Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 8
1.1. Биологическое действие электромагнитного излучения крайне высоких частот 8
1.2. Влияние ЭМИ КВЧ на иммунную систему 19
1.2.1. Иммуномодулирующие эффекты ЭМИ КВЧ при патологии 19
1.2.2. Влияние ЭМИ КВЧ на иммунную систему здорового организма 20
1.3. Физиология иммунных реакций 24
1.3.1. Неспецифические реакции иммунитета 25
1.3.2. Специфические реакции иммунитета 33
1.4. Физиология воспалительных реакций 38
1.4.1. Морфология и патогенез воспаления 39
1.4.2. Клетки, участвующие в воспалении 47
1.4.3. Медиаторы воспаления 54
1.5. Фармакологические препараты в лечении воспалительных процессов 63
1.5.1. Нестероидные противовоспалительные средства 63
1.5.2. Антигистаминные препараты 69
Глава 2. Материалы и методы исследований 73
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 82
3.1. Влияние ЭМИ КВЧ на фагоцитарную активность нейтрофилов как неспецифического звена иммунитета 82
3.1.1. Влияние ЭМИ КВЧ на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови здоровых животных in vivo и in vitro 82
3.1.2. Влияние ЭМИ КВЧ на нейтрофилы периферической крови и очага воспаления животных при индукции воспалительной реакции 85
3.2. Влияние ЭМИ КВЧ на клеточно-опосредованный иммунный ответ 87
3.3. Влияние ЭМИ КВЧ на неспецифическую воспалительную реакцию 91
3.4. Влияние диклофенака натрия на воспалительную реакцию 93
3.4.1. Действие ДН на показатель экссудативного отека и гипертермии 93
3.4.2. Сравнение эффектов ДН и ЭМИ КВЧ 98
3.5. Влияние клемастина на динамику воспалительной реакции 102
Глава 4. Заключение 110
Выводы 113
Список литературы 114
- Влияние ЭМИ КВЧ на иммунную систему здорового организма
- Фармакологические препараты в лечении воспалительных процессов
- Влияние ЭМИ КВЧ на нейтрофилы периферической крови и очага воспаления животных при индукции воспалительной реакции
- Влияние клемастина на динамику воспалительной реакции
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы электромагнитное излучение крайне высоких частот (ЭМИ КВЧ) низкой интенсивности широко применяется в медицинской практике для диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний (Девятков Н.Д. и др., 1991; Rojavin М.А. and Ziskin М.С. 1998; Субботина Т.Н. и Яшин А.А., 1999; Бецкий О.В. и др., 2000е;Pakhomov A.G. and Murphy M.R. 2000). Несмотря на существование ряда гипотез о механизмах действия ЭМИ КВЧ на молекулярном и клеточном уровнях организации живых систем {Девятков Н.Д. и др., 1991; Бецкий О.В. и др., 1994; Бецкий О.В. и др., 1998; Гапеев А.Б. и Чемерис Н.К., 1999; Хадарцев А.А., 1999; Нефедов Е.И. и др., 2005), до сих пор нет целостной концепции, способной с единых позиций объяснить закономерности действия ЭМИ КВЧ на уровне целого организма. Известные на данный момент факты о влиянии низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ на функции органов и систем организма, несмотря на низкую проникающую способность излучения, вызывают интерес все большего количества исследователей к биологическому действию ЭМИ КВЧ.
Анализ собственных и литературных экспериментальных данных дает нам основание полагать, что ЭМИ КВЧ может выступать в качестве иммуномодулирующего фактора. Феноменология изменения состояния иммунной системы при КВЧ-воздействии на организм продемонстрирована в целом ряде работ (Душников К.В. и др., 2002). Показано, что ЭМИ КВЧ способно влиять на функции иммунной системы при патологических состояниях различной этиологии. Так, Logani М.К. et al. (1999) показали усиление клеточно-опосредованного иммунитета у SKH-1 мышей в реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа (ГЗТ). При исследовании воздействия ЭМИ КВЧ на иммунную систему мышей Rojavin М.А. et al. (1997) обнаружили снижение токсического эффекта циклофосфамида на клеточный иммунитет, что выражалось в увеличении фагоцитарной активности (ФА) перитонеальных макрофагов и увеличении Т-клеточной пролиферации. Запорожан В.Н. и др. (1997) показали, что ЭМИ КВЧ способствует устранению сдвигов в иммунной системе, связанных с угнетением отдельных звеньев Т- и В-клеточного иммунитета, снижает исходно повышенную активность протеолитических ферментов, нормализует секрецию женских половых
6 гормонов. В работах {Пославский Т.К. и др., 1989; Припиненая Н.И. и др., 1997) исследовано действие ЭМИ КВЧ на состояние больных с заболеваниями органов пищеварения, отмечено уменьшение воспалительных явлений слизистой, ускорение процесса заживления хронических язв, уменьшение болей и диспептических расстройств, изменение ФА нейтрофилов и моноцитов, рубцевание язвенного дефекта без грубого рубца и пр. Показано, что КВЧ-терапия является фактором, нормализующим иммунный статус больных дерматозами {Зайцева СЮ. и др., 1995). По разным данным ЭМИ КВЧ может изменять титр иммуноглобулинов и количество циркулирующих иммунных комплексов, оказывает влияние на функциональную активность фагоцитов {Хоменко А.Г. и др., 1995). Однако необходимо отметить, что имеющиеся литературные данные носят разрозненный и порой противоречивый характер, что не позволяет с уверенностью выделить конкретные звенья иммунной системы, являющиеся наиболее восприимчивыми к действию ЭМИ КВЧ. До сих пор остается неясной целостная картина действия ЭМИ КВЧ на иммунную систему. Мы предполагаем, что иммуномодулирующее действие ЭМИ КВЧ может лежать в основе реализации терапевтических эффектов излучения на уровне организма.
