Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор данных литературы 10-42
1.1. Пептидэргическая регуляция функций организма
1.1.1. Основные группы регуляторных пептидов
1.1.2. Влияние глицил-гистидил-лизина на функции организма...
1.1.3. Функциональная активность аминокислот, составляющих глицил-гистидил-лизин
1.2. Физиологические особенности регенерации кожи
1.2.1. Морфофункциональные особенности кожных покровов и их физиологической регенерации
1.2.2. Нейроэндокринные и иммунокомпетентные клетки кожи.
1.2.3. Механизмы нарушения гомеостаза и особенности регенерации кожи
Глава 2. Материалы и методы исследования 43-46
Глава 3. Влияние глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на физиологическую регенерацию кожных покровов и иммунную функцию при внутрибрюшинном введении
Глава 4. Регенераторная активность глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот и их влияние на функцию нейтрофилов при внутрикожном введении в физиологических условиях
Глава 5. Эффекты глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот в условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении
Глава 6. Репаративная активность глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот и их влияние на функцию нейтрофилов в условиях экспериментального раневого процесса при их внутрикожном введении
Заключение 86-100
Выводы 101-102
Практические рекомендации 102
Список литературы
- Пептидэргическая регуляция функций организма
- Влияние глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на физиологическую регенерацию кожных покровов и иммунную функцию при внутрибрюшинном введении
- Регенераторная активность глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот и их влияние на функцию нейтрофилов при внутрикожном введении в физиологических условиях
- Эффекты глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот в условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение физиологической роли регуляторных пептидов является одним из приоритетных направлений современной биологии и медицины (10, 26, 58). Известно, что регуляторные пептиды являются важнейшими компонентами в функционировании основных регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной (5, 70, 79, 116). Они осуществляют взаимодействие этих систем и играют ключевую роль в поддержании гомеостаза, а при его нарушении регуляторные пептиды определяют основные параметры формирования компенсаторно-приспособительных реакций организма (11, 15, 48, 87, 103, 125).
В то же время, возможность искусственного синтеза необходимых
биорегуляторов делает вполне реальной проблему создания новых
высокоэффективных фармакологических средств пептидной природы. Уже
сегодня ряд пептидов используются в клинической практике. Хорошо известны
такие препараты как даларгин, семакс, миелопид, тимоген, иммунофан,
дельтаран и другие (22, 27, 75, 84). Поэтому исследование механизмов
действия регуляторных пептидов имеет как теоретический интерес для
выяснения процессов регуляции жизнедеятельности, так и важное
практическое значение.
В основе физиологии каждого органа лежат процессы регенерации, интенсивность которых существенно меняется при нарушении гомеостатического баланса (98). Стимуляция регенерации способствует развитию восстановительных процессов в тканях организма (32, 96). В связи с этим, не менее важной задачей, стоящей перед медициной, является выявление факторов, усиливающих регенераторную способность тканей и органов (88). Поскольку травматизм в различных социальных и возрастных группах населения неуклонно растет (107), это в полной мере относится и к регенерации кожных покровов. Также представляет интерес выявление иммунотропной
активности этих- факторов;, так' как, иммунная система принимает непосредственное участие в регенераций-тканей организма (49):
Ш настоящее время в качестве средств для; лечения ран изучены и используются; различные стимуляторы регенерации; Это методы:физического воздействия; такие как магнитное (16; 99), электрическое, (3), лазерное излучение (18, 109), а: также лекарственные препараты общего/ и местного действия1 (46, 108;, Г Вії); применение различных трансплантантов; (61;, 69)., Шри этом возможность использования; регуляторных, пептидов, а: также механизмы. их, влияния- на'; процессы регенерации; кожиг по-прежнему- остается малоизученнойюбластью; медицины;
Одним из. пептидов; участвующих-; в- регуляции; процессов; роста и дифференцировки клеток, является ростовой- фактор NHiz-Cjly-E-His-E-bys-ЄООН; (GHb): Так как этот пептид повышал выживаемость гепатоцитов in vitro,. то; первоначально-- был; назван фактором» роста клеток печенш (198): Также . известно стимулирующее; влияние этого пептида* на рост волос; (219), синтез; коллагена, фибробластами, (-172)1 ш накопление; межклеточного вещества соединительной ткани (155): Однако? большинство известных; данных; о действии; GHE полученоип» vitro; тогдаі как системные эффекты» пептида на уровне делостногоюрганизма требуют дальнейшего изучениям
До; сих пор малол изученной областьюь остается иммунотропная
активность GHE и; прежде, всего; его: влияние на функцию нейтрофилові Эти
клетки/первыми из фагоцитов приходят в очаг воспалениями от:их активности
существенно; зависит длительность раневого- процесса (114); Также
представляется: актуальным; исследование; эффектов, составляющих: GHL
аминокислот, которые в свою очередь могут оказывать,влияние на регенерацию' .
