1987) связывает с изменением степени и формы симметрии, являющейся общей биологической закономерностью живой материи. Поэтому в эксперименте мы использовали мышей «среднереактивных», для чего из полученных результатов тестирования исключали явно крайние значения показателя работоспособности, характеризующие вариабельность признаков биоэнантиоме-ров L- и D-форм.
В январе пептид КНСС человека в дозе 2,5 мкг/кг в 1 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно вводимый животным, по сравнению с 1 мл одного лишь физиологического раствора хлорида натрия, вводимого тем же методом, достоверно повышал работоспособность в 2,86 раза или 185,92% для самцов (Р=0,001) и в 2,04 раза, что равно увеличению на 104,27% для самок (Р=0,002).
В июле, как свидетельствуют статистические расчеты, при получении мышами пептида КНСС человека, в отличие от 0,9%-ного раствора хлорида натрия, наблюдалось снижение работоспособности летом у самцов в 3,28 раза, то есть на 69,50% (Р=0,001), а у самок в 1,77, что равно уменьшению на 43,36% (Р=0,008). Таким образом, летом действие пептида КНСС человека в дозе 2,5 мкг/кг на работоспособность мышей принципиально отличается от выявленного зимой. Межсезонное сравнение времени утомления мышей
