Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор данных литературы 12
1.1. Пептиды как регуляторы функций организма 12
1.1.1. Основные группы регуляторных пептидов 12
1.1.2. Влияние олигопептидов АКТГ, опиоидных пептидов и фактора роста клеток печени (GHL) на функции организма 15
1.1.2.1. Нейротропные и иммунотропные эффекты олигопептидов АКТГ . 15
1.1.2.2. Физиологическая роль опиоидных пептидов 21
1.1.2.3. Эффекты фактора роста клеток печени (GHL) 30
1.2. Физиологические особенности печени, их оценка 34
1.2.1. Морфофункциональные особенности печени и ее регенерации 34
1.2.2. Регуляторные механизмы регенерации печени 38
1.2.3. Влияние печени на иммунологическую реактивность 43
1.2.4. Механизмы повреждения печени и иммунологическая реактивность в условиях токсических гепатопатий 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 54
Глава 3. Влияние GHL на состояние печени и иммунологическую реактивность в физиологических условиях 65
Глава 4. Эффекты аналога энкефалина (DSLET) на функциональное состояние печени, регенерацию и иммунный ответ в физиологических условиях 86
Глава 5. Влияние АКТГ4-10 на физиологическую регенерацию, функцио нальные показатели печени и на иммунный ответ 100
Глава 6. Эффекты GHL, DSLET и AKTTVio на состояние печени и иммунную систему в условиях острого отравления тетрахлорметаном 114
Глава 7. Влияние GHL, DSLET и АКТГ4.ю на функциональные показатели печени и иммунной системы в условиях острой гепатопатий, вызванной гидразином 139
Глава 8. Эффекты GHL, DSLET и АКТГ4.ю в условиях хронического токсического поражения печени 161
Глава 9. Влияние комбинаций регуляторных пептидов на состояние печени и иммунную реактивность при токсических гепатопатиях 172
Глава 10. Заключение 200
Выводы 233
Практические рекомендации 236
Список литературы 237
- Нейротропные и иммунотропные эффекты олигопептидов АКТГ
- Морфофункциональные особенности печени и ее регенерации
- Влияние АКТГ4-10 на физиологическую регенерацию, функцио нальные показатели печени и на иммунный ответ
- Влияние GHL, DSLET и АКТГ4.ю на функциональные показатели печени и иммунной системы в условиях острой гепатопатий, вызванной гидразином
Введение к работе
Изучение физиологической роли регуляторных пептидов является одним из приоритетных направлений современной науки. Установлено, что ре-гуляторные пептиды, играют ключевую роль в поддержании гомеостаза и являются важнейшими компонентами в функционировании основных регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной (6, 8, 10, 233). Не менее существенная роль принадлежит им и в осуществлении взаимодействия этих систем (7, 9, 10, 118, 246, 271). При нарушении гомеостатического баланса именно регуляторные пептиды определяют основные параметры формирования компенсаторно-приспособительных реакций организма (89, 121,233).
Перспективным достижением молекулярной биологии и медицины стала возможность искусственного синтеза необходимых биорегуляторов, что делает вполне реальной проблему создания новых высокоэффективных лекарств пептидной природы (44, 46, 55, 226, 233, 234). Уже сегодня некоторые пептиды используются в клинической практике. Это такие препараты как миелопид, семакс, тимоген, даларгин и другие (13, 45, 51, 122, 142, 158, 173). Поэтому исследование механизмов действия регуляторных пептидов имеет не только теоретический интерес в плане выяснения процессов регуляции жизнедеятельности, но и важное практическое значение.
Изменения гомеостаза существенным образом отражаются на интенсивности процессов регенерации, которая лежит в основе физиологии каждого органа, а также компенсации нарушений их функций при патологии (176, 200). Стимуляция регенерации способствует развитию восстановительных процессов, а выявление факторов, усиливающих регенераторную способность органов - одна из важнейших задач, стоящих перед медициной (52, 83, 95,176,187,219,226).
Органом, непосредственно участвующим в поддержании гомеостаза
организма, является печень, а ее патология занимает существенное место среди причин нетрудоспособности и смертности во всем мире. Ежегодно острым вирусным гепатитом заболевает не менее миллиона жителей земного шара. Химизация производства, быта и медицины, алкоголизм, наркомания, увеличение хирургических вмешательств и переливаний крови способствуют росту заболеваний печени (176, 178, 239). Поражения печени часто приводят к развитию цирроза, который обычно заканчивается печеночной недостаточностью или трансформируется в карциному, летальный исход которой, как правило, неизбежен (406).
В связи с этим выявление оптимальных условий усиления регенераторных потенций патологически измененной печени является чрезвычайно актуальным. В то же время, механизмы и системы регуляции, обеспечивающие восстановление печени, остаются мало изученными и требуют более детальных исследований.