кожи и? функцию нейтрофилов (12 Г). ';...''
Также не., ясно, как меняется; активность GHL при усилении компенсаторно-приспособительных реакций организма; вызванных, травмами;
кожных покровов. Кроме того, не известно, как активность GHL связана с эффектами аминокислот, образующихся при его возможном протеолизе.
Поэтому целью исследования является: выявление регенераторных эффектов глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот в физиологических условиях и при повреждении кожи, а также их влияния на функцию нейтрофилов.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние глицил-гистидил-лизина и составляющих его
аминокислот на физиологическую регенерацию кожи и активность
нейтрофилов крови при внутрибрюшинном введении.
Установить эффекты глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на физиологическую регенерацию кожи и функцию нейтрофилов крови при внутрикожном введении.
Выявить влияние глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на заживление кожных ран и активность нейтрофилов крови при внутрибрюшинном введении.
4. Установить репаративные эффекты глицил-гистидил-лизина и
составляющих его аминокислот, а также их влияние на функцию нейтрофилов
крови при внутрикожном введении после моделирования ран кожи.
5. Провести сравнительный анализ репаративных эффектов глицина,
гистидина и лизина и их влияния на функцию нейтрофилов крови с целью
выявления наиболее активной аминокислоты в структуре глицил-гистидил-
лизина.
Научная новизна. Установлены регенераторные эффекты глицил-гистидил-лизина (GHL) и его действие на функцию нейтрофилов крови в физиологических условиях как при внутрибрюшинном, так и при внутрикожном способах введения. Выявлено однонаправленное стимулирующее действие пептида GHL и комбинации составляющих его аминокислот в отношении процессов физиологической регенерации кожи при
внутрибрюшинном введении. Установлено стимулирующее; действие лизинана: : процессы физиологической'регенерацию кожи как при внутрибрюшинном; так:; и при внутрикожном; способах; введения. Показано, что в физиологических условияхэффектыглицинаи.гистидиназависят от способашведения^
Выявлены/однонаправленные репаративные эффекты; глицил-гистидил-лизинашкомбинацишсоставляющих его;аминокислотзасчетлизина-, Показано стимулирующее^ влияние: комбинации* аминокислот глицина;, гистидина и: лизина? на;нейтрофильное звено иммунитета;как в физиологических условиях (за; счетг лизина);, так шпосле моделирования кожных ран? (за; счет лизина и;
глицина):- '.'.'"''.''',''.;... .-'
Установлена однонаправленность эффектов; .лизина вд отношении-
регенерации кожи и функции; нейтрофилов' в. физиологических условиях и приг,
моделировании . раневого процесса. Выяснено; что? проявление' . эффектов
глицина зависит от: выраженности і компенсаторно-приспособительных реакций
испособавведения. ':":'''.'..' . ,
Практическая! значимость. Экспериментально показана
перспективность, применения пептида- глицил-гистидилтлизина, комбинаций-составляющих его; аминокислот глицина; гистидинаі и лизина и аминокислоты; лизина-для; стимуляции заживления-кожных ран.
Выявлена» более выраженная: ранозаживляющая активность - этих субстанций? при; внутрикожном введении; пог.сравненикк с внутрибрюшинным способом введения, темі; самым показана» целесообразность, учета, способа введения при ихшрименении.
