Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные свойства белковых молекул 10
1.1. Состав и строение белков 10
1.2. Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля 14
1.3. Основные белки сыворотки крови 17
Глава 2. Рассеяние света в растворах биополимеров 21
2.1. Метод статического светорассеяния 21
2.1.1. Основные положения теории рассеяния света 21
2.1.2. Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц 30
2.2. Метод динамического светорассеяния 33
2.2.1. Теоретические основы метода динамического рассеяния света 33
2.2.2. Теория Джеймса-Эванса 38
Глава 3. Трехкомпонентные лиотропные системы (Обзор литературных данных) 39
3.1. Поведение коэффициента межмолекулярного взаимодействия в трехкомпонентных растворах. Теория Скэтчарда 39
3.2. Исследование рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы 41
Глава 4. Экспериментальное исследование водных растворов белков методами статического и динамического светорассеяния 51
4.1. Объекты исследования и подготовка образцов 51
4.2. Создание моделей сыворотки крови 54
4.3. Описание экспериментальной установки 55
4.4. Результаты экспериментального исследования водных растворов белков методом интегрального светорассеяния... 61
4.5. Описание и калибровка фотонно-корреляционного спектрометра 68
4.6. Результаты экспериментального исследования оптических параметров белков методом динамического рассеяния света. 69
4.7. Результаты исследования смеси белков альбумина и -у-глобулина при их различных массовых соотношениях 72
4.8. Обсуждение результатов и выводы главы 4 78
Глава 5. Использование методов статического и динамического светорассеяния для диагностики онкологических и сосудистых заболеваний 82
5.1. Метод диагностики онкологических заболеваний, основанный на статическом рассеянии света 82
5.2. Сравнительное исследование параметров белков плазмы и сыворотки крови здоровых пациентов и онкологических больных 91
5.3. Методы получения образцов сыворотки крови животных с искусственно вызванной сосудистой патологией 93
5.4. Сравнительные результаты экспериментов с сывороткой крови животных с искусственно вызванной ишемией 98
5.5. Результаты экспериментов с сывороткой крови крыс при искусственно вызванном геморрагическом инсульте 102
5.6. Обсуждение результатов и выводы главы 5 104
Заключение 105
Литература 106
- Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля
- Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц
- Исследование рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы
- Результаты исследования смеси белков альбумина и -у-глобулина при их различных массовых соотношениях
Введение к работе
Белки - высокомолекулярные природные органические вещества, играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также оценка влияния внешних факторов на белковые системы представляет собой огромный интерес для современной медицинской биофизики, молекулярной физики и экологии.
Макромолекулы белков и биополимеров являются уникальными для исследования с помощью методов молекулярной оптики, поскольку масса белковой макромолекулы строго определена для каждого типа белка, при этом поверхность белковой молекулы имеет определенную величину заряда, которую можно изменять путем изменения рН раствора. Кроме того, молекулы белков обладают высокими значениями дипольного момента порядка несколько сотен Дебай (D).
Актуальность темы исследования связана с тем, что белки в виде водных растворов присутствуют во всех живых организмах, определяя многие жизненно важные функции. Развитие патологических процессов в организме, таких как сердечно-сосудистые и онкологические заболевания сопровождается изменениями ряда молекулярных параметров в клетках, тканях, а также в сыворотке крови. Поэтому исследование поведения белковых макромолекул в растворах, которые при определенных условиях могут быть использованы в качестве моделей сыворотки крови или лимфы, является очень важным для понимания процессов, происходящих в живых организмах.
Решающую роль в успешном лечении распространенных заболеваний и, прежде всего, сердечно-сосудистых и онкологических играет их ранняя диагностика. В последние годы для этих целей применяется сложная дорогостоящая аппаратура типа ЯМР - томографа. К сожалению, такая уникальная аппаратура, имеющаяся в единичных экземплярах в наиболее крупных медицинских центрах, не может обеспечить массовую профилактическую диагностику заболеваний на ранних стадиях их развития. Поэтому создание достаточно простых, недорогих, но эффективных диагностических методов остается актуальной проблемой практической массовой медицины. Совершенно очевидно, что успешная разработка новых физических методов диагностики распространенных заболеваний зависит от понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе данного заболевания.