В связи с вышеизложенным, представляется важным более детально изучить влияние низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ на различные звенья иммунной системы с целью выяснения закономерностей действия излучения на уровне целого организма.
Цели и основные задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании механизмов действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ на реакции неспецифического иммунитета в норме и патологии. Задачи:
1. Исследование влияния ЭМИ КВЧ: а) на фагоцитарную активность нейтрофилов как неспецифического звена иммунитета; б) на клеточно-опосредованный иммунный ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Сравнительное исследование влияния ЭМИ КВЧ, нестероидного противовоспалительного средства (диклофенак натрия) и антигистаминного препарата (клемастин) на неспецифическую воспалительную реакцию у мышей.
Проведение сравнительного анализа эффектов ЭМИ КВЧ и фармакологических препаратов, а также их совместного действия на неспецифическую воспалительную реакцию у мышей.
Научная новизна. Впервые определена динамика развития эффектов ЭМИ КВЧ на фагоцитарную активность нейтрофилов после однократного воздействия in vitro и in vivo. Продемонстрирована зависимость эффектов ЭМИ КВЧ от функционального состояния фагоцитирующих клеток и организма в целом. Показано, что ЭМИ КВЧ подавляет неспецифическое воспаление, а также снижает интенсивность специфического воспаления в реакции ГЗТ. Установлено, что ЭМИ КВЧ оказывает выраженное противовоспалительное действие, сравнимое с действием нестероидного противовоспалительного средства (НПВС) диклофенака натрия (ДН) в модели острого воспаления. Обнаружено, что совместное действие антигистаминного препарата клемастина (КМ) и ЭМИ КВЧ дозозависимым образом отменяет противовоспалительный эффект ЭМИ КВЧ. Полученные результаты дают основание полагать, что в реализации противовоспалительного действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ задействованы метаболиты арахидоновой кислоты и гистамин.
Научно-практическая ценность. Результаты работы дают объяснение эффективному использованию ЭМИ КВЧ при лечении заболеваний, в патогенезе которых отмечаются выраженные воспалительные процессы (язвенные болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, гепатиты, холецистопанкреатиты, невриты, радикулит, остеохондроз, пиелонефрит, простатит, нейродермиты, раны, ожоги и т.д.). Наши данные вносят существенный вклад в научное обоснование применения ЭМИ КВЧ в медицинской практике, а также углубляют фундаментальное понимание механизмов действия ЭМИ КВЧ на биологические объекты.
Влияние ЭМИ КВЧ на иммунную систему здорового организма
В последнее время, в дополнение к ставшим классическими представлениям о нормализующем действии ЭМИ КВЧ (при облучении организма в состоянии патологии), появились данные о реакциях здорового организма на КВЧ воздействие. Отмечаются определенные изменения и в состоянии иммунной системы. Так, в исследованиях на интактных мышах было показано, что ЭМИ КВЧ (41.95 ГГц, 150 мкВт/см2, животных облучали в дальней зоне рупорной антенны в течение 20 мин) подавляло фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови. Уже через 3 ч после тотального (имеется в виду облучение всего животного, а не отдельных участков тела) 20-минутного облучения животных значительно снижался процент фагоцитоза (Гапеев А.Б. и др., 2000; Коломыцева М.П. и др., 2002). Эффект сохранялся в течение суток после воздействия, возвращение ФА к норме происходило в течение 3 сут. Изменение лейкоцитарного профиля крови облученных животных (5 сут) наблюдалось после прекращения воздействия: количество лейкоцитов возрастало в основном за счет увеличения лимфоцитарной массы. Авторы отмечают, что под действием ЭМИ КВЧ не изменяется количество Fc-рецепторов нейтрофилов и содержание опсонинов, т.к. количество адгезированных к поверхности фагоцитов , бактериальных клеток не изменялось по сравнению с контролем. Также было обнаружено, что при действии излучения происходили изменения в популяционном составе нейтрофилов крови, а именно увеличение доли : сегментоядерных нейтрофилов (Гапеев А.Б. и др., 2000; Коломыцева М.П. и др., 2002). Существуют данные о том, что резидентные перитонеальные макрофаги здоровых облученных ЭМИ КВЧ (61.22 ГГц, 15 мВт/см2, 20 мин/сут в течение 3 сут) мышей не чувствительны к данному воздействию (Rojavin М.А. et al, 1997). Облучение здоровых животных ЭМИ КВЧ (42.2 ГГц, модуляция 60 Гц, 31 мВт/см2, 30 мин) не влияло на активацию, пролиферацию и эффекторную функцию Т-лимфоцитов (Makar V. et. al, 2003).
