Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологические эффекты и возможные механизмы действия ЭМИ КВЧ низкой интенсивности 10
1.1. Основные особенности или закономерности взаимодействия ЭМИ КВЧ с биологическими объектами 10
1.1.1. Нетепловой характер взаимодействия . 10
1.1.2. Резонансный характер ответа на облучение 11
1.1.3. Пороговый (по мощности) характер взаимодействия 12
1.1.4. Амплитудно-частотные «окна» 13
1.1.5. Роль воды в поглощении ММ волн 13
1.1.6. Конвективное движение жидкости при поглощении ММ излучения водой и водными растворами .. 14
1.1.7. Роль ионов Са2+ 15
1.1.8. Поглощение излучения клетками кожи 16
1.2. Исследования по влиянию ЭМИ КВЧ низкой интенсивности на различные биологические объекты 17
1.2.1. Опыты по изучению эффектов взаимодействия излучения с низшими организмами и культурами клеток 17
1.2.2. Эффекты облучения ЭМИ КВЧ насекомых 21
1.2.3. Медико-биологические эффекты ЭМИ КВЧ 22
1.2.4. Иммунотропные эффекты модулированного ЭМИ 28
1.2.5. Комбинированное действие ММ волн в сочетании с другими лечебными средствами на организм 30
Глава 2. Функциональная роль цитокинов и оксида азота в норме и патологии 33
2.1. Фактор некроза опухолей 36
2.2. Интерлейкин-2..., 39
2.3. Интерлейкин-3... 42
2.4. Современная цитокинотерапия 45
2.5. Оксид азота 47
Глава 3. Материалы и методы исследования 53
3.1. Животные 53
3.2. Источники и характеристики излучения. Условия облучения 53
3.3. Методика измерения сверхмалой плотности потока энергии 54
3.4. Формирование экспериментальной опухоли 57
3.5. Условия иммунизации мышей и определение продукции антител в сыворотке крови иммунизированных животных .. 57
3.6. Получение перитонеальных макрофагов 58
3.7. Получение спленоцитов 59
3.8. Приготовление образцов и определение концентрации ФНО-а 60
3.9. Определение концентрации оксида азота 62
3.10. Определение концентрации интерлейкинов 62
3.11. Статистическая обработка данных 64
Глава 4. Определение влияния AM ЭМИ КВЧ с несущей частотой 40 ГГц на секрецию цитокинов (ФНО, ИЛ-2 и ИЛ-З) у здоровых мышей 65
4.1. Влияние облучения (40 ГГц) in vivo на продукцию ФНО 65
4.2. Влияние облучения (40 ГГц) in vitro на продукцию ФНО 67
4.3. Влияние облучения (40 ГГц) на секрецию интерлейкинов (ИЛ-2,ИЛ-3) 70
4.4. Влияние облучения (40 ГГц) in vivo на количество иммунокомпетентных клеток 72
Глава 5. Определение влияния AM ЭМИ КВЧ с несущей частотой 42,2 ГГц на секрецию цитокинов (ФНО, ИЛ-2 и ИЛ-З) и оксида азота у здоровых мышей 73
5.1. Влияние облучения (42,2 ГГц) in vivo на продукцию ФНО 73
5.2. Влияние облучения (42,2 ГГц) in vitro на продукцию ФНО 75
5.3. Влияние облучения (42,2 ГГц) на секрецию интерлейкинов (ИЛ-2,ИЛ-3) 76
5.4 Влияние облучения (42,2 ГГц) in vivo на секрецию оксида азота 78
5.5. Влияние облучения (42,2 ГГц) in vivo на количество иммунокомпетентных клеток 80
Глава 6. Влияние AM ЭМИ КВЧ с несущей частотой 42,2 ГГц на секрецию ФНО, ИЛ-2, ИЛ-3 и N0 при фракционированном воздействии на здоровых < мышей и опухоленосителей 81
6.1 Продукция ФНО иммунокомпетентными клетками 82
6.1,1 ФНО у облученных здоровых мышей 82
6.1.2. ФНО у опухоленосителей 82
6.1.3. ФНО у облученных опухоленосителей 82
6.2. Концентрация ФНОвплазме 84
6.2.1. ФНО у облученных здоровых мышей 84
6.2.2. ФНО у опухоленосителей 85
6.2.3. ФНО у облученных опухоленосителей 85
6.3. Секреция интерлейкинов спленоцитами 86
6.4. Секреция оксида азота макрофагами 87
6.4.1. N0 у облученных здоровых мышей 87
6.4.2. N0 у опухоленосителей 88
6.4.3. N0 у облученных опухоленосителей 88
6.5. Влияние облучения AM ЭМИ КВЧ с несущей частотой 42,2 ГГц на количество спленоцитов и перитонеальных макрофагов у здоровых мышей и опухоленосителей 89
6.6. Выживаемость опухоленосителей 91
Глава 7. Влияние фракционированного облучения AM ЭМИ КВЧ с несущей частотой 40 ГГц на антителообразование у иммунизированных мышей 92
7.1. Влияние фракционированного облучения на антителообразование при развитии первичного иммунного ответа 93
7.2. Влияние фракционированного облучения на антителообразование при развитии вторичного иммунного ответа 94
7.3. Влияние фракционированного облучения на количество спленоцитов у иммунизированных мышей 95
Заключение 96
Выводы 100
Список цитируемой литературы 101