Выявленные- эффекты аминокислот, могут быть учтены, при
экспериментальном или клиническом применению других пептидов;
содержащих эти аминокислоты.
Полученные данные могут быть использованы, при; структурно-функциональном, анализе пептидных молекул: ш целенаправленном синтезе препаратов сзаданнымисвойствами. '
8 Результаты работы используются- в практической деятельности Центра иммунотерапии и клеточной трансплантологии при Курской областной клинической больнице, Курской биофабрики, фирмы «БРЮК», а также в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр нормальной и патологической физиологии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Курского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В физиологических условиях пептид глицил-гистидил-лизин (GHL)
ускоряет процессы клеточной пролиферации в коже и повышает резервные
возможности кислородзависимых механизмов нейтрофилов крови, ослабляя
активность этих процессов при повышении дозы.
Комбинация составляющих пептид GHL аминокислот при внутрибрюшинном и внутрикожном введениях усиливает функцию нейтрофилов за счет эффекта лизина. Усиление регенераторного эффекта комбинации, аминокислот при внутрибрюшинном введении обусловлено действием глицина и лизина.
Пептид GHL стимулирует заживление кожных ран при внутрибрюшинном и внутрикожном способе его введения. При повышении дозы наблюдается ослабление репаративного эффекта пептида и функции нейтрофилов крови.
Комбинация аминокислот глицина, гистидина и лизина стимулирует репаративную регенерацию кожи за счет эффекта лизина и функцию нейтрофилов крови за счет действия лизина и глицина при внутрибрюшинном и внутрикожном способах введения.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), 71-й
9 международной итоговой научно-практической конференции (Красноярск, 2007), 2-й Международной Пироговской студенческой научной-медицинской конференции (Москва, 2007), региональном симпозиуме «Магнитные поля и здоровье человека» (Курск, 2007), итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2007, 2008, 2009 г.), межкафедральном заседании кафедр нормальной физиологии, патологической физиологии, биологической химии, гистологии, микробиологии, иммунологии и вирусологии, анатомии человека.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных трудов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 10 рисунками и включает в себя следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования (4 главы), заключение, выводы, практические рекомендации. Указатель литературы включает 132 отечественных и 97 зарубежных литературных источников.
Пептидэргическая регуляция функций организма
Одним из главных звеньев, объединяющих ключевые регуляторные системы (нервную, эндокринную и иммунную), служат регуляторные пептиды. (4, 5, 6, 93). Это небольшие молекулы, состоящие из аминокислотных остатков (обычно от двух до 50), которые вырабатываются в большинстве органов. В одних случаях они выделяются из синаптического окончания и действуют на одну постсинаптическую клетку, выполняя функцию медиатора; в других -оказывают влияние на небольшое число окружающих клеток, в третьих - с током крови достигают отдаленных участков организма и работают как гормоны, т.е. осуществляют аутокринную, паракринную и эндокринную сигнальную передачу информации (33, 95, 116). Один и тот же пептид может выступать во всех трех ролях.
Область биологической активности пептидов чрезвычайно широка. Они оказывают влияние на состояние сердечно-сосудистой, иммунной, половой, эндокринной, пищеварительной и других систем, изменяют энергетический обмен в организме, но особенно эффективны в регуляции работы центральной нервной системы (63, 95).
Особенностью регуляторных пептидов является полифункциональность (один и тот же пептид может модулировать работу многих систем организма). Кроме того, их фрагменты, возникающие при распаде в организме, могут обладать собственной физиологической активностью (62, 101).