Металлы необходимы для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Более 5% веса человеческого тела составляют натрий, калий, кальций и магний. Другие металлы, такие как железо, кобальт, медь, молибден, цинк и др., присутствуют в организме в связанном состоянии (гемоглобин, ферменты), а их содержание составляет менее 1% веса тела [8,12,13,24]. Тем не менее, превышение допустимой концентрации металлов в окружающей среде создает серьезную угрозу здоровью человека. Особенно опасны тяжелые металлы (ТМ). Попадая в кровь и другие биологические жидкости, они даже в небольших концентрациях способны серьезно нарушить нормальное течение физиологических процессов в организме.
Сравнительно недавно в работах [76,77,78,79,81] было обнаружено новое явление - образование наночастиц - молекулярных кластеров в растворах белков в присутствии солей тяжелых металлов. Детальное исследование взаимодействия ионов металлов с белками в растворе показало общность механизмов образования макромолекулярных кластеров при развитии онкологического заболевания и при наличии ионов тяжелых металлов в растворе.
Основной целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в растворах белков сыворотки крови при воздействии различных параметров методами статического и динамического рассеяния света, а также проверка возможности использования этих методов для диагностики онкологических и сердечнососудистых заболеваний.
Исходя из общей цели, в диссертации ставился ряд практических задач:
- иследование растворов макромолекул белков при изменении ряда физико-химических параметров среды, в том числе при взаимодействии с ионами легких и тяжелых металлов с помощью методов статического и динамического светорассеяния;
- исследование водных растворов белков в качестве модели сыворотки крови методами светорассеяния;
- использование метода статического рассеяния света для диагностики онкологических заболеваний;
- исследование растворов сыворотки крови крыс в норме и при искусственно вызванной ишемии мозга;
- исследование молекулярных параметров сыворотки крови крыс при искусственно вызванном геморрагическом инсульте.
Существует большое число физических методов исследования как коллективных форм теплового молекулярного движения, так и динамики отдельных молекул или их фрагментов. Ультразвуковая спектроскопия, ядерный магнитный резонанс, рассеяние медленных нейтронов, спектроскопия диэлектрической релаксации, а также оптические методы -рэлеевское и комбинационное рассеяние света, люминесцентная спектроскопия, - позволяют получать сведения о взаимодействиях и движениях молекул в конденсированных средах.
В рамках преследуемых в работе целей наиболее информативным и удобным для решения поставленных задач является метод интегрального рэлеевского рассеяния света. С помощью этого метода определялись массы и поляризационные свойства рассеивающих частиц, исследовался характер межмолекулярного взаимодействия при изменении концентрации ионов металлов в растворе и зарядовых свойств поверхности белковой молекулы. Научная новизна диссертации обусловлена рядом экспериментальных результатов, впервые полученных в данной работе:
1. С помощью методов статического и динамического светорассеяния проведено систематическое исследование водных растворов альбуминов (BSA, HSA) и т-глобулина при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН (определяющий поверхностный заряд белков) и ионная сила (определяемая концентрацией ионов солей).
2. Впервые показано, что молекулярно-динамические свойства макромолекулы "углобулина в растворе, такие как коэффициент деполяризации, коэффициент межмолекулярного взаимодействия и коэффициент трансляционной диффузии - зависят от концентрации белка, ионной силы и знака поверхностного заряда на белке и имеют экстремумы в изоэлектрической точке.
3. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах глобулина, содержащих ионы тяжелых металлов, в частности ионы свинца.
4. Впервые обнаружена возможность возникновения двух структурных переходов в растворе глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.
5. Проведены эксперименты с растворами белков (альбумины, у-глобулин), взятых в различных соотношениях по концентрации в качестве моделей сыворотки крови, что позволило лучше понять результаты исследований нативных образцов сыворотки крови.
6. Показано, что статические и динамические параметры макромолекул белков сыворотки крови в растворах могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями. Подтверждено, что в растворах сыворотки крови онкологических больных коэффициент межмолекулярного взаимодействия макромолекул белков имеет отрицательную величину и может рассматриваться как основной диагностический параметр.
7. Впервые методами статического и динамического рассеяния света изучены изменения молекулярных параметров белков сыворотки крови крыс при искусственно вызванной сосудистой патологии. Из сравнения полученных данных с контрольными значениями обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта.
8. Впервые обнаружено, что при развитии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний поведение молекулярных параметров белков сыворотки существенно различается.
В качестве основных результатов на защиту выносятся следующие положения:
1. На основании полученных в работе экспериментальных данных по коэффициентам межмолекулярного взаимодействия впервые показана возможность возникновения двух структурных переходов в растворе т-гл°булина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.
2. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах 7 гл°булина в присутствии ионов тяжелых металлов, таких как ионы свинца.
3. Установлено, что некоторые параметры макромолекул белков сыворотки крови, а именно коэффициенты межмолекулярного взаимодействия, эффективные массы рассеивающих частиц и коэффициенты трансляционной диффузии могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями.
4. Обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта у экспериментальных животных.
Практическая ценность предлагаемого исследования заключается в том, что полученные в работе результаты способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.
Изученное в работе поведение белковых макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей, в том числе с ионами тяжелых металлов, позволяет установить возможный молекулярный механизм патологических изменений в сыворотке крови. Данное исследование имеет практическое значение для решения задач экологии и медицины.
Материалы диссертации могут быть использованы при разработке физических методов диагностики распространенных заболеваний, а также для создания диагностических приборов [62,67,68,69]. Методы молекулярной оптики позволяют проводить диагностику распространенных заболеваний на ранних стадиях их развития и дают возможность отличать онкологические заболевания от других, например сердечно-сосудистых.
Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля
Макромолекулы, полимерные цепочки которых содержат ионизируемые боковые группы, называются полиэлектролитами. К ним относятся также белковые глобулы в растворе.
Растворы электролитов описываются с помощью простейшей идеализированной модели, в которой ионы рассматриваются как твердые шарики, погруженные в сплошную среду с диэлектрической проницаемостью є и взаимодействующие друг с другом по закону Кулона. Изолированный ион с зарядом Ze (Z - валентность иона, е - заряд электрона) создает на расстоянии г в чистой воде электрический потенциал
Поскольку раствор в целом является электрически нейтральным, то около каждой заряженной группы на поверхности белковой молекулы должен находиться противоположно заряженный ион. Согласно теории Дебая-Хюккеля [11,17,21], исходящей из классической статистической механики и электростатики, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий. Т.о., в среде, содержащей ионы противоположного знака потенциал ф (г) имеет вид:
Плотность этой атмосферы, характеризуемая параметром се в данной теории, определяется общей концентрацией ионов в растворе (ионной силой) ц: Здесь е - заряд электрона, z;- - валентность иона, с,- - молярная концентрация ионов, є — диэлектрическая проницаемость раствора. Параметр се имеет смысл обратной величины эффективного радиуса ионной атмосферы, т.е. определяет расстояние до иона, на котором осуществляется полная экранировка кулоновских взаимодействий. Ионная сила характеризует общее число ионных зарядов в единице объема независимо от их знаков.
Суммарный заряд на молекуле белка определяется концентрацией свободных протонов в растворе, которую обычно характеризуют величиной рН: Значение рН меняется при добавлении в раствор кислоты или щелочи, при этом в среде появляется либо избыток, либо недостаток протонов по сравнению с чистой водой. Концентрация водородных ионов в чистой воде составляет 10 7 моль/л, т.е. для нейтральной среды рН=7, для кислойрН 7, для основнойрН 7 [35].
Для каждого белка существует определенное значение рН, при котором молекула в целом электронейтральна - так называемая изоэлектрическая точка (pi). При значениях рН р1 белок будет обладать отрицательным суммарным зарядом, при рН р1 - положительным. (Для сывороточного альбумина pl=4,9).
Вообще говоря, группы на поверхности белковой молекулы взаимодействуют сложным образом, и их ионизация происходит не независимо. Для анализа связи рН раствора с суммарным зарядом на белке составляется уравнение для идентичных групп [19]: характеристическая константа ионизации для данного класса, ионизованных групп; W- полная электростатическая свободная энергия, заимствованная из теории Дебая-Хюккеля, или работа по перемещению всех зарядов на поверхность сферы радиуса Ъ и а - расстояние предельного сближения белковой молекулы и иона (часто полагают а Ь+2,5 Л). Т.о., Величина рК зависит от взаимодействия данной группы с остальными, а следовательно, от среднего суммарного заряда Z. Таким образом, уравнение (7) выражает нелинейную зависимость величины Z от РН.
Полученное уравнение основывается на некоторых допущениях, поэтому не совсем точно согласуется с экспериментом [19,21]. Во-первых, форму молекул только приближенно можно считать сферической. Во-вторых, распределение заряда вблизи поверхности молекулы нельзя считать равномерным. Наконец, добавление любого электролита в раствор белка приводит к поляризации молекул, поэтому локальная диэлектрическая проницаемость не имеет постоянного по объему значения. На практике для определения суммарного заряда на белке в растворе при различных рН используют данные по титрованию [6,25] или электрофорезу [21].