При исследовании влияния ЭМИ КВЧ (53.6 ГГц, 15.3 мВт/см2, 30 мин/сут, 3 сут) на клеточно-опосредованный иммунитет интактных мышей показано, что под действием излучения заметно увеличивается выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (Logani М.К. et al, 1999). Однако при использовании частоты излучения 42.2 ГГц при аналогичных условиях продемонстрировано отсутствие эффекта излучения с ППМ 13.5 мВт/см и наличие эффекта при ППМ 43.1 мВт/см2 {Logani М.К. et al, 1999). Авторы объясняют обнаруженный эффект возможным увеличением интенсивности кровотока при воздействии облучения, а также изменением цитокинового профиля в месте введения антигена.
Вышеприведенные данные о реакции здорового организма на ЭМИ КВЧ дополняют представление о так называемом адаптогенном (тренирующем организм) действии излучения (Девятков Н.Д. и др., 1991). Показано, что предварительное облучение лабораторных мышей ЭМИ КВЧ (42.19±0.15 ГГц, 15-17 мВт/см , 25 мин/сут) перед у-облучением (6.5 Гр) повышает выживаемость животных в 2 раза и увеличивает среднюю продолжительность жизни в 1.5 раза (Сазонов А.Ю., Рыжкова Л.В., 1995). Предварительное КВЧ-облучение было эффективным для предотвращения развития гриппозной инфекции (вирус А/Бетезда/10/63 (H2N2)). У животных, облученных до заражения, увеличивалась степень выживаемости и средняя продолжительность жизни, причем наибольший эффект был получен при длительном периоде воздействий (17 сут) (Сазонов А.Ю. и Рыжкова Л.В., 1995; Рыжкова Л.В. и др., 1991).
При исследовании действия ЭМИ КВЧ (42.0 ГГц, 150 мкВт/см2, 20 мин) на выраженность гуморального иммунного ответа после иммунизации мышей эритроцитами барана существенных отличий между опытной и контрольной группами животных по количеству АОК в селезенке, ТГА, клеточности лимфоидных органов отмечено не было (Лушников К.В. и др., 2001). Однако в случае длительного периода КВЧ-воздействий до иммунизации (41.95 ГГц, 150 мкВт/см , 20 сут по 20 мин/сут) было обнаружено достоверное снижение клеточности селезенки и тимуса на 15 и 17% соответственно, что указывает на способность излучения влиять на процессы иммуногенеза. Обнаружено также, что при длительной серии воздействий ЭМИ КВЧ до иммунизации опытная группа животных четко разделяется на две, различающиеся по количеству АОК в селезенке, что указывает на разную степень восприятия ЭМИ КВЧ различными особями (Лушников К.В. и др., 2001; Лушников К.В. и др., 2002).
В работе (Новоселова Е.Г. и др., 2002) показано стимулирующее действие ЭМИ КВЧ (42.2 ГГц, амплитудная модуляция 10 Гц, 0.5 мкВт/см2, 1.5 ч/сут, 10, 20, 30 сут) на иммунокомпетентные клетки и угнетение клеточного иммунитета в зависимости от длительности фракционированного воздействия. При облучении мышей в течение 10 и 20 сут происходила стимуляция продукции ФНО и увеличение его в плазме, тогда как при воздействии в течение 30 сут такого эффекта отмечено не было. Наблюдалось увеличение пролиферации В-клеток (20 и 30 сут экспозиции), реакции бласттрансформации Т-клеток (10 и 30 сут экспозиции), продукции NO (10 сут воздействия) и в тоже самое время тенденция к снижению активности NK-клеток, снижение количества Т- и В-лимфоцитов селезенки, снижение продукции NO по мере увеличения продолжительности воздействия.
После действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ (42.0 ГГц) наблюдалась дегрануляция тучных клеток кожи крысы, причем тех, которые являются наиболее зрелыми и/или содержат наибольшее количество гранул {Попов В.И. и др., 2001). Важно отметить, что ЭМИ КВЧ, вызывая дегрануляцию тучных клеток, не влияло на структуру миелина, а также не было выявлено качественных изменений непосредственно в самом эпидермисе и дерме. Авторы говорят о возможности использования факта дегрануляции в качестве критерия оценки эффекта излучения даже при условии нетепловых интенсивностей ЭМИ КВЧ.