Хорошо известно регуляторное влияние иммунной системы на регенерацию печени (1, 16, 37, 115, 123, 176, 228, 360). В свою очередь, поражения печени как токсической, так и инфекционной этиологии характеризуются значительным нарушением иммунологической реактивности организма (11, 52, 81, 324, 350, 352). В настоящее время влияние регуляторных пептидов на пролиферацию гепатоцитов, иммуномодулирующие эффекты и их взаимосвязь остаются до конца не выясненными. Не известна роль печени во взаимодействии регуляторных систем организма в норме и патологии. Остаются неизученными механизмы и вопросы эффективности воздействия регуляторных пептидов при различных формах патологии печени, связанных с изменением иммунореактивности организма в ту или иную сторону. Такое положение затрудняет развитие указанного направления иммунокоррекции и восстановления пораженного органа и делает актуальной проблему исследования иммуномодулирующего и гепатотропного влияния регуляторных пептидов как в норме, так и при патологии печени.
Спектр регуляторних пептидов чрезвычайно широк. Учитывая тот факт, что в обеспечении восстановительных процессов в печени и других органах принимают участие различные системы регуляции, особый интерес представляло изучение и анализ эффектов пептидов различных функциональных групп. Хорошо известны пептидные иммуномодуляторы с выраженным гепатотропным эффектом (83, 95, 122, 219), скорее всего обладающие таким действием за счет активации иммунной системы. В то же время, мало изучено регуляторное влияние нейроэндокринной системы в обеспечении восстановления печени, а роль нейропептидов в этом процессе практически не известна.
Адаптация к изменяющимся условиям среды контролируется гипота-ламо-гипофизарно-надпочечниковой системой, одним из основных компонентов которой является АКТГ (121, 189). Нейротропные эффекты этого гормона обусловлены N- концевым фрагментом его молекулы - АКТГ 4-ю » который практически лишен стероидогенной активности (13, 27). Соответственно, можно полагать, что эффекты этого пептида не связаны с секрецией глюкокортикостероидов, а являются преимущественно нейротропными или, возможно, прямыми. Перспективность изучения гепатотропных эффектов АКТГ 4-ю диктуется еще тем, что недавно установлена выраженная регенераторная активность N-концевых фрагментов АКТГ в отношении ряда тканей (49, 80,168,170,431).
С другой стороны, выраженность адаптивной реакции зависит от активности стресс-лимитирующей системы, компонентами которой являются опиоидные пептиды, рецепторы которых обнаружены, в том числе, и на мембране гепатоцитов (31, 141, 174, 189). Известно, что энкефалины влияют на функциональную активность печени (69, 126). Но при этом они, особенно в больших дозах, не являются строго специфичными лигандами только для одного типа опиатных рецепторов, хотя и испытывают наибольшее сродство к 5-рецепторам (58). В связи с этим, особый интерес представляло изучение
гепатотропных эффектов селективного агониста 8-опиатных рецепторов, синтетического аналога энкефалинов - пептида DSLET ([D-Ser 2, D-leu5] эн-кефалин - Thr 6).
Также известен трипептид Gly-His-Lys (GHL), стимулирующий ростовые процессы и повышающий выживаемость гепатоцитов in vitro (332, 380, 414), что свидетельствует о его прямом гепатотропном эффекте.
Все изложенные факты обусловили выбор пептидов, а изучение их гепатотропного влияния и сопряженного с этим изменения функции иммунной системы стало целью проведенного исследования.
Цель исследования — выявление гепатотропных и иммунотропных эффектов пептидов GHL, DSLET и АКТГ 4-ю в физиологических условиях, при острых и хронической токсических гепатопатиях и разработка способов коррекции нарушений функции печени и иммунной системы.
Задачи исследования:
Изучить влияние пептидов GHL, DSLET и АКТГ4-10 на физиологическую регенерацию гепатоцитов.
Установить эффекты GHL, DSLET и АКТГ4-ю на развитие гуморального иммунного ответа, гиперчувствительности замедленного типа и нейтрофильное звено антиинфекционной защиты.
Выяснить роль спленоцитов в реализации гепато- и иммунотропно-го эффектов этих пептидов.
4. Выявить влияние регуляторных пептидов на репаративную
регенерацию, функциональное состояние гепатоцитов и иммунную
реактивность в условиях острой тетрахлорметановой гепатопатии.
Установить влияние регуляторных пептидов на репаративную регенерацию, функциональное состояние гепатоцитов и иммунологическую реактивность в условиях острой гидразиновой гепатопатии.
Изучить влияние регуляторных пептидов на репаративную регенерацию, функциональное состояние гепатоцитов и иммунную реактивность в
условиях хронической тетрахлорметановой гепатопатии.
7. Выявить влияние комбинаций регуляторных пептидов на репара-тивную регенерацию, функциональное состояние гепатоцитов и иммунную реактивность животных в условиях острых и хронической токсических гепатопатии и провести сравнительную оценку их эффективности.
Научная новизна. Установлены выраженные гепатотропные и иммунные эффекты различных доз GHL, DSLET и АКТГ 4-ю в физиологических условиях и выяснена роль спленоцитов в их реализации.