- Конвективное движение жидкости при поглощении ММ излучения водой и водными растворами
- Опыты по изучению эффектов взаимодействия излучения с низшими организмами и культурами клеток
- Условия иммунизации мышей и определение продукции антител в сыворотке крови иммунизированных животных
- Влияние облучения (42,2 ГГц) на секрецию интерлейкинов (ИЛ-2,ИЛ-3)
Введение к работе
Актуальность проблемы, В последние годы на фоне значительного ряда работ по исследованию действия электромагнитного излучения (ЭМИ) миллиметрового (ММ) диапазона на живые организмы формируется новое направление по изучению влияния этого фактора на функциональные системы организма человека и животных. Интерес к биологическим эффектам ЭМИ низкой интенсивности определяется несколькими обстоятельствами. Во-первых, взаимодействие ЭМИ с веществом при низких интенсивностях падающего излучения имеет нетепловой характер. Во-вторых, высказан целый ряд гипотез относительно механизмов взаимодействия этого вида излучения с биологическими системами (Бецкий и др., 2002; Девятков и др., 1991). В-третьих, существует немало данных об иммуномодулирующих эффектах ЭМИ, широко применяемых в КВЧ-терагши (Аловская и Габдулхакова, 1998; Rojavin and Ziskin, 1998). И, в-четвертых, вследствие чрезвычайного многообразия сигналов ЭМИ, использующихся в различных отраслях, в том числе компьютерной технике и средствах современной электронной связи, ЭМИ приобретает значение все более существенного экологического фактора (Григорьев и др., 2001).
Несмотря на то, что исчерпывающего ответа на вопрос о механизмах первичной рецепции ЭМИ пока не существует, считается доказанным, что одной из наиболее чувствительных систем в организме млекопитающих к воздействию ЭМИ является иммунная система. Между тем, недостаточно исследовано действие ЭМИ нетепловых мощностей на секрецию метаболитов иммунокомпетентных клеток, в частности, таких регуляторних агентов, как фактор некроза опухолей (ФИО) и оксид азота. Известно, что при нормальном физиологическом состоянии организма набор цитокинов невелик, но при стрессе, воспалении, опухолеобразовании и других патологиях изменяется количественный и качественный состав цитокинового профиля (Богдашин и др., 1991; Суслов, 1990). Цитокины, являясь молекулами плейотропного действия, интенсивно изучаются в последнее время в связи с их способностью оказывать полилечебный эффект при различных патологических состояниях -от аутоиммунных расстройств до онкологических заболеваний. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования, связанные с модулированием эндогенной продукции факторов иммунологической защиты при воздействии ЭМИ низкой интенсивности.
Цель и основные задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании иммунотропного действия низкоинтенсивных электромагнитных волн миллиметрового диапазона и зависимости эффектов ЭМИ от иммунного статуса объектов исследования. В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Исследовать эффекты воздействия in vivo и in vitro низкоинтенсивными амплитудно-моАудированными (AM; частота амплитудной модуляции 10 Гц) ЭМИ КВЧ (несущие частоты 40 и 42,2 ГТц) на секрецию цитокинов
ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург »0бРК
(ФНО, ИЛ-2 и ИЛ-3) и оксида азота иммунокомпетентными клетками мышей.
-
Изучить иммуномодулирующее действие AM ЭМИ КВЧ (частота модуляции 10 Гц; несущая частота 42,2 ГГц) на секрецию цитокинов и оксида азота в клетках мышей с привитой карциномой Эрлиха на разных стадиях опухолевого роста.
-
Исследовать эффекты AM ЭМИ КВЧ (частота модуляции 10 Гц; несущая частота 40 ГГц) на уровень образования антител у мышей после антигенной стимуляции.
Научная новизна. Впервые обнаружен немонотонный характер зависимости доза-эффект продукции ФНО при однократном и фракционированном облучении с использованием AM ЭМИ КВЧ с частотой модуляции 10 Гц и несущими частотами 40 и 42,2 ГГц. Установлено, что длительное фракционированное облучение мышей с экспериментальными опухолями с использованием AM ЭМИ КВЧ (несущая частота 42,2 ГГц) не увеличивало противоопухолевую резистентность животных. Впервые было обнаружено угнетение уровня образования антител у облученных антигенстимулированных мышей при использовании фракционированного режима облучения AM ЭМИ КВЧ (несущая частота 40 ГГц).