Таким образом, интактный организм, не находящийся в патологическом состоянии, способен реагировать на действие ЭМИ КВЧ. Наблюдаемый кумулятивный эффект излучения позволяет сделать предположение о наличии в организме определенных механизмов хранения информации о КВЧ-воздействии. С этой точки зрения можно объяснить подготавливающее (тренирующее) действие ЭМИ КВЧ.
Итак, анализ литературных данных показывает, что в настоящее время экспериментальные результаты по влиянию ЭМИ КВЧ на иммунную систему в норме и при различных патологических состояниях слабо поддаются систематизации из-за их разрозненности и противоречивости. Следует отметить, что до сих пор не было предпринято систематического исследования действия ЭМИ КВЧ на состояние иммунной системы, не выявлены наиболее чувствительные звенья иммунной системы к действию низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ. Настоящая работа является продолжением исследований, проводимых в лаборатории Регуляции в биомедицинских системах Института биофизики клетки РАН по изучению иммуномодулирующих эффектов низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ. В работе проведено исследование влияния ЭМИ КВЧ на неспецифическую резистентность (фагоцитарную активность нейтрофилов) и клеточно-опосредованные реакции иммунитета (ГЗТ). Предпринята попытка оценить чувствительность выбранных иммунных реакций к действию излучения в норме и при воспалительном процессе. Исследовано действие ЭМИ КВЧ на острую неспецифическую воспалительную реакцию и проведен сравнительный анализ противовоспалительных эффектов ЭМИ КВЧ и известных лекарственных препаратов с целью выяснения механизмов реализации эффектов излучения.
Для обсуждения иммуномодулирующего действия ЭМИ КВЧ далее необходимо рассмотреть строение и основные принципы организации иммунной системы, а также ее роль в процессах жизнедеятельности организма.
Фармакологические препараты в лечении воспалительных процессов
НПВС представляют собой обширную и разнообразную по химическому строению группу лекарственных средств, широко применяющихся в клинической практике. В настоящее время имеется большой арсенал НПВС (более наименований), а в практической медицине используется для лечения более 1000 созданных на их основе лекарственных средств. Широкое использование НПВС объясняется тем, что они обладают противовоспалительным, анальгезирующим и жаропонижающим эффектами и приносят облегчение больным с соответствующими симптомами (воспаление, боль, лихорадка), которые отмечаются при многих заболеваниях (Vane J. andBottingR.M., 2003). В действии НПВС выделяют следующие узловые звенья: 1. Мембраностабилизирующее действие, предупреждение повреждения клеточных структур (в частности лизосом), уменьшение проницаемости капилляров, наиболее отчетливо ограничивающее экссудативные проявления воспалительного процесса (торможение перекисного окисления липидов, стабилизация лизосомальных мембран, препятствующая выходу в цитоплазму и во внеклеточное пространство лизосомальных гидролаз, способных разрушать протеогликаны, коллаген, хрящевую ткань). 2.
Снижение энергообеспечения воспалительной реакции путем снижения интенсивности биологического окисления, фосфорилирования и гликолиза, что приводит к торможению выработки макроэргов. Кроме того, влияние на тканевое дыхание и гликолиз изменяет пластический обмен, т.к. промежуточные продукты окисления и гликолитических превращений субстратов служат строительным материалом для различных синтетических реакций (например, биосинтез кининов, мукополисахаридов, иммуноглобулинов). 3. Торможение синтеза или инактивация медиаторов воспаления (гистамин, серотонин, брадикинин, лимфокины, простагландины, факторы комплемента и другие неспецифические эндогенные повреждающие факторы). 4. Модификация субстрата воспаления, т.е. некоторое изменение молекулярной конфигурации тканевых компонентов, препятствующее вступлению их в реакцию с повреждающими факторами. 5. Цитостатическое действие, приводящее к торможению пролиферативной фазы воспаления и уменьшению поствоспалителыюй фазы склеротического процесса. 6. Тормозящее влияние на гемокоагуляцию (прежде всего на угнетение агрегации тромбоцитов), оказывается дополнительным, вторичным фактором противовоспалительного эффекта: уменьшение интенсивности свертывания в капиллярах воспаленных областей препятствует нарушению микроциркуляции. Несомненно, наиболее важным механизмом действия НПВС является способность ингибировать ЦОГ - фермент, катализирующий превращение свободных полиненасыщенных жирных кислот (АК) в простагландины и тромбоксаны .