Выявлено влияние пептидов на репаративную регенерацию, функциональное состояние гепатоцитов и иммунную реактивность при токсической гепатопатии. Показано, что в этих условиях эффекты DSLET и АКТГ 4-ю зависят от исходного состояния иммунной функции.
Установлена эффективность пептидов как гепатопротекторов и имму-нокорректоров. Показано, что направленность гепатотропного и иммуносу-прессирующего влияния GHL не зависит от природы токсиканта и тяжести поражения печени, тогда как DSLET и АКТГ 4-ю проявляют модуляторные по характеру эффекты.
Обоснована возможность усиления репаративной регенерации гепатоцитов и коррекции иммунной реактивности регуляторными пептидами в условиях экспериментальных токсических гепатопатии, различающихся по механизму и форме поражения печени. Показана возможность взаимопотен-цирующего действия GHL и DSLET.
Полученные данные расширяют представления о взаимодействии нейроэндокринной и иммунной систем организма, а также о механизмах сохранения гомеостаза в условиях патологии печени.
Практическая значимость. Экспериментально показана перспективность применения пептидов GHL, DSLET и АКТГ 4-ю в качестве гепатопротекторов в условиях токсических поражений печени.
Выявлена возможность иммунокоррекции при токсической гепатопа-
тии, вызванной введением различных по химической природе токсикантов путем применения исследованных регуляторных пептидов и их комбинаций.
Установлены дозы и схема введения пептидов, вызывающие устойчивые гепатотропные и иммунные эффекты. Выявленные экспериментальным путем физиологические эффекты пептидов можно рассматривать как фрагмент доклинического испытания препаратов, а полученные данные позволяют обосновать рекомендации по их применению. Гепато- и иммуно-тропные эффекты пептидов могут быть учтены при экспериментальном или клиническом применении других пептидных аналогов.
Обоснована целесообразность учета механизма развития гепатопатии и исходной активности иммунной функции при выборе пептида или их комбинаций. Показана перспективность комбинированного введения пептидов, дополняющих и модулирующих эффекты друг друга.
Полученные данные могут быть учтены при структурно-функциональном анализе пептидных молекул и целенаправленном синтезе препаратов с заданными свойствами.
Результаты работы используются в практической деятельности Курской биофабрики, фирмы «БИОК», Центра иммунотерапии и клеточной трансплантации при Курской областной клинической больнице, лаборатории цитотоксических сывороток Национального института физиологии им. акад. А.А. Богомольца Национальной академии наук Украины (г. Киев) и в лекционных курсах и на практических занятиях ряда кафедр Санкт-Петербургского, Воронежского, Курского, Белгородского медицинских университетов и академий.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В физиологических условиях трипептид GHL стимулирует регенерацию гепатоцитов, проявляя большую активность в отношении завершенных митозов, но с повышением дозы и длительности введения пептид ухудшает микроструктуру печени и снижает иммунную функцию организма.
Селективный лиганд 8-опиатных рецепторов (DSLET) и АКТГ4. ю активируют физиологическую регенерацию гепатоцитов, оказывая большее влияние на ацитокинетические митозы, снижая иммунную реактивность при повышении дозы и длительности их введения.
В условиях токсических поражений печени различного генеза направленность гепатотропной и иммуносупрессирующей активностей GHL не меняется. Пептид стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов, проявляя слабую гепатопротекторную активность только в дозе 1,5 мкг/кг, тогда как увеличение дозы до 150 мкг/кг сопровождается усилением морфологических и биохимических признаков поражения печени.
При токсических гепатопатиях с повышенной (отравление тетра-хлорметаном) или сниженной иммунной функцией (отравление гидразином) DSLET стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов, проявляет гепатопротекторную активность, и корригирует повышенные или сниженные показатели иммунной реактивности.
Репаративные, гепатопротекторные и иммунокорригирующие эффекты АКТГ 4-ю проявляются только в условиях токсических гепатопатий, вызванных тетрахлорметаном, но не гидразином, при отравлении которым пептид ослабляет репаративную регенерацию, не обладает выраженным ге-патопротекторным эффектом и усиливает проявления вторичного иммунодефицита.
В условиях токсических гепатопатий введение GHL в сочетании с АКТГ 4-ю ослабляет репаративные и иммунные эффекты GHL, тогда как сочетанное введение GHL с DSLET сопровождается усилением их однонаправленных эффектов.
Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на конференции молодых ученых России «Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века», посвященной 50-летию РАМН (Москва, 1994), конференции морфологов, иммунологов и клиницистов Черноземья «Морфогенез и
регенерация» (Курск, 1995), 4-й конференции по применению хроматографи-ческих методов в фитохимическом и биомедицинском анализе (Люблин, 1995), на I и II Российских конгрессах по патофизиологии (Москва, 1996, 2000), II конгрессе Европейской федерации по изучению боли «Боль в Европе» (Барселона, 1997), VII, VIII и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2001, 2002), I и II международных конференциях «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001, 2002), Второй Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орёл, 2001), 4-м Конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 2001), итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета (2000, 2001, 2002), межкафедральном заседании кафедр нормальной физиологии, патологической физиологии, биохимии, пропедевтики внутренних болезней Курского государственного медицинского университета (2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 работ, в том числе 21 — в центральной печати, 4 - в международной, издана монография. Получено 2 патента на изобретение. В публикациях содержится полный объем информации, касающийся темы диссертации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста, иллюстрирована 70 таблицами и 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования (1 глава), изложения собственных результатов (7 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 431 источник, в том числе 262 отечественных и 169 иностранных.
Нейротропные и иммунотропные эффекты олигопептидов АКТГ
На действие различных внешних факторов организм отвечает адаптивным процессом, направленным на восстановление гомеостаза и сохранение нормальной жизнедеятельности (121, 138, 331). АКТГ - ключевой участник адаптивных реакций (141,189).
Как известно, молекулы АКТГ человека и животных состоят из 39 аминокислотных остатков и различаются только последовательностью аминокислотных остатков на участке пептидной цепи 25-33. Биологические свойства АКТГ целиком обусловлены структурой N-концевого участка (1-24) пептидной цепи, одинакового у разных видов животных и человека (172). Синтезированный синтетическим путем пептид, состоящий из 24 аминокислотных остатков и соответствующий по структуре N-концевому участку АКТГ, обладает всеми биологическими свойствами гормона, но лишен антигенных свойств. Поэтому С-концевой участок молекулы АКТГ (29-39) обусловливает антигенные свойства гормона. Укорочение АКТГі-24 с карбоксильного конца (на участке пептидной цепи 24-18) приводит к постепенному снижению его активности, которая обнаруживается у пептида, состоящего из 17 аминокислотных остатков (172).
Известно, что АКТГ и глюкокортикоидные гормоны коры надпочечников подавляют развитие воспалительной реакции (56, 195). Кроме непосредственного влияния на надпочечники, АКТГ проявляет меланоцитости-мулирующую и липотропную активность, обусловленную тем, что в молекуле АКТГ существует последовательность аминокислот, соответствующая а-меланоцитстимулирующему гормону (МСГ), который вызывает дифференцировку эпидермальных меланоцитов in vivo и in vitro (325). Минимальным фрагментом молекулы АКТГ, еще обладающим заметной меланоцито-стимулирующей и липотропной активностью, является пентапептид - АКТГ6-к : НгІЧ-Гис-Фен-Арг-Три-Гли-СООН (56). При использовании искусственно синтезированных фрагментов АКТГ, установлено, что АКТГ 4-іг — это минимальный фрагмент необходимый для того, чтобы вызвать дифференцировку эпидермальных меланоцитов в полной мере, так как АКТГ ыо , АКТГ 4-10 , АКТГ 4-и и АКТГ 5-12 обладали слабой активностью в отношении меланоцитов и проявляли ее только в больших дозах. Очевидно аминокислоты Мет (4) и Про (12) необходимы для проявления этой активности (325).
Активной частью молекулы АКТГ, обязательной для проявления его физиологических эффектов, в частности, влияний на поведение, обладающей высокой нейрогенной активностью и практически лишенной стероидогенной, является N-концевая последовательность из остатков семи аминокислот - АКТГ 4-ю: Н2Н-Мет-Глу-Гис-Фен-Арг-Три-Гли-ОН(13, 204). Этот фрагмент молекулы является общим для АКТГ, а- и Р-МСГ и 3-липотропина.
Кроме того, АКТГ 4-ю обнаруживается in vivo, очевидно, образуясь путем протеолиза из своего предшественника - АКТГ (13, 167, 317) и обладает натрийуретическим, прессорным и кардиостимулирующим эффектами, которые, следовательно, являются экстраадреналовыми (317).
N-концевые фрагменты АКТГ обладают выраженной нейротропной активностью (404, 418, 422). Так АКТГ4-9 усиливает вестибулярную компенсацию путем прямого воздействия на вестибулярное ядро (312). AKTTYio оказывает прямое воздействие на пресинаптическую мембрану и стимулирует тем самым освобождение ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе. АКТГыо и АКТГ4.іо участвуют в модуляции мелатонином бензодиазипино-вых рецепторов коры больших полушарий (375).