Одни и те же пептидные гормоны и биогенные амины обнаружены в нервных, иммунных и эндокринных клетках (205). Эти клетки (APUD) присутствуют в висцеральных органах, где продуцируют многочисленные пептиды и биогенные амины, идентичные таковым в центральной нервной, эндокринной и иммунной системах, а также экспрессируют рецепторы к ним. (90, 129, 205). Анатомическое представительство APUD-клеток в каждом висцеральном органе и общность их химических механизмов позволяет объединить их в диффузную нейроэндокринную систему - ДНЭС (116). Нейроэндокринная система тесно взаимосвязана с иммунной системой (68, 93, 140, 148). Обнаружено, что нейропептиды обладают иммуномодулирующими свойствами (95, 128, 183). На иммунокомпетентных клетках, в свою очередь, обнаружены рецепторы ко многим известным нейропептидам (118, 179). Также установлена продукция ряда гормонов и опиоидных пептидов иммунекомпетентными клетками, что доказывает наличие обратной связи в этом взаимодействии, то есть возможность действия медиаторов иммунитета и на нервные клетки (39, 175, 178). Показано, что такие медиаторы иммунной системы, как интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерферон, тимозин, фактор некроза опухоли (ФНО), обладают способностью регулировать функции центральной нервной системы (2, 39, 100, 178). Иммунокомпетентные клетки могут синтезировать и отвечать на большинство нейропептидов, а клетки нейроэндокринной системы продуцируют некоторые лимфокины и моноцитокины и отвечают на них (2, 139, 181, 193). В настоящее время выделяют следующие основные группы регуляторных пептидов, имеющих в качестве общих характеристик высокую биологическую активность в сверхмалых дозах - 1x10"15 и даже 1x10"18 грамма (63, 116). 1) Пептидные гормоны диффузной нейроэндокринной системы. При этом нейропептиды классифицируют по месту синтеза с учетом общности их структурных и функциональных свойств (13): а) нейропептиды, продуцируемые нейронами преоптической области (соматостатин, тахикинины, нейротензин, натрийуретический фактор предсердия); б) нейропептиды, продуцируемые нейронами аркуатной области (панкреатический полипептид, нейропептид Y, нейропептид YY); в) нейропептиды, продуцируемые в перикарионах паравентрикулярных или супраоптических ядер (тиролиберин, кортиколиберин, холецистокинин, вазопрессин, окситоцин, ангиотензин, брадикинин, бомбезин); г) гастроинтестинальные пептиды (ВИЛ, гастроингибиторный пептид); д) семейство опиоидных пептидов (13). 2) Цитокины - низкомолекулярные белковые регуляторные вещества, продуцируемые клетками и способные модулировать их функциональную активность (94, 120). Цитокины, в основном, вырабатываются в активированных клетках иммунной системы и лишь частично продуцируются другими клетками (фибробластами, эндотелиоцитами и др. (49, 100). При физиологическом состоянии спектр их узок, но при стрессе, воспалении, повреждении, опухолеобразовании и т.п. расширяется количественный и качественный состав цитокинов, обладающих как местной, так и дистантной (гормональной) активностью (94, 126). Цитокины продуцируются различными клетками: эндотелиоцитами, кератиноцитами, фибробластами, макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами, тромбоцитами, стромальными и другими клетками (44). Действие их реализуется по сетевому принципу, то есть передаваемая клеткой информация содержится не в индивидуальном пептиде, а в наборе регуляторных цитокинов. При этом цитокины действуют либо как синергисты, либо как антагонисты, каскадно индуцируя выработку друг друга, и трансмодулируют поверхностные рецепторы к другим медиаторам (49). Одни и те же цитокины могут выполнять различные функции. Этот феномен объясняется плейотропностью и полифункциональностью действия цитокинов.
Влияние глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на физиологическую регенерацию кожных покровов и иммунную функцию при внутрибрюшинном введении
Пептиды, являющиеся компонентами основных регуляторных систем организма, принимают непосредственное участие в физиологическом обновлении клеток органов и тканей (5, 101). В связи с этим, первоначально были изучены системные эффекты пептида GHL на физиологическую регенерацию кожи и нейтрофильное звено антиинфекционного иммунитета при внутрибрюшинном введении.