Научно-практическая ценность. Представленные в настоящей работе исследования по влиянию низкоинтенсивных AM ЭМИ КВЧ (частота модуляции 10 Гц; несущие частоты 40 и 42,2 ГГц) in vitro и in vivo имеют важное значение для более глубокого понимания биофизических механизмов взаимодействия ММ волн с живой системой. Результаты этой работы представляют несомненный практический интерес, поскольку могут быть использованы для разработки стратегии терапевтического применения AM ЭМИ КВЧ.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международных симпозиумах "Electromagnetic compatibility" (Wroclaw, Poland, 2002, 2004), международной конференции "Euro Electromagnetics-2004" (Magdeburg, Germany, 2004), международной конференции "Biology, chemistry, and therapeutic applications of nitric oxide" (Nara, Japan, 2004), международном конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека" (Кара-Даг, Украина, 2003), конференциях молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2002, 2003, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи.
Структура и объем диссертапии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их
обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на
страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка. Библиографический
указатель содержит источников литературы.
Список сокращений. AM - амплитудная модуляция, ИЛ-2 - интерлейкин-2, ИЛ-3 - интерлейкин-3, ИФА - иммуноферментный анализ, КВЧ - крайне высокая частота, ЛПС - липополисахарид, ММ - миллиметровый, ФГА -фитогемагглютинин, ФНО - фактор некроза опухолей, ЭМИ электромагнитное излучение, IgG - иммуноглобулины класса G, N0 - оксид азота.
Конвективное движение жидкости при поглощении ММ излучения водой и водными растворами
Поглощение ММ излучения низкой интенсивности водой и водными растворами может приводить к перемешиванию облучаемой среды вследствие вынужденной конвекции. Экспериментально конвекция обнаружена при пороговых значениях ППМ порядка 0,5 мВт/см , причем во всех опытах не было зафиксировано локальных изменений температуры растворов (Бецкий и др., 1983). Конвекция возникает на границе раздела фаз (воздух - жидкость, жидкость - твердое тело) за счет приповерхностного поглощения ММ излучения и обусловлена изменением сил поверхностного натяжения на этой границе (термокапиллярный эффект). Экспериментально было показано, что конвекция в водном растворе может приводить не только к локальному перемешиванию в зоне действия излучения, но и ускорять газообмен раствора с воздухом (Шаров и др., 1983). Конвективное перемешивание водной среды может иметь важные последствия для биологических объектов, особенно в тех случаях, когда протекание каких-либо процессов в объекте лимитировано стадиями переноса вещества через слой воды. Так, например, обнаружено ускорение ПОЛ в липосомах за счет влияния ММ излучения (частотный диапазон от 42 до 75 ГГц; ППМ не более 1 мВт/см2) на водорастворимые вещества, участвующие в реакции (Андреев и др., 1981), Но наиболее существенным является влияние ММ излучения на процессы мембранного транспорта, обусловленного конвекцией в примембранных слоях воды (Казаринов и др., 1984). Возникающее во внутри- и межклеточной жидкости сложное конвективное движение приводит к более активному переносу веществ и электрических зарядов (Бецкий и Путвинский, 1986; Khizhnyak & Ziskin, 1996). Хочется обратить внимание на то обстоятельство, что конвекция возможна не только в объеме жидкости, но и в тонких слоях толщиной менее 1 мм при пороговых значениях падающей мощности порядка нескольких микроватт (Khizhnyak & Ziskin, 1996). Биологические процессы мембранного транспорта обусловливают практически все функции клеток. Поэтому есть все основания предполагать, что биомембраны являются одним из своеобразных «детекторов» ММ излучения в живой клетке.
Роль ионов Са +. Считается, что многие биологические эффекты ЭМИ опосредованы действием на Са2+-зависимые процессы внутриклеточной сигнализации (Adey, 1993; Karabakbisian et al., 1994; Walleczek, 1992). Так, Эйди обнаружил увеличение калиевой проницаемости мембран при увеличении концентрации внутриклеточного кальция в эритроцитах, в нервных клетках морского моллюска Aplysia и в нейронах виноградной улитки (Adey, 1981). Им же было показано, что облучение вызывает высвобождение ионов Са2\ связанных с макромолекулами поверхностного слоя мембран (Adey, 1975). Подобный эффект описан другими авторами, которые обнаружили, что ЭМИ ММ диапазона могут модифицировать активность Са2+-зависимых мембраносвязанных белков (Катаев и др., 1993; Geletyuk, 1995), что, в свою очередь, может приводить к существенным изменениям на уровне основных функций клеток различного типа. Известно, -что частота колебаний концентрации Са в цитоплазме, определяемая интенсивностью воздействия внешнего фактора на рецептор, может служить переключателем для экспрессии тех или иных генов (Berridge, 1999; Britch, 1999). В отношении действия микроволнового излучения на нейронную сеть предлагается модель действия через NMDA-рецептор, сопряженный сСа2+ -каналом; вызываемые облучением колебания концентрации кальция приводят к увеличению рефрактерного времени нейронов (Сидоренко, 2002).