В последние годы значительное развитие получили исследования влияния НПВС на клеточные механизмы воспалительной реакции. НПВС уменьшают миграцию клеток в очаг воспаления и снижают их флогогенную активность, причем влияние на ПМЯЛ коррелирует с угнетением липооксигеназного пути окисления АК. Этот путь превращения АК ведет к образованию ЛТ, которые соответствуют всем критериям медиаторов воспаления. Основные эффекты НПВС Противовоспалительный эффект. Выраженность противовоспалительных свойств НПВС коррелирует со степенью ингибирования ЦОГ. Противовоспалительное действие НПВС обусловлено ингибированием ЦОГ-2, а их нежелательные реакции - ингибированием ЦОГ-1 {Vane J. et ah, 1998). Соотношение активности НПВС в плане блокирования ЦОГ-1/ЦОГ-2 позволяет судить об их потенциальной токсичности. Чем меньше эта величина, тем более селективен препарат в отношении ЦОГ-2 и, тем самым, менее токсичен. НПВС подавляют преимущественно фазу экссудации. Наиболее мощные препараты -индометацин, диклофенак (ДН), фенилбутазон - действуют также на фазу пролиферации (уменьшая синтез коллагена и связанное с этим склерозирование тканей), но слабее, чем на экссудативную фазу. На фазу альтерации НПВС практически не влияют. По противовоспалительной активности НПВС уступают глюкокортикоидам, которые, ингибируя фермент ФЛА2, тормозят метаболизм фосфолипидов и нарушают образование как ПГ, так и ЛТ, также являющихся важнейшими медиаторами воспаления. Важную роль в противовоспалительном действии НПВС играет их влияние на метаболизм и биоэффекты кининов. В терапевтических дозах индометацин, ортофен, напроксен, ибупрофен, ацетилсалициловая кислота на 70-80% снижают образование брадикинина посредством неспецифического ингибирования взаимодействия калликреина с ВМК. НПВС способны блокировать взаимодействие брадикинина с тканевыми рецепторами, что приводит к восстановлению нарушенной микроциркуляции, уменьшению перерастяжения капилляров, снижению выхода белков плазмы, провоспалительных факторов и форменных элементов. Поскольку ККС играет наиболее важную роль в развитии острых ВР, то и наибольшая эффективность НПВС отмечается в ранних стадиях воспаления при наличии выраженного экссудативного компонента. Определенное значение в механизме противовоспалительного действия НПВС имеют ингибирование освобождения гистамина и серотонина. Предполагается конкурентное взаимодействие некоторых НПВС (бутадиоп) с рецепторами или ферментными системами, участвующими в процессах синтеза, высвобождения и превращения указанных веществ, в силу близких значений внутримолекулярного расстояния между реакционными центрами в молекуле антифлогистиков молекуле медиаторов воспаления (гистамина, серотонина). Анальгезирующий эффект. Механизм анальгетического действия складывается из нескольких компонентов. Некоторые ПГ (ПГЕ2 и nrF2a) могут повышать чувствительность болевых рецепторов к физическим и химическим стимуляторам, например, к действию брадикинина, который, в свою очередь, способствует высвобождению ПГ из тканей (Steinmeyer J., 2000). Таким образом, происходит взаимное усиление альгогенного действия. НПВС, блокируя синтез ПГЕ2 и nrF2a, в сочетании с прямым антибрадикининовым действием, препятствуют проявлению альгогенного эффекта. НПВС, блокируя экссудацию, стабилизируя мембраны лизосом, опосредованно снижают число чувствительных к химическим раздражителям рецепторов. НПВС, воздействуя на таламические центры болевой чувствительности (локальная блокировка ПГЕ2, F2a в ЦНС), способствуют торможению проведения болевых импульсов к коре. Анальгетическая активность ДН, индометацина в отношении воспаленных тканей не уступает активности наркотических анальгетиков.
Влияние ЭМИ КВЧ на нейтрофилы периферической крови и очага воспаления животных при индукции воспалительной реакции
С целью оценки фагоцитарного потенциала нейтрофилов при облучении животных ЭМИ КВЧ на фоне воспалительного процесса исследовали ФА нейтрофилов периферической крови и очага воспаления. Воспалительную реакцию вызывали интраперитонеалыюй инъекцией зимозана. Определяли фоновую ФА нейтрофилов периферической крови до индукции ВР зимозаном и ФА нейтрофилов периферической крови через 1 ч после облучения во время развития ВР (облучение проводили через 3 ч после инъекции зимозана).
Было обнаружено, что облучение ЭМИ КВЧ или его имитация на фоне ВР не изменяло ФА нейтрофилов периферической крови (табл.1). При оценке эффекта ЭМИ КВЧ на ФА перитонеальных нейтрофилов было выявлено, что у животных опытной и контрольной групп ФА нейтрофилов при постановке реакции фагоцитоза в среде смыва также не отличалась (табл.1). После отмывания перитонеальных клеток контрольных животных от белков воспалительного экссудата нами также не было отмечено достоверного изменения ФА относительно неотмытых клеток. Однако у животных опытной группы нами обнаружено, что показатель ФА нейтрофилов, отмытых от белков перитонеального экссудата, достоверно снижается на 13.7+4.5% (р 0.05) по сравнению с показателем ФА перитонеальных нейтрофилов контрольных животных (Рис. 9).