GHL в наименьшей использованной дозе - ОД 5 мкг/кг не влиял на соотношение фибробластов и лимфоцитов в сосочковом слое кожи, тогда как применение пептида в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг обладало стимулирующим действием в отношении относительного количества фибробластов и супрессирующим эффектом в отношении числа лимфоцитов (таблица 1, рис. 1). В этих группах пептид повышал число фибробластов соответственно в 1,5 и 1,4 раза, снижая при этом количество лимфоцитов в 3,5 и 2,7 раза по сравнению с группой животных, получавших физиологический раствор. Кроме того, при использовании дозы 0,5 мкг/кг наблюдалось снижение числа макрофагов и нейтрофилов соответственно в 1,7 и 3,4 раза по сравнению с контролем, тогда как в дозе 1,5 мкг/кг этого эффекта не было выявлено. Это свидетельствовало о более выраженной активности пептида GHL в дозе 0,5 мкг/кг на процессы физиологической регенерации кожи.
Повышение дозы пептида до 5 и 15 мкг/кг приводило к ослаблению стимулирующего эффекта в отношении числа фибробластов и наблюдалось менее выраженное снижение числа лимфоцитов по сравнению с дозами 0,5 и 1,5 мкг/кг. Также изменений числа плазматических клеток, макрофагов и нейтрофилов 5 и 15 мкг/кг выявлено не было.
Примечание: -показывает достоверные отличия, р 0,05, а рядом стоящая цифра - номера групп сравнения, п - количество животных в группе. В связи с этим было изучено влияние пептида GHL на функцию нейтрофилов крови в физиологических условиях. Было установлено, что пептид во всех изученных дозах не оказывал существенного влияния на ФИ, ФЧ и ИАФ (таблица 2). При этом в дозах 1,5 и 5 мкг/кг пептид не влиял на уровень спонтанной реакции НСТ-теста, но в 1,5 и 1,4 раза повышал показатели индуцированной реакции, что приводило к повышению ФРН в этих группах в 1,7 и 1,6 раза по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. В группах крыс, получавших GHL в дозах 0,15, 0,5 и 15 мкг/кг уровень НСТ-теста не отличался от показателей контрольной группы.
Таким образом, повышение дозы пептида GHL до 15 мкг/кг приводило к исчезновению стимулирующего влияния в отношении резервных возможностей кислородзависимых механизмов, что наблюдалось в дозах 1,5 и 5 мкг/кг. Выявленные факты согласуются с данными литературы, когда дальнейшее повышение дозы пептида до 150 и 450 мкг/кг приводило к супрессирующему эффекту пептида GHL как в отношении фагоцитарной, так и кислородзависимой активностей нейтрофилов крови (101).
Скорее всего, повышение резервных возможностей кислородзависимых механизмов нейтрофилов в малых дозах связано с транспортируемыми GHL ионами металлов (меди, железа и др.), очевидно, активирующих в малых дозах металл-зависимые ферменты клеток и усиливающих кислородзависимые механизмы нейтрофилов. В больших же дозах металлы обладают определенной токсичностью, с чем может быть связан супрессирующий эффект больших доз GHL.
В связи с тем, что основным механизмом инактивации пептидов является протеолиз (92), в дальнейшем важно было выяснить, способны ли отдельные аминокислоты, составляющие GHL, оказывать существенное влияние на физиологическую регенерацию кожи и иммунную функцию. Для того чтобы смоделировать физиологически адекватную ситуацию, было целесообразно
Примечание: 1. НСТ-сп - % диформазан-положительных клеток в спонтанной реакции НСТ-теста, 2. НСТ-инд.- % диформазан-положительных клеток в стимулированной зимозаном реакции НСТ-теста, 3. -показывает достоверные отличия, р 0,05, а рядом стоящая цифра - номера групп сравнения, п - количество животных в группе. использовать такие дозы аминокислот, которые бы соответствовали их эквимолярному содержанию в пептиде. В то же время, в ранее проведенных исследованиях было показано, что повышение дозы GHL до 15 мкг/кг приводило к ослаблению его эффектов. Поэтому, в дальнейших исследованиях была использована минимальная доза пептида, еще обладающая регенераторной активностью, — 0,5 мкг/кг массы.
Было установлено, что введение пептида GHL в этой дозе повышало относительное количество фибробластов в сосочковом слое кожи в 1,4 раза по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор (таблица 3). Комбинация аминокислот глицина, гистидина и лизина и аминокислота глицин также повышали количество этих клеток — в, 1,3 раза по сравнению с контролем. Тогда как выраженного влияния гистидина и лизина на число фибробластов не было выявлено.