Кожа примерно на 65% состоит из воды. Вода считается основным поглощающим компонентом тела человека или животного (Berteaud, 1983), однако, хорошо известно, что проникновение ММ волн в тело человека или животного практически ограничивается кожным покровом (Бецкий и Ильина, 1989). Известно, что при облучении животных и человека ММ волны почти полностью (до 90-95%) поглощаются в тонком слое кожи толщиной примерно 0,1-0,2 мм, т.е. в эпидермисе (Gandhi, 1983). Величина удельной поглощаемой мощности при ППМ всего 5 мВт/см может составить для ММ диапазона длин волн 180-640 Вт/кг (Gandhi, 1983). Значительная разница в содержании воды как в поверхностных, так и в более глубоких слоях кожи (Фролов, І 982), может служить фактом пространственно неоднородного поглощения энергии КВЧ излучения (Родштат, 1985). При этом в связи с очень малой, порядка 0,5-0,7 мм, эффективной глубиной поглощения КВЧ излучения, вполне допустимо возникновение объемно распределенных микротемпературных градиентов (Бецкий и Девятков, 1996). Обусловленное микроволновым излучением формирование температурного градиента между кожными слоями может оказаться вполне достаточным для активации термочувствительных, включая и механорецепторы, нервных окончаний, поскольку известно, что пороговым стимулом считается рост температуры со скоростью от 0,004С/с для Холодовых и до 0,001С/с для тепловых рецепторов человека (Алексеев и др., 1997).
Оригинальной является физиологическая концепция, развиваемая Родштатом (Родштат, 1985), В соответствии с ней передача информации ЭМИ начинается с областей крупных суставов, где кожа сильно гидратирована. Тогда можно предположить участие в ответе на облучение коллагеновых волокон и телец Руффини, которыми богата кожа в местах суставных соединений. Далее в цепочку действия через нервные волокна вовлекаются серое вещество спинного мозга и малые интенсивно флуоресцирующие (МИФ) нейроны вегетативных ганглиев, расположенных в стенках внутренних органов. Эти нейроны выделяют адреналин и норадреналин (начало гуморальной части рефлекторной дуги), которые с кровотоком достигают сосудов головного мозга и влияют на микроциркуляцию и метаболизм.
Опыты по изучению эффектов взаимодействия излучения с низшими организмами и культурами клеток
Первые научные публикации по изучению эффектов воздействия низкоинтенсивных ЭМИ КВЧ на биологические объекты были посвящены влиянию ММ волн на микрофлору воздуха помещений (Адаменко и др., 1966; Кондратьева и Чистякова, 1967). В результате обнаружилось бактерицидное действие ММ излучения: облучение объема комнаты (А.-7,2 мм; ППМ 10 мВт/см ) в течение 4 ч снижало количество микробов в воздухе в 2-3 раза. Однако при многодневном облучении количество микробов в воздухе стабилизировалось на очень низком уровне (Кондратьева и Чистякова, 1967).