Кровь - это жидкая ткань, состоящая из плазмы и взвешенных в ней кровяных клеток. Она заключена в систему кровеносных сосудов и благодаря работе сердца находится в состоянии непрерывного движения. Количество и состав крови, а также ее физико-химические свойства у здорового человека относительно постоянны: они могут подвергаться небольшим колебаниям, но быстро выравниваются. Относительное постоянство состава и свойств крови является необходимым условием жизнедеятельности всех тканей организма.
Кровь состоит из форменных элементов (или клеток крови) и плазмы. На плазму приходится 55-60% всего объема крови, клетки крови составляют соответственно 40-45%. Плазма представляет собой слегка желтоватую полупрозрачную жидкость с удельным весом 1,020-1,028 (удельный вес крови 1,054-1,066) и состоит из воды, органических соединений и неорганических солей. 90-92% составляет вода, 7-8% -белки, 0,1% - глюкоза и 0,9% - соли. Белки плазмы делятся на глобулины (альфа-, бета- и гамма-глобулины), альбумины, фибриноген, играющий важную роль в свертывании крови. Фракция гамма-глобулина содержит антитела, обеспечивающие иммунитет к определенным заразным болезням. Гамма-глобулин используют для лечения ряда заболеваний и повышения невосприимчивости к ним. Белки в плазме крови способствуют повышению ее вязкости в 3 раза по сравнению с водой (что имеет важное значение в поддержании коллоидно-осмотического давления, регулирующего содержание воды в плазме) и вместе с гемоглобином эритроцитов служат буферами, поддерживающими постоянство концентрации водородных ионов - рН крови в среднем равно 7,4.
Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц
Уравнение рассеяния (12) позволяет, в принципе, определить молекулярную массу малых невзаимодействующих частиц: здесь К - фактор Кабанна. Однако в большинстве полимерных растворов сказывается влияние межмолекулярных взаимодействий. Эйнштейном на основе термодинамических соображений было получено более общее выражение для R90 [18]. Рассматривая рассеяние на флуктуациях диэлектрической проницаемости, обусловленных флуктуациями AN числа рассеивающих частиц в элементарных объемах, малых по сравнению с Я5, но содержащих еще достаточное число молекул, он пришел к выражению: где 77 - осмотическое давление раствора. Это же выражение было получено Дебаем [41,42]. Зависимость коэффициента рассеяния от физический смысл: разность осмотических давлений в соседних областях препятствует развитию флуктуации концентрации в растворе, т.о. чем тем меньше развиты флуктуации, тем меньше Для идеальных растворов, в которых скомпенсированы межмолекулярные взаимодействия, выполняется закон Вант-Гоффа С учетом этого выражения (30) сводится к (11).
Осмотическое давление раствора как функцию концентрации можно представить в виде степенного ряда: где А, В и т.д. - вириальные коэффициенты раствора, А=—. Отсюда получаем окончательное выражение: Полученная зависимость Rgo от с делает невозможным определение М путем измерения Rgo при одной концентрации. Необходимо провести измерения для нескольких с и экстраполировать результаты к с=0. Т.о., получаем: Оптическая постоянная раствора Н находится путем dn рефрактометрических измерений —— (12). Экстраполяцию выполняют графически, откладывая как функцию с. Наклон прямой позволяет вычислить коэффициент В. Напомним, что второй вириальный коэффициент характеризует степень неидеальности раствора и учитывает парные межмолекулярные взаимодействия в растворе [15]. Термодинамическая теория растворов макромолекул дает следующее выражение для В: где Vo - исключенный объем, т.е. объем, из которого молекула вытесняет все остальные. Отметим также, что мультиплетные взаимодействия, описывающиеся третьим вириальным коэффициентом, проявляются в искривлении прямых, выражающих зависимость от с. Парциальное разложение осмотического давления строго применимо, вообще говоря, лишь для растворов нейтральных частиц, потенциал притяжения между которыми является ван-дер-ваальсовым и спадает как г 6. Белковые же молекулы в растворах при всех значениях рН, кроме изоэлектрической точки, являются заряженными.