При этом количество лимфоцитов в сосочковом слое кожи под влиянием пептида резко снижалось - в 3,2 раза по сравнению с контролем. При введении комбинации аминокислот глицина, гистидина и лизина и аминокислот глицина и лизина по отдельности число лимфоцитов также снижалось — в 1,8, 2,1 и 1,4 раза соответственно. Влияния гистидина на число лимфоцитов в сосочковом слое кожи не было выявлено. Количество плазматических клеток в, сосочковом слое кожи под влиянием препаратов существенно не изменялось, за исключением комбинации аминокислот, которая снижала их число в 1,8 раза, по сравнению с контролем. Число макрофагов под влиянием пептида и комбинации аминокислот снижалось в 1,6 и 2,0 раза по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. При этом аминокислоты, введенные по отдельности, не влияли на количество этих клеток. Число нейтрофилов в клеточном инфильтрате снижалось только в группе (животных, получавших пептид GHL, - в 3,9 раза по сравнению с контролем.
Регенераторная активность глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот и их влияние на функцию нейтрофилов при внутрикожном введении в физиологических условиях
После изучения эффектов GHL и входящих в его состав аминокислот при внутрибрюшинном введении в физиологических условиях было целесообразно выявить их регенераторное и иммунотропное действия и при местном введении. Для сравнения системных (внутрибрюшинном) и местных (внутрикожных) эффектов пептида он также вводился в дозе 0,5 мкг/кг, а аминокислоты — в дозах, соответствующих их эквимолярному содержанию в GHL.
Введение комбинации аминокислот глицина, гистидина и лизина и аминокислоты глицина не влияло на этот показатель. В то же время, изолированное введение гистидина и лизина также изменяло относительное количество фибробластов в популяции клеток РВСТ в 1,3 раза, соответственно повышая и снижая их относительное количество.
Количество лимфоцитов снижалось под влиянием пептида в 2,9 раза по сравнению с контролем. Введение комбинации аминокислот глицина, гистидина- и лизина и аминокислоты глицина не оказывало влияния на относительное число лимфоцитов. При введении гистидина количество этих клеток повышалось в 1,3 раза, тогда как лизин наоборот снижал их число в 2,6 раза по сравнению с контролем.
Примечание: " -показывает достоверные отличия, р 0,05, а рядом стоящая цифра - номера групп сравнения, п - количество животных в группе. сосочковом слое кожи.
При подсчете плазматических клеток было установлено, что комбинация1 аминокислот повышала их число в 2,2 раза по сравнению с контролем, вероятно, за счет эффекта гистидина, который, введенный отдельно, также повышал количество плазматических клеток в 3,6 раза по сравнению, с животными; получавшими физиологический раствор. В других группах достоверных отличий не было выявлено. Также количество макрофагов и нейтрофилов во всех опытных группах существенно не отличалось от уровня контроля, но у животных, получавших лизин, число макрофагов и нейтрофилов было достоверно ниже в 1,7 и 2,0 раза соответственно по сравнению с животными, которым вводили гистидин. Полученные данные показывают, что лизин и- гистидин могли оказывать разнонаправленное действие на число макрофагов и нейтрофилов в этих .условиях.
Таким образом, в отличие от внутрибрюшинного введения; при местном (внутрикожном) введении не было выявлено влияния глицина на процессы физиологической регенерации. Возможно, это связано с тем, что при местном способе введения глицина в меньшей степени проявляется- его1 нейротропная активность. В то же время, в этих условиях наблюдалось ослабление пролиферативной активности под влиянием гистидина, тогда как при внутрибрюшинном введении этого эффекта выявлено не было. Возможно, что при местном-введении, образующийся из гистидина гистамин,усиливает приток иммунокомпетентных клеток в области введения, что и приводит к изменению соотношения фибробластов и лимфоцитов в сосочковом-слое кожи.