В последние годы в нашей стране создан оригинальный ноотропный препарат «семакс», являющийся синтетическим аналогом АКТГ4-10 , это — АКТГ4.7 - Pro-Gly-Pro, обладающий более пролонгированным действием по сравнению с прототипом (13, 188, 369). Этот препарат также оказывает ней-ропротекторное действие при ишемическом инсульте, что может быть обусловлено его способностью защищать нейроны от повреждений вызванных окислительным стрессом, в частности от повышенного образования оксида азота (45, 205). «Семакс» и АКТТУш способны подавлять спонтанную активность нейронов медиального вестибулярного ядра (47), чем объясняется их противоукачивающее действие. Кроме того, эти пептиды изменяют спонтанную активность примерно у 60% нейронов коры больших полушарий, что может лежать в основе механизма действия на высшие интегративные функции мозга (47). «Семакс», не обладая непосредственным анальгетическим действием, вызывает ослабление или прекращение боли у больных с головными болями мигренозного характера, что связано с его спазмолитическим и общерегулирующим действием, оптимизирующим нейромедиаторный обмен и ускоряющим адаптационные процессы (88). Недавно выяснилось, что АКТГ 4-ю и «семакс» ( аналог АКТГ 4-7) способны оказывать стимулирующее влияние на регенерацию некоторых тканей (48, 80). Известен стимулирующий пролиферацию эффект АКТГ 4-ю в роговице (168, 431) и благоприятное влияние «семакса» на заживление язв (49, 170, 431). Показано, что биологические эффекты последнего могут быть связаны с его ингиби-рующим действием на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови (98).
Синтетические аналоги N-терминальных фрагментов АКТГ, содержащие L-аргинин, усиливали болевую чувствительность и агрессивно-оборонительное поведение у крыс, что, по всей видимости, связано с модуляторным влиянием окиси азота, образуемой из остатка этой аминокислоты. Механизмы эффектов включают повышение возбудимости структур, ответственных за формирование отрицательных эмоций, усиление активности мускариновой системы мозга и особенности рецепции пептидов мозговыми структурами (25, 26).
На взаимосвязь АКТГ 4-ю (и МСГ) с функциями нервной системы указывает наличие на этой молекуле структурно родственного серотонину связывающего центра (392). Очевидно, что, благодаря наличию серотонин-связывающего центра в молекуле АКТГ 4-ю» обеспечивается важная связь также между нервной и иммунной системами, что подтверждается изменением уровня серотонина при аутоиммунных заболеваниях (392).
Морфофункциональные особенности печени и ее регенерации
Печень представляет собой центральный орган химического гомеостаза организма (177, 178, 250). Более 60% всей массы органа составляют ге-патоциты, которые формируют дольки, обладающие собственной системой крово- и лимфотока, оттока желчи и иннервации. Помимо гепатоцитов печень содержит звездчатые эндотелиоциты, или клетки Купфера, эндотели-альные клетки, липоциты (клетки Ито), выполняющие функции фибробла-стов и ямочные (pit) клетки, относящиеся к APUD системе (223).
Гепатоциты вырабатывают как экзокринные, так и эндокринные продукты. На долю гепатоцита приходится более 500 метаболических функций, необходимых для поддержания гомеостаза организма (177). К основным функциям печени относятся обмен белков, углеводов, липидов, ферментов, витаминов, инактивация гормонов, а также водный и минеральный обмен, секреция желчи, детоксицирующая функция, пигментный обмен (178). Это единственное место синтеза альбуминов, фибриногена, протромбина, про-конвертина, проакцелерина. Вследствие этого система свертывания крови в значительной мере зависит от белковосинтетической функции печени. Основное количество а и (3- глобулинов, в том числе белков острой фазы воспаления (агкислый гликопротеин, а,2-макроглобулин, гаптоглобулин, церу-лоплазмин, гемопексин, и др.), а также ростовых факторов (трансферрин и др.) образуется в паренхиматозных клетках печени (177). В плазмоцитах и ретикулярных клетках печени синтезируются у-глобулины (178, 250). Таким образом, клеточный состав печени многокомпонентен, а сама она представляет собой сложный в функциональном отношении орган. В печени постоянно протекают процессы физиологической регенерации, которые осуществляют замену погибающих в процессе жизнедеятельности клеток новыми жизнеспособными и таким образом обеспечивают функциональную деятельность органа путем клеточной и внутриклеточной форм регенерации (223). Во взрослом состоянии гепатоциты делятся редко, но их способность к делению возрастает под влиянием сильных воздействий, таких как утрата ткани (16). Пролиферация гепатоцитов может осуществляться как в результате завершенного митоза, так и ацитокинетического митоза (без цитотомии), что обусловливает экономичность неполного митотического цикла в сравнении с завершенным митозом (223). Этот процесс ведет к появлению двуядерных гепатоцитов, увеличению их размеров и относительному уменьшению поверхности этих клеток. В двуядерных клетках обнаружена повышенная активность ферментов, в связи с чем, эти клетки отличаются усиленным обменом веществ (203). Поэтому, считается , что , двуядерные гепатоциты , имеющие двукратный набор генетической информации, более функционально активны и экономичны, чем обычные гепатоциты, а их число является одним из показателей регенераторных процессов в органе (101).