Затем была выполнена серия экспериментальных исследований с различными микроорганизмами. В большинстве работ, посвященных поиску эффектов и механизмов взаимодействия излучения с микроорганизмами, основное внимание уделялось изучению частотной зависимости изменений под действием излучения тех или иных параметров биологического объекта, характеризующих его структурно-функциональное состояние (Смолянская и др., 1973; Севастьянова и Виленская, 1973). Для начального этапа изучения чувствительности микроорганизмов к действию ММ волн было характерно стремление максимально исключить в экспериментах поглощение ММ излучения водой. Чаще всего исследователи подвергали облучению посевы культур непосредственно на агаре или специально просушенные клеточные суспензии. Так, если в качестве объектов исследования выбирались различные микроорганизмы (Esherichia colU Staphylococcus aureus и некоторые другие), во всех случаях облучение (Х.=7,2 мм; ППМ=4-5 мВт/см ) приводило к уменьшению количества живых микроорганизмов по сравнению с контролем (Кондратьева и др., 1967). Для изучения зависимости эффекта от длины волны излучения была проведена оценка влияния ММ волн на выживаемость пяти штаммов споровых анаэробных бактерий. Оказалось, что в трех из пяти штаммов количество клеток при длинах волн 7,10; 7,15; 7,16; 7,17; 7,18; 7,19; 7,20 мм было меньше, чем в контроле. Анализ морфологических изменений клеток, характера роста на средах, протеолитических, антигенных свойств позволил сделать предположение о связи гибели микроорганизмов с модификацией процессов клеточного метаболизма под влиянием ММ излучения. У анаэробных бактерий наблюдалось снижение способности спорообразования. При облучении суспензии кишечной палочки в диэлектрическом капилляре, помещенном в волноводный тракт, проявлялся летальный эффект, выраженность которого зависела от длины волны (Лунева и Шуб, 1982). В исследуемом диапазоне X от 6,43 до 6,52 мм указанный эффект регистрировался на 6,49 и 6,50 мм. Таким образом, разными исследователями наблюдалось явно выраженное повреждающее действие ММ излучения низкого уровня интенсивности, способного при определенных условиях оказывать стерилизующее действие на микроорганизмы.
В других работах показано статистически значимое увеличение скорости размножения дрожжей в логарифмической фазе роста (Grundler, 1983; Grundler et al., 1988). Эффекты излучения были обнаружены в области ,=7,13 мм при интенсивности излучения несколько десятков милливатт. Эффект имел пороговый характер от величины мощности и обнаруживался, начиная с 5 мВт/см2. Также было замечено, что для выявления эффекта важно синхронизировать экспозицию с фазой развития культуры (Grundler et al., 1988). На примере инфузории Spirostomum sp., в зависимости от этапа развития культуры наблюдалось как стабилизирующее, так и дестабилизирующее действие ММ излучения на скорость размножения клеток (Левина и др., 1989).
Наиболее значительное влияние ММ излучения на процессы размножения клеток наблюдали в экспериментах с микроорганизмами Е. coli, которые облучали с частотой 136 ГГц при интенсивности 7 мкВт/см2 (Webb & Dodds, 1968). Обнаружено, что в течение 90 мин культивирования не было различий между числом облученных и необлученных клеток. Через 120 мин необлученные клетки начинали быстро размножаться, и через 240 мин число клеток увеличивалось в 6 раз, тогда как количество облученной культуры оставалось на начальном уровне. Из результатов этого эксперимента видно, что ММ излучение оказывает сильное ингибирующее действие на деление E.coli, хотя влияние это не является летальным, т.к. даже после 24 ч облучения число клеток не уменьшалось. Ингибирование скорости размножения культуры Bacterium prodigiosum после ММ облучения ().=7,2 мм; ППМ=4-5 мВт/см2) коррелировало со снижением активности каталазы, разлагающей перекись, количество которой в клетках снижалось на 25-35% по сравнению с контролем (Кондратьева и др., 1967).
О формировании стимулирующих эффектов КВЧ-излучения слабой интенсивности свидетельствуют исследования по взаимодействию ЭМИ КВЧ с фотосинтезирующими объектами - прокариотической цианобактерией Sptrulma platensis и эукариотической одноклеточной водорослью Platymonas viridis (Тамбиев и Кирикова, 1998). Облучение приводило к ускорению роста и увеличению биомассы (200-250%), интенсификации процессов фотосинтеза (350%), изменению реакционной способности экзометаболитов, изменению транспорта ионов и др. Интересно, что стимулирующее действие КВЧ-излучения на фотосинтезирующие организмы снималось при отсутствии кислорода в момент облучения (облучение в атмосфере аргона) (Тамбиев и Кирикова, 2000). Предполагая участие активных форм кислорода (АФК) в формировании эффектов ЭМИ, авторы выдвигают в качестве общего возможного механизма действия ММ волн на фотосинтезирующие организмы свободнорадикальный механизм. Их предположение кажется вполне обоснованным, если учитывать результаты исследований свойств облученных растворов других авторов. Так, на примере супероксиддисмутазы (СОД) было обнаружено снижение активности в предварительно облученном (42 ГГц; 30 мВт/см ) буфере (Маринов и Чайлахян, 1997). Интересно, что каталаза, добавленная к облученному буферу, устраняла ингибирующий эффект, указывая на образование перекиси водорода в процессе облучения. Экзогенная Н2О2, сильный акцептор электронов, в микромолярных концентрациях ингибировала СОД. Если в результате облучения воды образуются сравнительно долгоживущие акцепторы электронов (зафиксировано длительное время жизни низких концентраций Н2О2), то это могло бы способствовать активации К-Са-канала или ингибированиго СОД. В том же ключе сделана работа, в которой рассматривается регуляция активности СОД и образование АФК в водных растворах под действием КВЧ-излучения, которые могут сохраняться в течение длительного времени и осуществлять опосредованное действие излучения на биосистемы (Поцелуева и др., 1998).