Таким образом, при облучении ЭМИ КВЧ интактных животных обнаруживается снижение ФА нейтрофилов периферической крови, а под действием ЭМИ КВЧ на фоне ВР снижение ФА проявляется после отмывания перитонеальных нейтрофилов от белков воспалительного экссудата (Лушников К.В. и др., 2003). Эти результаты свидетельствуют о том, что облучение животных ЭМИ КВЧ в норме и на фоне ВР изменяет функциональную активность нейтрофилов, что, вероятно, связано с влиянием на сигнальные системы этих клеток (Лушников К.В. и др., 2004). На основании полученных данных можно заключить, что неспецифическое звено иммунитета интактных мышей является чувствительным к действию ЭМИ КВЧ.
Для оценки влияния ЭМИ КВЧ на адаптивный клеточно-опосредованный иммунный ответ интактных животных мы выбрали модель иммунного ответа по типу реакции ГЗТ. Проводили сенсибилизацию животных антигеном (эритроциты барана) и через 1 ч животных опытной группы облучали ЭМИ КВЧ по 20 мин в сутки в течение 5 сут до разрешающей инъекции антигена. Для животных контрольной группы проводили процедуры имитации воздействия. По истечении 4 сут вводили разрешающую дозу антигена.
В наших экспериментах отличия между контрольной и опытной группами животных проявились уже на этапе, предшествующем разрешающей инъекции антигена. Так, подкожное введение ЭБ (сенсибилизирующая инъекция) вызывало локальную неспецифическую воспалительную реакцию левой конечности.
На 3-4 сут после сенсибилизирующей инъекции у контрольных животных нами было зарегистрировано достоверное увеличение толщины левой стопы. ИВ увеличивался в среднем до 6.2+2.1%, в то время как у облученных животных ВР была практически полностью подавлена - ИВ был равен 0.5±1.2%, что достоверно (р 0.0\) отличалось от контрольной группы. Через 24 ч после разрешающей инъекции у облученных животных ИВ увеличивался до 15±3%, что было достоверно (р 0.05) меньше по сравнению с контрольными животными, у которых ИВ был равен в среднем 22±2% (Рис. 10). Через 48 ч развития ГЗТ отек спадал и ИВ как в опытной, так и в контрольной группах животных был одинаков и составлял около 6.5% {Танеев А.Б. и др., 2002; Пушников К.В. и др., 2003).
Таким образом, наши результаты демонстрируют, что ЭМИ КВЧ практически полностью подавляет неспецифическое воспаление - на 92±19% по отношению к контролю (Рис. ПА). Специфическое воспаление снижается под действием ЭМИ КВЧ на 30±12% по отношению к контролю (Рис. 11Б). Это может быть обусловлено более сложными механизмами реализации специфической ВР, в которую включены кроме фагоцитирующих клеток еще и Т-эффекторы ГЗТ (Яршии А.А., 1999).
Известно, что развитие неспецифического воспаления опосредуется, главным образом, фагоцитирующими клетками (Маянскш А.Н. и Маянский Д.Н., 1983; Роит А. и др., 2000). Выше мы показали, что ЭМИ КВЧ снижает активность фагоцитирующих клеток. Поэтому мы предполагаем, что наблюдаемый эффект подавления неспецифического воспаления при действии ЭМИ КВЧ также обусловлен снижением функциональной активности фагоцитов. Поскольку основными эффекторными клетками, участвующими в развитии реакции ГЗТ, наряду с Т-эффекторами ГЗТ, являются макрофаги, снижение интенсивности специфического воспаления в наших условиях тоже может происходить за счет снижения функциональной активности фагоцитирующих клеток. Однако это утверждение требует дальнейшей экспериментальной проверки.