На клеточном уровне рост любого органа, в том числе и печени, может осуществляться тремя путями : 1) увеличением числа клеток в органе (пролиферация) ; 2) увеличением числа геномов в клетках (полиплоидизация) ; 3) ростом цитоплазмы (гипертрофией), не связанным с процессами пролиферации и полиплоидизации (127, 128). Г.А.Сакута и соавт. показано, что за 6 месяцев наблюдения увеличение массы печени у интактных крыс осуществляется исключительно за счет ДНК-синтетических процессов, а именно пролиферации (69%) и полиплоидизации (31%) гепатоцитов. В дальнейшем, по мере затухания полиплоидизации клеток, постепенно усиливаются гипертрофические процессы и через 12 месяцев пролиферация и гипертрофия цитоплазмы гепатоцитов оказываются единственными клеточными компонентами роста органа. Таким образом, физиологическая регенерация нормальной печени взрослых крыс осуществляется преимущественно за счет деления клеток и в меньшей степени - их гипертрофии (200).
Репаративная регенерация неизбежно связана с патологией, так как в результате травмы или других воздействий возникает воспаление и вступают в силу защитные реакции организма (89, 121), при этом выздоровление органа в значительной мере зависит от его регенерации (52, 127, 200). При репа-ративной регенерации печени, но не при физиологической, наблюдается перестройка кровоснабжения и иннервации, образование новых долек и их гипертрофия (128, 132). В отличие от физиологической регенерации, при репа-ративной регенерации наблюдается более быстрое деление клеток и усиление полиплоидизации, что представляет собой компенсаторную реакцию на патологическое воздействие (200). Полиплоидизация части клеток позволяет повысить функциональную активность генетического аппарата клетки параллельно с интенсификацией в ней специфической функции, что подтверждается более высоким содержанием внутриклеточных структур в этих клетках (мембран эндоплазматической сети, вакуолей пластинчатого комплекса, митохондрий) (127, 128). Резервом полиплоидизации считаются двуядерные гепатоциты, так как в результате их митоза (бимитоза) в метафазе возможно обьединение хромосомных наборов в одну метафазную пластинку с образованием ядер следующего уровня плоидности (223).
Регенерация в условиях применения токсических агентов или заболеваний вирусной этиологии осуществляется с помощью механизмов, аналогичных действующим при репаративной регенерации после частичной гепа-тэктомии. Поврежденные части печени восстанавливаются за счет регенера-ционной гипертрофии, но появление при этом дистрофически измененных клеток сказывается на увеличении сроков регенерации (277, 320). В течение 6 месяцев отравления ТХМ за счет репаративной регенерации происходит пятикратное возобновление массы органа, а каждый гепатоцит осуществляет примерно в 1,7 раза больше делений, чем в интактной печени (200). При этом, пролиферативные процессы хотя и активируются (282, 294), но процентная доля пролиферации в восстановлении утраченной паренхимы снижается, так как повышаются процентные доли полиплоидии и гипертрофии (200). Причем гипертрофия клеток также может быть следствием полиплоидии (128).
Влияние АКТГ4-10 на физиологическую регенерацию, функцио нальные показатели печени и на иммунный ответ
Как уже сообщалось выше, в отличие от DSLET- селективного агони-ста рецепторов стресс-лимитирующей опиоидергической системы, АКТГ-это компонент стресс-реализующей системы, участвующей в адаптации организма к патогенным факторам внешней среды (141, 189). В последнее время появились сообщения о том, что АКТГ 4-ю и препарат «семакс» ( аналог АКТГ 4-7) влияют на регенерацию некоторых тканей, поскольку известен стимулирующий пролиферацию эффект АКТГ 4-ю в роговице (168, 431) и благоприятное влияние семакса на заживление язв (49, 170). Кроме того, известны иммунотропные эффекты АКТГ и его фрагментов (26, 311, 354). В связи с этим представляло интерес исследование эффектов АКТГ4-ю на физиологическую регенерацию гепатоцитов и иммунную систему, участвующую в регуляции регенерации печени (16, 176).
Эксперименты проводились по той же схеме, что и при исследовании эффектов GHL и DSLET. В условиях 10-кратнрго введения в дозе 0,5 мкг/кг АКТГ4-ю не обладает гепатотропной активностью, так как не выявлено существенных различий в МИ, ИДГ и ДЯ гепатоцитов (таблица 18). Как и DSLET, в дозах 1,5 и 5 мкг/кг АКТГ4-ю не влияет на МИ, но повышает ИДГ в 1,3 раза по сравнению с показателями у животных, получавших изотонический раствор. Но в отличие от DSLET АКТГ4-10 в указанных дозах существенно не снижает ДЯ гепатоцитов. В дозах же 50, 150 и 450 мкг/кг АКТГ4.ю повышает МИ в 1,9; 2,0 и 1,9 раза, соответственно, а ИДГ - в 1,4 раза по сравнению с контрольными величинами. При этом, последний эффект пептида менее выражен по сравнению с DSLET.
Таким образом, АКТГ4-ю, как и ранее исследованные пептиды, обладает гепатотропной активностью.