Условия иммунизации мышей и определение продукции антител в сыворотке крови иммунизированных животных
Мыши были иммунизированы внутрибрюшинно аффинно-очищенной карбоангидразой из эритроцитов быка (Sigma, USA), по 50 мкг/особь. Первая иммунизация была проведена с полным адъювантом Фрейнда (Sigma, USA), при этом объем смеси антиген-адъювант составлял 0,5 мл на одно животное. При второй иммунизации, которая была проведена через 14 дней после первой, использовали неполный адъювант Фрейнда (Sigma, USA). По условиям эксперимента антителообразование в плазме крови в ходе первичного иммунного ответа измеряли после 14 дней фракционированного облучения, а вторичный - после окончания 30-ти дневного курса воздействия ЭМИ.
Приготовление образцов для определения продукции антител. По условиям эксперимента содержание антител (IgG) в плазме крови измеряли на 15-й и 30-й дни, отсчитывая от первичной иммунизации мышей. Для определения продукции антител при развитии первичного иммунного ответа забор крови производили из хвостовой вены мыши. Для определения продукции антител при развитии вторичного иммунного ответа производили забор крови у декапитиро ванных мышей. Аналогично кровь собиралась от контрольных и облученных иммунизированных мышей. Непосредственно после забора кровь отстаивалась в эппендорфах в течение нескольких часов при t = +4С, затем центрифугировалась на малых скоростях в течение 20 мин (1,0x103 об/мин), после чего надосадочная жидкость переносилась в другие эппендорфы. Для измерения продукции антител использовали свежеприготовленные образцы плазмы (надосадочная жидкость), которую разводили в PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,2) до нужных концентраций. Для первичного анализа образцы разводили от 1:100 до 1:3200, а для вторичного - от 1:100 до 1:25600.
Иммуноферментный анализ для определения продукции антител. Определение титра антител в плазме крови проводили с помощью ИФА (или ELISA). Сначала в лунки 96-луночного планшета для ИФА наносили 100 мкл антигена (карбоангидраза эритроцитов быка; 10 мкг/лунка) в 50 мМ Na-карбонатном буфере (рН 9,6) и оставляли на ночь при t=+4C. После связывания антигена с полистирольным носителем несвязавшиеся компоненты удаляли 3-кратноЙ отмывкой, заполняя лунки доверху PBSween (рН 7,4) - фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% твин-20 (ДиаМ, Россия). Затем лунки планшета доверху запивали блокирующим буфером (PBSween, содержащий 2% сухого молока, рН 7,4) и инкубировали при t=+37C в течение 30 мин. Блокировка завершалась 3-кратной отмывкой PBSween, после чего в лунки наносили 100 мкл тестируемых образцов (плазма), которые были заранее разведены в PBS. Образцы инкубировали в течение 2 ч при t=+37C, а затем 3 раза отмывали с помощью PBSween (рН 7,4). Далее планшет заполняли мышиными антителами, специфичными к IgG (100 мкл/лунка; рабочий титр 1:1000), конъюгированных пероксидазой хрена (ПХ) (Sigma, USA), и инкубировали в течение 50 мин при t=+37C. После инкубации с конъюгированными антителами и тщательной отмывки (5-7 раз) в PBSween, следовала стадия образования продуктов ферментативной реакции. Для этого в лунки наносили по 100 мкл зеленого красителя ABTS, растворенного в 50 мМ Na-цитратном буфере (рН 4,0), содержащем 0,01% Н2О2, и оставляли на 40 мин при комнатной температуре для развития стабильной окраски. Цветную реакцию останавливали добавлением 1,5 мМ азида натрия (№N3), растворенного в 0,1 М Na-цитратном буфере (рН 4,0). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре для микропланшетов (Titertek Multiscan МСС/340, Flow Laboratories, Финляндия) при Х,=405 нм.