Можно предложить следующие механизмы реализации этих эффектов. При тотальном воздействии на организм ЭМИ КВЧ, вызывая реакцию со стороны нервной и нейрогуморальной систем, способно изменять содержание биологически активных веществ в плазме крови {Душников КВ. и др., 2002). Отсутствие эффектов ЭМИ КВЧ на гуморальный иммунный ответ {Душников КВ. и др., 2001) позволяет считать, что эти регуляторные вещества избирательно действуют на Т-клеточное звено иммунной системы. Можно предположить, что такими веществами являются гормоны тимуса, которые могут содержаться/производиться в коже, имеющей сходство с эпителием тимуса по данным {Хлыстова З.С. и др., 1994). Кожа является органом, в первую очередь воспринимающим действие ЭМИ КВЧ. Возможность изменения синтеза гормонов тимуса при действии физических факторов показана в работе {Кончугова Т.В. и др., 1996). Обнаружено, что инфракрасное
низкоэнергетическое лазерное излучение влияет на выработку тимических гормонов тимоцитами и эпителиальными клетками тимуса при действии in vitro. В работе показано, что локальное воздействие инфракрасным (ИК) низкоэнергитическим лазерным излучением на область тимуса и щитовидной железы стимулирует выработку осгтимозина у здоровых крыс и восстанавливает его концентрацию до нормальных значений у стрессированных животных. Вместе с тем снижается титр тимической активности сыворотки, трактуемый как показатель уровня тимулина. При облучении импульсным ИК низкоэнергитическим лазерным излучением эпителиоцитов тимуса человека линии HTSC in vitro выявлено отчетливое стимулирующее действие на выработку артимозина. Сопоставляя вышеперечисленные данные и принимая во внимание определенное сходство эпителиев тимуса и кожи, мы предполагаем, что ЭМИ КВЧ подобно ИК низкоэнергетическому лазерному излучению может модифицировать состояние иммунной системы через изменение синтеза/содержания тимических гормонов в коже. Тимические гормоны осуществляют свое специфическое действие аутокринным или паракринным путем, влияя на дифференцировку Т-клеток, увеличивая количество Т-супрессоров или цитотоксических Т-клеток, восстанавливая реактивность Т-клеток, влияя на гемопоэтические клетки и т.д.
Влияние клемастина на динамику воспалительной реакции
Ранее с использованием методов световой и электронной микроскопии было показано, что локальное воздействие низкоинтенсивным ЭМИ КВЧ (42.0 ГГц, 0.05 мВт/см , 20 мин) на подушечку лапы крысы приводит к дегрануляции тучных клеток дермы (Попов и др., 2001). На основании этих данных мы предположили, что в реализации биологического действия ЭМИ КВЧ могут участвовать компоненты содержимого гранул тучных клеток, в частности, гистамии. Для оценки роли гистамина в реализации противовоспалительных эффектов ЭМИ КВЧ в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние антигистаминного препарата КМ и совместное действие КМ и ЭМИ КВЧ в условиях нашей модели острого воспаления.
В условиях нашей модели острого асептического воспаления КМ в диапазоне доз 0.02-0.4 мг/кг не оказывал значимых эффектов на величину экссудативного отека (Табл.4). Это находится в согласии с литературными данными о влиянии клемастина на зимозан-индуцированное воспаление у мышей (Erdo F. et. ah, 1993). Доза KM 0.6 мг/кг, которая почти в 2 раза превышает рекомендуемую суточную терапевтическую дозу, вызывала достоверное снижение величины экссудативного отека на 14-22% на 5-8 ч развития воспалительной реакции (Табл.4). Этот эффект, вероятно, обусловлен влиянием клемастина на активность нейтрофилов, а не с противоотечным действием препарата на уровне эндотелия. Имеются данные о том, что Нр антигистамины, в том числе и КМ, в больших концентрациях (1С5о около 20 мкМ) ингибируют активность нейтрофилов, в частности, снижают продукцию активных форм кислорода, выход арахидоновой кислоты и образование лейкотриенов (Taniguchi К. et. ah, 1991). Ингибирующий эффект КМ на уровень лейкоцитарной инфильтрации и активации клеток воспаления может быть также связан со способностью Hi-антигистаминных препаратов снижать активность фактора транскрипции NF-кВ С последующим снижением уровня экспрессии молекул клеточной адгезии и синтеза провоспалительных медиаторов (Ваккег R.A. et. ah, 2001).
При исследовании влияния клемастина на уровень гипертермии воспаленной конечности было обнаружено дозозависимое увеличение гипертермии в диапазоне доз КМ 0.02-0.2 мг/кг. Этот эффект имел явно выраженный максимум на 4-7 ч развития воспалительной реакции (Табл.5). Напротив, КМ в дозах 0.4 и 0.6 мг/кг не оказывал влияния на гипертермию.
Мы рассчитали величину эффекта КМ, усредненную в интервале 3-8 ч развития воспалительной реакции и выраженную в процентах от контроля (Рис. 16). Такое представление результатов наглядно показывает дозозависимое снижение величины экссудативного отека (Рис.ІбА) при действии КМ и дозозависимое увеличение гипертермии в диапазоне доз КМ 0.02-0.2 мг/кг (РисЛбБ). Однако достоверные отличия от контроля наблюдаются только при действии КМ в дозе 0.6 мг/кг, снижающей величину отека на 16.5±3.2% (рО.001), и в дозе 0.2 мг/кг, увеличивающей гипертермию воспаленной конечности на 17.8±5.5% (р 0.03). Таким образом, полученные данные указывают на то, что механизмы действия КМ в малых и больших дозах могут существенно различаться.