Митотическая активность АКТГ4.ю сравнима с митотической активностью DSLET и проявляется при той же дозе (50 мкг/кг), но слабее митотической активности GHL, который уже в дозе 1,5 мкг/кг повышает МИ гепа-тоцитов более чем в 2,7 раза, тогда как AKTTVio обладает митотической активностью только в дозе 50 мкг/кг и повышает МИ только в 1,9 раза. Однако в отличие от GHL и подобно DSLET, АКТГ4-10 во всех дозах, начиная с дозы 1,5 мкг/кг, повышает количество ИДГ, что свидетельствует о стимуляции ацитокинетического типа клеточного деления. АКТГ4.ю во всех дозах не влияет на ДЯ гепатоцитов.
Гепатотропная активность АКТГ4-10 подобна эффектам DSLET, в том, что он в тех же дозах, как и DSLET, повышает количество двуядерных клеток (но менее выраженно), стимулирует митотическую активность и снижает организованность печени по мере возрастания дозы. Но у АКТГ4-ю, и GHL также есть общее свойство - при такой кратности введения они существенно не влияют на ДЯ гепатоцитов, но в отличие от GHL, АКТГ 4-ю проявляет менее выраженную митотическую активность.
АКТГ 4.ю не влияет на функциональную активность нейтрофилов в дозе 0,5 мкг/кг (таблица 19). В дозах 1,5 и 5 мкг/кг АКТГ 4-ю не изменяет ФИ и ФЧ, но снижает спонтанную реакцию НСТ-теста в 1,4 и 1,5 раза соответственно, существенно не влияя на индуцированную реакцию. В дозах 50, 150 и 450 мкг/кг АКТГ 4-ю супрессирует функциональную активность нейтрофилов, так как снижает ФИ в 1,5; 1,7 и 1,5 раза ,ФЧ - в 1,5; 1,9 и 2,0 раза, уровень спонтанного НСТ - теста - в 1,7; 2,0 и 2,1 раза, индуцированного НСТ - теста в 1,5; 1,6 и 1,8 раза по сравнению с показателями у животных, получавших изотонический раствор. Функциональный резерв нейтрофилов при введении АКТГ 4-іо в дозе 1,5 мкг/кг повышался в 1,7 раза и снижался в дозе 450 мкг/кг в 1,6 раза. При других дозах достоверных изменений функционального резерва не выявлено.
Таким образом, АКТГ 4-ш оказывает преимущественно супрессирую-щее влияние на функциональную активность нейтрофилов, более выраженное при его введении в дозах 50; 150 и 450 мкг/кг. При этом резервные возможности кислородзависимых механизмов практически не снижаются (за исключением дозы 450 мкг/кг) и даже повышаются в дозе 1,5 мкг/кг.
При введении до иммунизации пептид при изученных дозах не влияет на количество ядерных клеток в селезенке (таблица 20). В дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг АКТГ 4-ю не влияет на выраженность ГИО и ГЗТ, а в дозах 5; 50; 150 и 450 мкг/кг - снижает количество АОК на 106 ядерных клеток в 1,6; 2,0 ; 2,1 и 2,2 раза, а число АОК в селезенке в 1,6; 1,9; 2,0 и 2,2 раза по сравнению с показателями у животных, получавших изотонический раствор. В дозах 50, 150 и 450 мкг/кг пептид снижает РМЛ в 1,4; 1,6 и 1,8 раза, а РКЛ в 1,4; 1,5 и
Пептид оказывает супрессирующее действие и при его введении после иммунизации (сенсибилизирующей дозы в ГЗТ), не влияя при этом на клеточность селезенки (таблица 21). Иммуносупрессирующий эффект проявляется уже в дозе 1,5 мкг/кг, о чем свидетельствует снижение в 1,4 раза числа АОК как в миллионе ядерных клеток, так и в селезенке по сравнению с их числом у животных, получавших изотонический раствор хлорида натрия.
При дозах пептида 5; 50; 150 и 450 мкг/кг количество АОК на 106 ядерных клеток снижается соответственно в 1,9; 2,2; 2,4 и 2,5 раза, а АОК в селезенке- в 1,7; 1,9; 2,2 и 2,3 раза по сравнению с контролем. Супрессирую-щий эффект на развитие ГЗТ отмечается только начиная с дозы 5 мкг/кг, в которой АКТГ 4-ю снижает РКЛ в 1,4 раза по сравнению с контролем, но не влияет на РМЛ. В дозах 50; 150 и 450 мкг/кг пептид снижает РМЛ в 1,6; 1,7 и 1.9 раза, а РКЛ в 1,6; 1,7 и 1,8 раза соответственно.