При исследовании нейтрофильного звена антиинфекционного иммунитета- было установлено, что при местном введении пептида GHL в дозе 0,5 мкг/кг, также как и при внутрибрюшинном введении, не влиял на функцию нейтрофилов крови (таблица 6). Введение же комбинации аминокислот глицина, гистидина и лизина стимулировалокак
При. введении аминокислот по- отдельности было- выявлено, ЧТО в физиологических условиях при- местном введении глицин не оказывал существенного влияния гнаг функцию нейтрофилов. Ристидин также не влиял на показатели фагоцитарной и кислородзависимой активностич нейтрофилов, за исключением спонтанной реакции »НСТ-теста, которую-он усиливал в 1,4 раза по сравнению с контролем. Тогда как лизин» повышал как ФИ и ИАФ в 1,4 раза, а также уровень спонтаннойреакции HGT-теста в 1,3 раза.
Скорее всего, стимулирующее действие комбинации аминокислот глицина, гистидина п лизина на функцию нейтрофилов при. местном (внутрикожном) введении, так же как и при- внутрибрюшинном введении, было связано» преимущественно с лизином. 0№ усиливал как их фагоцитарную активность, так и кислородзависимую? активность в отличие от внутрибрюшинного эффекта, когда наблюдалось стимулирующее действие лизина только в, отношении фагоцитарной, активности. Введение гистидина полностью не воспроизводило эффекты комбинации аминокислот на функцию нейтрофилов, а совпадало только» в отношении их спонтанной кислородзависимой активности, что могло быть связано с образующимся из него гистамином.
Таким образом, в физиологических условиях пептид глицил-гистидил-лизин в дозе 0,5 мкг/кг при местном (внутрикожном) введении, так же, как и при внутрибрюшинном введении, ускорял процессы пролиферации в коже, не влияя при этом на функцию нейтрофилов крови. В то же время комбинация аминокислот глицина, гистидина и лизина в эквимолярных дозах, не оказывая существенного влияния- на пролиферативные процессы в коже, усиливала функцию нейтрофилов крови. При этом наблюдаемые эффекты комбинации аминокислот могли быть связаны с гистидином и лизином и их разнонаправленным влиянием на пролиферацию. Изученные регенераторные эффекты лизина при местном введении были сопоставимы с действием глицил-гистидил-лизина, в отличие от их эффектов при внутрибрюшинном введении.
Эффекты глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот в условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении
Регуляторные пептиды и физиологически активные аминокислоты непосредственно участвуют в поддержании гомеостаза организма (5). При этом их эффекты могут зависеть от активности иммунной системы и компенсаторно-приспособительных реакций (37). В связи с этим, после выявления эффектов GHL и составляющих его аминокислот в физиологических условиях было целесообразно изучить их действие и при ранениях кожи, когда включаются процессы репаративной регенерации кожных покровов (98).
Первоначально были изучены системные эффекты препаратов при их внутрибрюшинном введении. В условиях выбранной модели раневого процесса GHL в наименьшей использованной дозе - 0,15 мкг/кг не влиял на заживление кожных ран, тогда как применение пептида в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг обладало стимулирующим действием (таблица 1, рис. 1). Причем наибольшую ранозаживляющую активность пептид проявлял в дозе 0,5 мкг/кг, о чем свидетельствовало уменьшение конечной площади раны в 3,5 раза и повышение коэффициента относительного заживления в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой животных, получавших физиологический раствор.
Репаративное действие GHL подтверждалось морфологическими исследованиями раневых срезов. По сравнению с контрольной группой животных (рис. 5), у крыс, получавших пептид в дозе 0,5 мкг/кг (рис. 6), отмечается не только выраженное снижение плотности клеточного инфильтрата, но и иное соотношение относительного количества клеток в соединительной ткани за счет снижения представительства лимфоцитов и макрофагов, а также преобладание зрелых форм фибробластов над незрелыми. Это, по нашему мнению, свидетельствует о более благоприятном и быстром течении процессов регенерациив этой серии эксперимента.