Макрофаги выделяли в условиях стерильного бокса непосредственно после умерщвления мышей (цервикальная дислокация или декапитация). Мышь закрепляли на препаровальном столике, обрабатывали со стороны брюшка 70%-ным раствором этилового спирта, делали надрезы вдоль лапок и освобождали брюшную полость. С помощью шприца внутрибрюшинно вводили 2,5-3 мл среды RPMI-1640, содержащей 5% ЭТС, с некоторым количеством воздуха. С помощью хирургического пинцета или лопаточки массировали брюшную полость в течение 2 мин, для того чтобы макрофаги перитонеальной полости отделились в суспензию. Повторно вводили иглу шприца для забора клеток перитонеального экссудата, который сразу переносили в стерильные пробирки, помещенные в стакан с кубиками льда. Перитонеальные клетки осаждали центрифугированием (1,7x103 об/мин, 3 мин) на холоду, два раза отмывали в среде RPMI-1640. Затем клетки окрашивали в смеси 0,1%-ного раствора трипанового синего и 0,1%-ного раствора эозина (1:1) и подсчитывали в камере Горяева. При подсчете не учитывали малые лимфоциты и эритроциты. Макрофаги в концентрации 1,5x10 клеток/мл суспензировали в среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глютамина (Sigma, USA), 25 мМ HEPES (Serva, Germany), гентамицин и 10% ЭТС, и помещали в 24-луночный планшет по 1 мл/лунка. Планшет оставляли на 2 ч в эксикаторе (37С, 5% СОг), чтобы произошла адгезия макрофагов к полистиролу. Далее проводимые процедуры с монослоем клеток и условия культивирования различались в зависимости от того, для какой цели готовились образцы - определение продукции ФНО или секреции оксида (соответствующие методы описаны в главах 3.8 и 3.9).
После выделения перитонеальных макрофагов надрезали стенку брюшной полости и с помощью пинцета извлекали селезенку. Селезенку освобождали от остатков соединительной ткани и переносили для отмывания в наполненную средой DMEM маленькую чашку Петри. В стеклянном гомогенизаторе (в 3-4 мл среды DMEM) со слабо притертым пестиком селезенку осторожно растирали. Гомогенат аккуратно отбирали пастеровской пипеткой и переносили в стерильные пробирки, помещенные в стакан с кубиками льда. Клетки селезенки осаждали центрифугированием (1,7x10 об/мин, 5 мин) на холоду, один раз отмывали в среде DMEM, а затем для освобождения от эритроцитов обрабатывали гемолитическим раствором (0,85% NH4C1/0,01 М Трис-НС1 9:1 в 0,15 М NaCl, рН 7,2). В растворе для гемолиза клетки селезенки выдерживали 5-7 мин при комнатной температуре, останавливая гемолиз добавлением большого объема среды DMEM. Затем клетки дважды центрифугировали (1,7 103 об/мин, 5 мин) и отмывали большими объемами DMEM. Клеточные суспензии переносили из пробирок в маленькие чашки Петри и выдерживали 2 ч при t=+37C в 5% СОг для освобождения от макрофагов. Неприлипшие клетки, среди которых большую часть составляли лимфоциты, собирали и подсчитывали их концентрацию. Спленоциты подсчитывали в камере Горяева, окрашивая их так же, как и макрофаги. Жизнеспособность клеток обычно превышала 90%. Концентрацию спленоцитов доводили до 1,5x106 клеток/мл и суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей гентамицин, HEPES, 10% ЭТС (Sigma, USA), а затем в объеме 1 мл переносили в лунки 24-луночного планшета для культивирования. Время и условия инкубирования клеток различались в зависимости от того, использовались спленоциты для определения продукции ФНО или секреции интерлейкинов (см. главы 3.8 и ЗЛО).
Приготовление лизатов макрофагов. Перитонеальные макрофаги, выделенные в стерильных условиях, как описано в главе 3.6, и адгезированные к полистиролу 24-луночного планшета, 2 раза отмывали от сопутствующих клеток средой RPMI-1640. Монослой макрофагов каждой лунки ресуспензировали в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, гентамицин, HEPES и 10% ЭТС. Затем макрофаги инкубировали в 24-луночном планшете в течение 24 ч в условиях 37С и 5% СОг. По окончании инкубации клетки лизировали трехкратным замораживанием-оттаиванием и до процедуры измерения концентрации ФНО хранились при t = -20С.
Влияние облучения (42,2 ГГц) на секрецию интерлейкинов (ИЛ-2,ИЛ-3)
Изменения интерлейкин-секреторной активности спленоцитов в зависимости от времени экспозиции представлены на рис. 5.3.1. Для заметного увеличения секреции интерлейкинов, как ИЛ-2, так и ИЛ-3, оказалось достаточно кратковременного, двухчасового облучения мышей. Однако при более продолжительном облучении ш vivo не обнаружено заметных изменений уровней секреции исследованных интерлейкинов. Несмотря на отсутствие достоверных изменений секреции интерлейкинов (ИЛ-2 и ИЛ-3) в другие сроки воздействия (5-96 ч), судя по характеру дозовых кривых, прослеживалась тенденция к немонотонным изменениям секреции этих интерлейкинов.
В последнее время пристальное внимание исследователей вызывает изучение такого важного физиологического мессенджера, способного модулировать иммунный статус организма, как оксид азота. Оксид азота обладает свойствами высоколабильного, короткоживущего реактивного свободного радикала, которые и определяют его как универсальный биологический мессенджер (Болдырев, 1985; Реутов, 1995).
