Содержание к диссертации
І.ВВЕДЕНИЕ 4
ІІ.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
2.1. Роль регуляторных пептидов в организме 7
Общие сведения о регуляторных пептидах 7
Регуляторный пептид семакс 9
Физиологическое действие семакса 9
Молекулярно-клеточные механизмы действия семакса 14
2.2. Активные формы кислорода в организме 18
Образование АФК в клетке 18
Влияние АФК на структуру и функции клетки 20
Антиоксидантная защита клетки 33
2.3. Регуляция функциональной активности клетки 35
Плазматическая мембрана клетки 35
Вторичные мессенджеры 40
2.4. Структура и функции перитонеальных макрофагов 47
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
3.1. Объекты исследования и их выделение 53
Перитонеальные макрофаги мышей 53
Монослоиные культуры мозжечка, септума и гиппокампа 56
3.2. Методы исследования 59
3.2.1. Микрофлуориметрическии метод определения внутриклеточного
рН .' 59
3.2.2.Микрофлуориметрический метод определения целостности
плазматической мембраны клетки 60
Оценка содержания активных форм кислорода в макрофагах 61
Оценка уровня клеточного метаболизма 62
Статистическая обработка результатов экспериментов 63
3.3. Экспериментальные клеточные модели 63
3.3.1. Окислительный стресс, индуцированный в клетках с помощью
Н202 63
3.3.2. Ультрафиолетовое облучение клеток 64
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 65
4.1. Повреждение плазматических мембран макрофагов при действии
Н202 65
4.1.1.Температура и время инкубации клеток с Н202 в разных
концентрациях 65
Ионы Са+2 70
Ионы Н" 74
Лекарственный препарат мексидол 77
4.2. Защитное действие семакса при Н202-индуцированном повреждении
плазматических мембран клеток 80
Концентрация семакса 80
Иммуномодулирующий пептид тафцин 86
Последовательность введения к клеткам семакса и Н202 88
Ионы Са+2 98
4.2.5.Повреждение клеточных мембран, вызванное ультрафиолетовым
облучением 103
4.3. Влияние семакса на некоторые функционально-метаболические параметры
клеток 106
Внутриклеточный рН 106
Образование в макрофагах активных форм кислорода 114
Дегидрогеназная активность митохондрий в клетке 117
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121
VI. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 122
VII. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 123
VHI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время очевидна необходимость создания лекарственных препаратов, способных повышать эффективность умственного труда в сложных условиях, не обладающих негативными побочными воздействиями. В поисках таких средств исследователи обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или соединений, являющихся близкими их аналогами. В первую очередь внимание специалистов привлекают к себе регуляторные пептиды, воздействующие практически на все физиологические функции организма (Ляпина Л.А., Пастророва В.Е., 2006).
Одним из перспективных направлений в этой области являются работы по созданию лекарственных средств на основе аналогов фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ), в частности фрагмента 4-10 аминокислотной последовательности АКТГ(4_ю). В современной клинической практике одним из самых известных клинически применяемых препаратов, созданных на основе фрагмента АКТГ в Институте молекулярной генетики РАН (Пономарева-Степная М.А. и др., 1984), является семакс. Семакс - первый российский ноотропный препарат неистощающего типа из группы нейропептидов, имеющий ряд важных преимуществ перед известными аналогами: полное отсутствие токсических и побочных влияний, а также гормональной активности.
С использованием ряда поведенческих моделей в доклинических исследованиях были получены данные об эффективности семакса как препарата, обладающего ноотропным и нейропротекторным действием (Ашмарин И.П., 1997; Сафарова Э.Р., 2003). Вместе с тем, механизм действия семакса на клеточном и молекулярном уровнях до конца не изучен.
Имеющиеся в настоящее время в литературе данные (Сафарова Э.Р., 2003; Гривенников И.А., 2006) указывают на то, что высокая фармакологическая эффективность регуляторного пептида семакса в значительной степени определяется его нейропротекторным действием, в частности, его
5 способностью повышать устойчивость мембран клеток к действию
повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют
активные формы кислорода (АФК), повышение уровня которых сопровождает
развитие целого ряда заболеваний. В число активных форм кислорода входит и
перекись водорода, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую
роль в реализации действия АФК на клетки. Одной из важных мишеней
повреждающего действия Н2О2 на клетку является ее плазматическая мембрана.
При этом, как полагают (Гамалей И.А., 1997), Н202 индуцирует в клетке
развитие процессов перекисного окисления липидов, приводящих к нарушению
целостности их плазматических мембран и, как следствие, повышению
проницаемости, а в дальнейшем - клеточной гибели. Известно, что действие
многих повреждающих агентов на клетки сопровождается изменением
внутриклеточной концентрации ионов ЕГ" и свободного Са2+, что играет важную
роль в формировании ответа клеток на эти воздействия и реализации их
повреждающего эффекта (Литинская Л.Л. и др., 1987; Порядин Г.В., 1997).
Таким образом, изучение роли рН и Са в качестве модифицирующих агентов может привести нас к пониманию возможных механизмов защитного действия семакса.
В заключение следует подчеркнуть, что, несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы проблема механизмов реализации молекулярных и клеточных эффектов семакса еще далека от своего окончательного разрешения.
Цель и задачи работы.
Целью настоящей работы было изучение влияния регуляторного пептида семакса на Н202-индуцированные повреждения мембран перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток. В задачи работы входило:
1. Изучение основных закономерностей повреждающего действия перекиси водорода на мембраны перитонеальных макрофагов мышей и культивируемых нервных клеток мозга крыс.
2. Изучение влияния семакса на Н202-индуцированное повреждение
плазматических мембран иммунокомпетентных и нервных клеток.
3. Изучение влияния семакса на некоторые функционально-метаболические
параметры клеток.
Актуальность, показано, что регуляторныи пептид семакс может защищать плазматические мембраны клеток при с НгОг-индуцированном окислительном стрессе.
Научная новизна. Использован комплексный подход к изучению протекторного действия семакса при повреждающем действии Н202- Изучено влияние ионов водорода на защитный эффект семакса при окислительном стрессе. Выявлено влияние исследуемого регуляторного пептида на функционально-метаболическую активность фагоцитарных и нервных клеток.