Потенциал взаимодействия между ними является кулоновским и спадает как г 1. Тем не менее, как уже было указано, вокруг макроиона, согласно теории Дебая-Хюккеля, образуется атмосфера противоионов, экранирующая кулоновское взаимодействие. И если рассматривать разбавленные растворы (с 5%), в которых дебаевский радиус экранировки rD d, d -среднее расстояние между макроионами растворенного вещества, то изложенная выше теория оказывается применима к белковым растворам. При этом из-за отталкивания одноименно заряженных макроионов будет расти исключенный объем, и В, соответственно, будет иметь большие значения, чем для раствора нейтральных молекул. Следовательно, можно ожидать определенной зависимости В от заряда на белке Z и ионной силы раствора //. Динамическое рассеяние света связано также как и статическое рассеяние с флуктуациями концентрации рассеивающих частиц. Для растворов макромолекул в этом случае возможно связать корреляционную функцию c(t), описывающую молекулярное движение с коэффициентом трансляционной диффузии Д: Соответствующий метод определения c(t) называется методом корреляции фотонов. Известно, что существует связь между функцией спектральной плотности молекулярного движения S((o) и c(t) в виде: Функцию S(o)) можно определить методом оптического смешения света [63]. При динамическом светорассеянии, излучение детектируется под постоянным углом (обычно 90). Диффузное движение частиц в растворе увеличивает флуктуации интенсивности рассеянного света в микросекундном временном интервале.
Исследование рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы
Среди немногочисленных работ, относящихся к исследованиям рэлеевского рассеяния в растворах белков, основополагающей является работа Эдсолла и др. [6]. В этой работе были исследованы водные растворы бычьего сывороточного альбумина (BSA) в присутствии солей NaCl и CaCl при различных величинах поверхностного заряда белка. Были получены зависимости параметра межмолекулярного взаимодействия от величины суммарного заряда на белке (Рис.5). В изменяется нелинейно с минимумом в изоэлектрической точке, что подтверждает теорию Скэтчарда, при этом оказалось, что масса белка не зависит от величин заряда и ионной силы. Следует отметить, что в данной работе не учитывались поляризационные свойства макромолекул белка, т.е. фактор Кабанна полагался равным единице.
В серии работ, проведенных в нашей лаборатории за последние несколько лет [44,47,54,58,59,61,62,82,84], были исследованы растворы сывороточного и яичного альбуминов, гемоглобина, глобулина, лизоцима и белка-фермента липоксидазы. При этом было показано, что поляризационные свойства белковых макромолекул зависят от ионной силы раствора и суммарного заряда на поверхности белковой глобулы существенно нелинейным образом.
Особое внимание следует обратить на результаты, полученные для липоксидазы и лизоцима [54,58,59,84]. Как показали опыты, липоксидаза плохо растворяется в воде и имеет высокие значения интенсивности поляризованной компоненты рассеяния. При низких значениях ионной силы (/л 0,001 моль/л) без добавления соли были получены отрицательные значения В и величины массы до 32 106г/моль. Увеличение концентрации ионов соли NaCl до значения ju=0,1 моль/л позволило определить значение собственной массы липоксидазы и получить положительные значения второго вириального коэффициента. Найденная в результате молекулярная масса 97000 г/моль в пределах ошибки совпадает с табличными значениями [11,17].
Для белка лизоцима зависимость параметра В(рН) также меняет знак при увеличении ионной силы (Рис.6). Это указывает на сильные взаимодействия между ионами электролита и молекулами белка, что приводит при большой концентрации ионов NaCl к ослаблению кулоновского отталкивания макромолекул и увеличению притяжения между ними. При этом коэффициент взаимодействия сохраняет нелинейную зависимость с экстремумом при рН 3,5, что согласуется с формулой Скэтчарда. С увеличением ионной силы, определяемой концентрацией соли, зависимости В(рН) становятся более пологими, что также согласуется с данными работы [6].
Основной вклад в интенсивность рассеяния света в растворах макромолекул дает рассеяние на флуктуациях концентрации, которые, как показывают эксперименты, резко возрастают при перезарядке молекул с изменением водородного показателя среды. При этом, очевидно, должны изменяться и поляризационные характеристики растворов, связанные с флуктуациями ориентации анизотропных молекул. В работах [44,47,54] были проведены измерения коэффициентов деполяризации при различных На Рис. 7 представлены некоторые из полученных зависимостей. Как можно видеть, зависимости Av(pH) имеют существенно нелинейный характер с экстремумом в окрестности изоэлектрической точки белка. Этот экспериментально обнаруженный факт был положен в основу простого и эффективного метода определения изоэлектрической точки белков, не требующего большого количества вещества [48]. При возрастании ионной силы исследованных растворов, определяемой концентрацией соли NaCl, характер зависимостей Av(pH) несколько изменяется, кривые становятся более пологими.