Мы показали достоверное повышение секреции NO активированными макрофагами при однократном облучении мышей с частотой 42,2 ГГц, которое наблюдалось при продолжительности экспозиций в диапазоне от 36 до 96 ч (рис. 5.4). При более кратковременном облучении мышей (от 2 до 24 ч) уровень секреции NO не отличался от контроля.
Интересно отметить, что облучение мышей в течение 48 ч вызывало повышение секреции NO, но приводило к снижению продукции ФИО. Развитие усиленных функций, будь то стимуляция секреции АФК или продукции цитокинов, у макрофагов может происходить многими путями, различными, в некоторых случаях взаимоисключающими: увеличение компетенции в одной функции может сопровождаться угнетением другой (Суслов, 1990). Развитие этих функций жестко контролируется на многих уровнях, поскольку состояние активации макрофагов может быть опасным для организма по ряду причин: 1) приобретение одной усиленной функции может сопровождаться дефицитом других необходимых гомеостатичсских и защитных функций; 2) развиваются мощные деструктивные потенции макрофагов, затрагивающие ткани, органы или организм в целом; 3) гиперпродукция монокинов, обладающих высокоэффективными иммунорегуляторными или гормональными потенциями, может внести диспропорции в осуществление многих биологических функций в организме хозяина (Суслов, 1990). Вполне вероятно, наблюдаемый нами эффект усиления секреции NO на фоне снижения продукции одного из ключевых провоспалительных цитокинов (ФНО) выступает как фактор, компенсирующий ослабление цитотоксической функции макрофагов у животного, подверженного облучению. Примечательно, что в этих условиях облучения (48 ч) обнаружена тенденция к увеличению уровня другого провоспалительного цитокина, ИЛ-2, спленоцитами после 48 ч облучения мышей.
Интересно, что облучение мышей с несущей частотой 42,2 ГГц оказывало существенное влияние на количество иммунокомпетентных клеток, в то время как облучение с несущей частотой 40 ГГц не приводило к изменению структуры лимфоидных органов. Как показано на рисунке 5.5, однократное облучение вызывало значительное опустошение как ткани селезенки, так и перитонеального экссудата. Так, мы установили, что облучение приводило к снижению числа макрофагов после 12, 24 и 48 ч облучения, а спленоцитов - 5, 12 и 72 ч, что указывает на серьезные изменения в морфофункциональной активности исследованных иммунокомпетентных клеток, вызванные облучением. Примечательно, что при облучении мышей с частотой 42,2 ГГц изменения структуры тканей, как и изменения функциональной активности клеток, были немонотонными. Интересно, что наблюдаемое снижение количества клеток коррелировало с увеличением их ФНО-продуцирующей активности. К примеру, облучение в течение 24 ч вызывало резкую стимуляцию продукции ФНО на фоне снижения числа продуцирующих клеток. Таким образом, оказалось, что организм способен отвечать на облучение повышением продукции ФНО как макрофагами, так и спленоцитами даже в условиях потери 30-50% количества клеток. Эти данные могут свидетельствовать о способности AM ЭМИ КВЧ (42,2 ГГц) вызывать серьезные сдвиги в морфофункциональной активности исследованных иммунокомпетентных клеток.
В этой главе описаны результаты воздействия AM ЭМИ КВЧ с частотой 42,2 ГГц в условиях использования принципиально другого способа облучения животных - в режиме ежедневной кратковременной экспозиции. Применение фракционированного облучения в наибольшей степени соответствует условиям использования ЭМИ КВЧ в медицине. В настоящей работе описаны результаты исследования иммуномодулирующих эффектов облучения на животных с острой патологией -мышей с экспериментальными злокачественными опухолями. Мы изучали влияние фракционированного облучения на секреторную активность клеток у четырех групп мышей: 1 - контрольные; 2 - здоровые мыши, облученные AM ЭМИ КВЧ с частотой 42,2 ГГц; 3 - опухоленосители (мыши с привитой карциномой Эрлиха); 4 -опухоленосители, облученные AM ЭМИ КВЧ с частотой 42,2 ГГц. Животных облучали в течение 10, 20 и 30 дней по 1,5 ч ежедневно в утренние часы с 8 ч до 9 ч 30 мин. Для оценки иммуномодулирующих эффектов ЭМИ мы исследовали динамику изменения секреции интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-3) и оксида азота клетками, а также изменения продукции ФНО в клетках и концентрации ФНО в плазме периферической крови. Кроме того, мы определяли динамику изменения количества иммунокомпетентных клеток при облучении и опухолевом росте, а также выживаемость и продолжительность жизни мышей-опухоленосителей.