Количествоіфибробластов.приївведениишептидаів дозе 0;15 мкг/кг было на уровне контроля: Наибольшее количество; фибробластов в популяции» клеток, грануляционной ткани-отмечалось при введении5пептида в дозе 01,5 мкг/кг (в 1,4 раза выше, чем в контрольной группе). Установлено, что относительное количество; фибробластов понижалось пропорционально повышению дозы пептида: Так, прш введении GHE в дозе 1,5 мкг/кг количество1 фибробластов было «выше Bil:,3 -раза; чем; в контроле,.відозе 5: мкг/кг -количество этих клеток; оставалось , на; уровне, контроля, а дозе 15: мкг/кг - понижалось в 1,4 раза по; сравнению с крнтрольной5группой1(таблицаі;8).
Относительное количество лимфоцитов- было- достоверно ниже; контрольной группы только пришрименении» пептида вщозе 0 5: мкг/кг — в 1,8; раз. В остальных-, группах количество лимфоцитов, оставалось на уровне контроля:
Нривведениишептида ввозах 0Ц5и;іГ,5мкг/кг:относительноеколичество;ї плазматических клеток былона уровне контроля. При применении !GHb в дозах 0 5, 5 и; 15 мкг/кг, чйсло этих клеток; былошыше; чем,в,контрольной группе:в 1,5, 1,7 и-3 раза соответственно.
Количество макрофагов оказалось достоверно вышеконтроля в группах с введением;пептида в,дозах 5; и 15 мкг/кг — в 1,7 и 2,6раз соответственно. В: остальных группах.числошакрофагов оставалось на іуровне контроля; г
ГІриї; введении; пептида в дозе 0-5 мкг/кг количество нейтрофилов было достоверно ниже, чем в контроле в 3,3 раза; а-в группе с введением пептида в дозе 1-5 мкг/кг - достоверно выше контроля- в 3;2: раза: В остальных группах количество/нейтрофилов оставалось на уровне контроля/(таблица 8)..
GHL в дозах 0,15 и 0,5 мкг/кг не оказывал существенного влияния на функцию нейтрофилов крови (таблица 9, рис. 6). Введение пептида в дозе 1,5 мкг/кг приводило к повышению ФИ и ЗФ, но при этом снижалась стимулированная реакция НСТ-теста и соответственно ФРН. Повышение ФИ могло быть связано с активацией компенсаторных механизмов в ответ на снижение активности кислородзависимых механизмов защиты. При более высоких концентрациях пептида (5 и 15 мкг/кг) также наблюдалось снижение ФРН, но при этом не было выявлено стимулирующего действие GHL на показатели их фагоцитарной активности, что свидетельствовало о супрессирующем влиянии» пептида в этих дозах на функцию нейтрофилов крови.
Таким образом, GHL обладал преимущественно иммуносупрессорным действием на функцию нейтрофилов, что могло ослабить восстановление поврежденной ткани, так как известно, что в условиях сниженной иммунной функции активность репаративных процессов также, как правило, снижается (86).
При использованной схеме введения пептид в условиях раневого процесса оказывал влияние на стадию активной» нейтрофилыюй инфильтрации. Таюке было целесообразно выявить эффекты пептида и в отношении уже сформированных кожных ран. С этой целью были изучены репаративные и иммунотропные эффекты GHL в дозах 1,5 и 15 мкг/кг, при введении пептида через 3 дня после моделирования раневого процесса.
Установлено, что в этих условиях GHL стимулировал заживление кожных ран при его использовании в малой дозе - 1,5 мкг/кг, о чем-свидетельствовало повышение уровня относительного заживления в 1,6 раза (таблица 10).
В дозе 15 мкг/кг достоверного повышения этого показателя не было выявлено. Причем, в этих условиях пептид в обеих дозах не оказывал существенного- влияния на показатели функциональной активности нейтрофилов, в том числе и в отношении ФРН, сниженного в результате раневого процесса.
Учитывая тот факт, что ШУ большинству показателей выраженной иммуностимулирующей активности1 GHL в условиях кожных ран не выявлено, можно предположить, что его репаративные эффекты реализуются не через иммунную систему, а скорее всего, связаны с непосредственным действием пептида на клетки кожи и проявляются преимущественно в малых дозах (0,5 и 1,5 мкг/кг).