Совместное действие КМ и ЭМИ КВЧ на динамику воспалительной реакции. При исследовании совместного действия КМ и ЭМИ КВЧ мы обнаружили выраженное взаимное влияние этих двух факторов. С одной стороны, КМ дозозависимым образом снимал противовоспалительный эффект ЭМИ КВЧ (Рис. 16). При использовании КМ в дозах 0.2-0.6 мг/кг эффект ЭМИ КВЧ как относительно отека, так и относительно гипертермии практически полностью отменен. С другой стороны, совместное действие КМ и ЭМИ КВЧ отменяет повышение температуры, которое вызывали малые дозы КМ (РисЛбБ).
На основании литературных данных о дегрануляции тучных клеток дермы после воздействия низкоинтенсивным ЭМИ КВЧ {Попов В.И. и др., 2001) можно предположить, что реакция тучных клеток кожи может быть важным усилительным механизмом в цепочке событий, ведущих к системному отклику организма на воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения. Известно, что биологически активные вещества, синтезируемые в тучных клетках, играют ключевую роль во многих воспалительных и иммунных процессах. Гистамин является одним из основных компонентов содержимого гранул тучных клеток. Итак, рассмотрим полученные нами результаты, учитывая, что облучение низкоинтенсивным ЭМИ КВЧ приводит к выбросу гистамина из тучных клеток кожи {Попов В.И. и др., 2001), и опираясь на литературные данные о биологических эффектах гистамина.
Гистамин считается классическим провоспалительным агентом {Гущин И.С, 1998). На сегодняшний день известно, что основные физиологические эффекты гистамина обусловлены его взаимодействием с Нь Н2, Н3 и Н4 типами клеточных рецепторов. Наиболее широко исследованы эффекты гистамина, которые реализуются через Hi и Нг-рецепторы, ответственные за изменение проницаемости сосудов, уровня циклических нуклеотидов, хемокинезиса и хемотаксиса нейтрофилов и эозинофилов, гастроинтестинальной секреции, сокращения гладкой мускулатуры и др. {Marquardt D.L., 1983). В частности показано, что через Hj-рецепторы гистамин повышает активность нейтрофилов, что отражается в усиленной способности продуцировать АФК в ответ на стимул {Benbarek Н. et al, 1999). В очаге воспаления гистамин через Н) и Нг-рецепторы влияет на клетки эндотелия, в результате чего повышается степень адгезии нейтрофилов к стенке сосудов в кровяном русле, что способствует ускоренному накоплению нейтрофилов в очаге воспаления {Schaefer U. et. al, 1998). Однако в целом ряде работ было показано, что гистамин через Н2-рецепторы ингибирует способность нейтрофилов продуцировать АФК в ответ на различные стимулы {Burde R. et. al, 1989; Ching T.L. et. al, 1995; Mellqvist U.H. et. al, 2000; Betten A. et. al, 2003), ингибирует хемотаксис нейтрофилов и моноцитов {Rabier М. et. al, 1989; Radermecker M.F. et al, 1989; Bury T.B. et. al, 1992а; Bury T.B. et al, 1992b), снижает нейтрофильную инфильтрацию {Kheifets J. et. al, 1986, Hirasawa N. et. al, 2002). Т.е. ингибируїощие эффекты гистамина реализуются в основном через Н2-рецепторы и проявляются в подавлении функциональной активности нейтрофилов, снижении эксперессии молекул клеточной адгезии на моноцитах и секреции цитокинов. Показано также, что гистамин в больших концентрациях обладает проапоптотической активностью в отношении нейтрофилов (Hur J. et al, 2003).
Выраженное противовоспалительное действие гистамина было показано с использованием генетически модифицированных мышей с "нокаутом" гена гистидинкарбоксилазы, единственного фермента, производящего гистамин в организме (Hirasawa N. et. al, 2002; Hori Y. et al, 2002). У таких животных BP развивается значительно быстрее по сравнению с нормальными животными, происходит усиленный приток нейтрофилов в очаг воспаления - искусственный "кожный карман" на спине мышей (Hirasawa N. et. al, 2002), перитонеальная полость (Hori Y. et al, 2002). Добавление агонистов Hj и H2 рецепторов, имитирующих действие гистамина, приводило к ухудшению клиренса Е. coli из перитонеальной полости {Hori Y. et al, 2002), что свидетельствует о снижении фагоцитарной активности пула фагоцитов в очаге воспаления либо за счет их недостаточного количества, либо за счет снижения их функциональной активности. Снижение лейкоцитарной инфильтрации было зафиксировано и при непосредственном добавлении гистамина к вводимому в искусственный "карман" на спине мышей антигену (Hirasawa N. et. al, 2002). Таким образом, активация Hj и Н2 рецепторов на нейтрофилах приводит к ингибированию их фагоцитарной активности и снижению нейтрофильной инфильтрации в области воспаления. В то же время у нормальных мышей антагонисты Н\ и Н2 рецепторов, наоборот, усиливали клиренс Е. coli из перитонеальной полости (Hori Y. et al, 2002).