Влияние GHL, DSLET и АКТГ4.ю на функциональные показатели печени и иммунной системы в условиях острой гепатопатий, вызванной гидразином
Большую роль в эндокринной регуляции играют процессы взаимного влияния одних сигнальных молекул на другие в процессах инициации и реализации их эффектов (194). Поэтому значительный интерес представляют вопросы потенцирования или ослабления эффектов регуляторных пептидов. В связи с этим было необходимо выяснить, как влияют исследуемые пептиды на гепато- и иммунотропную активности в условиях ОТГ не только при раздельном применении, но и в различных сочетаниях. В ранее проведенных исследованиях было показано, что GHL обладает активирующими эффектами на регенерацию и, за исключением хронической гепатопатии, является наиболее мощным стимулятором митотической активности гепатоцитов по сравнению с другими пептидами. Что касается DSLET и АКТГ 4-ю то они обладают регуляторной функцией, так как направленность и выраженность их эффектов неодинакова в разных моделях токсических гепатопатии. Поэтому вполне возможно, что, обладая такими свойствами, DSLET и АКТГ 4-ю могут модулировать эффекты и самого GHL. Для выяснения этого вопроса были изучены эффекты пептидов в условиях их комбинированного введения. Использованы две комбинации: GHL + DSLET и GHL + AKTTVio при дозах пептидов 1,5 и 50 мкг/кг.
В ранее проведенных экспериментах было замечено, что все изучаемые пептиды в большей степени влияют на антиген-специфическую иммунологическую реактивность, чем на функцию нейтрофилов. Поэтому в условиях комбинированного введения пептидов первоначально изучалась специфическая в отношении антигена иммунологическая реактивность, как наиболее чувствительная к таким воздействиям.
Введение пептидов в дозе 1,5 мкг/кг стимулирует репаративную регенерацию по сравнению с отравленными животными, получавшими изотонический раствор (таблица 54). Так, АКТГ4-ю, DSLET и GHL, введенные раздельно повышают МИ соответственно в 1,6; 1,7 и 2,2 раза, по сравнению с его величиной у отравленных ТХМ животных, получавших изотонический раствор. АКТГ4-ю и GHL не влияют на ИДГ, a DSLET его повышает в 1,2 раза. Использование GHL в комбинации с DSLET приводит к усилению ми-тотической активности гепатоцитов, о чем свидетельствует повышение МИ в 2,6 раза по сравнению с этим показателем у отравленных ТХМ животных, получавших физиологический раствор и в 1,2 раза по сравнению с МИ у животных, получавших ТХМ и GHL. Введение этой комбинации пептидов нормализует ДЯ гепатоцитов. Повышение ИДГ в этом случае не выявлено. Использование же GHL в комбинации с АКТГ4.ю в дозе 1,5 мкг/кг, напротив, не только не приводит к усилению регенераторных эффектов, но и несколько ослабляет гепатотропные эффекты GHL, о чем свидетельствует снижение МИ в 1,3 раза по сравнению с величиной этого показателя у животных, отравленных ТХМ и получавших только GHL. Во всех подопытных группах наблюдается снижение относительной энтропии и повышение коэффициента организации, но максимальные изменения по сравнению с группой отравленных ТХМ животных, получавших изотонический раствор, отмечаются в группе отравленных животных, получавших АКТГ 4-ю и комбинацию GHL + DSLET.
В условиях ОТГ, вызванной ТХМ, введение АКТГ4_ю в дозе 50 мкг/кг не влияет на репаративную регенерацию, а введение DSLET и GHL в дозе 50 мкг/кг приводит к повышению МИ соответственно в 1,8 и 2,0 раза и не влияет на ДЯ гепатоцитов по сравнению с показателями у отравленных ТХМ животных, получавших физиологический раствор (таблица 55). В этой дозе DSLET не влияет на ИДГ, a GHL его повышает в 1,2 раза. Введение GHL в комбинации с DSLET приводит к повышению как МИ, так и ИДГ и снижению ДЯ гепатоцитов по сравнению с этими показателями у отравленных ТХМ животных, получавших пептиды раздельно. В частности, введение GHL одновременно с DSLET повышает МИ в 1,5 , а ИДГ в 1,2 раза по сравнению с их величинами у животных с ОТГ, получавших только GHL, что свидетельствует об усилении выраженности репаративной регенерации при одновременном введении этих пептидов. Введение же GHL в комбинации с AKTTYio приводит к снижению МИ и ИДГ по сравнению с их величинами у отравленных ТХМ животных, получавших только GHL, в результате чего все показатели в этой группе не отличаются от показателей у отравленных животных , получавших изотонический раствор. Анализ энтропийных факторов обнаруживает наибольший рост упорядоченности в группах животных, получавших АКТГ 4-ю и комбинацию GHL+DSLET.
Таким образом, введение GHL в комбинации с DSLET приводит к потенцированию их регенераторных эффектов. При введении пептидов в дозе 1,5 мкг/кг происходит усиление только митотической активности гепатоцитов, тогда как при дозе 50 мкг/кг повышается количество как митозов, так и двуядерных гепатоцитов, что сопровождается снижением энтропии и повышением коэффициента организации. Введение же GHL в комбинации с АКТГ4-ю в дозах 1,5 мкг/кг ослабляет митотический, а при 50 мкг/кг также и ацитокинетический эффекты GHL и снижает упорядоченность системы, по сравнению с эффектами у отравленных животных, получавших только АКТГ4-Ю.
Похожие диссертации на Влияние регуляторных пептидов на гепатоцеллюлярные и иммунную функции организма