Из экспериментально определенных значений коэффициента деполяризации и электронной поляризуемости а для некоторых белков были рассчитаны величины компонент тензора поляризуемости и оптической анизотропии (14,16,17) при различных значениях водородного показателя раствора (Рис. 8,9). На полученных графиках также четко выражен экстремум, который совпадает с соответствующей изоэлектрической точкой.
Результаты исследования смеси белков альбумина и -у-глобулина при их различных массовых соотношениях
По результатам экспериментов, проведенных с помощью фотонно-корреляционного спектрометра, было обнаружено, что зависимость коэффициента трансляционной диффузии для растворов т-глбулина от величины рН имеет вид, близкий к параболическому, величина Dt резко уменьшается в области изоэлектрической точки (рН=6) {рис. 27,а). Измерения проводились при различных концентрациях. По приведённым кривым (рис. 9а) видно, что при увеличении концентрации белка в растворе коэффициент диффузии увеличивается. Этот факт наглядно продемонстрирован на графике зависимости Dt(c){ рис.27,б). Такое аномальное увеличение коэффициента диффузии при увеличении концентрации объясняется на основе теории, предложенной Джеймсом и Эвансом (41): где с-концентрация белка в растворе, Л3 Z2. Полученные результаты показывают, что в данном случае коэффициент, определяющий электрические потери энергии X, значительно превышает вклад гидродинамических потерь /. При добавлении соли NaCl в раствор т-глобулина заряженные группы белка экранируются противоионнами соли. В результате чего молекулы белка приобретают свойства, близкие к свойствам белка в изоэлектрической точке не зависимо от значения рН. На графике (рис. 96) верхняя кривая соответствует зависимости Dt(pH) для раствора белка без добавления NaCl, нижняя кривая — для раствора с NaCl. На графиках (рис. 28а,б) приведены зависимости величины Dt(pH) для растворов 7-глобулина. Нижние кривые построены для растворов белка в присутствии соли NaCl (рис. 28,а) и ацетата свинца (рис.28,6), верхние — для водных растворов чистого у-глобулина. Добавление в белковый раствор соли NaCl не оказывает существенного влияния на изменение массы макромолекул; уменьшение же значения D, и, как следствие, увеличение R в соответствии с (6) при добавлении свинца говорит об увеличении размеров рассеивающих частиц, то есть об образовании молекулярных комплексов. 1. В случае, когда альбумина больше, чем у -глобулина, что соответствует СН І \ "А случаю крови здорового пациента, наклон —ус) положительный.
А зависимость в{рН) близка к параболической с минимумом при рН 6, что соответствует изоэлетрической точке у -глобулина. 2. В случае, когда /-глобулина больше, чем альбумина, что соответствует случаю больного пациента, наклон —(с) отрицательный. А зависимость в{рН) близка к параболической с максимумом также в области рН 6. 3. Для случая, когда количество альбумина равно количеству у глобулина, наклон —(с) положительный, а зависимость в{рН) близка к параболической с минимумом в точке с рН 6. 4. Средние массы рассеивающих частиц, определенные методом Рэлея-Дебая, соответствуют рассчитанным. 5. Коэффициенты трансляционной диффузии частиц в исследованных смесях белков с ростом их общей концентрации в растворе возрастают. Такое поведение коэффициента диффузии при увеличении концентрации объясняется на основе теории, предложенной Джеймсом и Эвансом. В ходе работы было обнаружено аномальное поведение макромолекул 7-глобулина в растворе. Это связано с конфигурацией молекулы этого белка. Как уже упоминалось молекула т-глобулина имеет трёхмерную третичную - глобулярную структуру и состоит из трёх основных плотно свёрнутых спиральных структур, две из которых положительно заряжены, т.к. на них преобладают ионы NH$, а одна - отрицательно, т.к. на ней сконцентрированы ионы ОН . За счёт такого разделения заряда между молекулами присутствуют сильные электростатические взаимодействия: Поэтому, мы наблюдаем зависимость параметра рассеяния от концентрации белка в растворе с отрицательным наклоном. При добавлении соли NaCl ионы СГ "закрывает" положительный заряд на поверхности белковой молекулы и между молекулами начинают преобладать силы кулоновского отталкивания. С возрастанием ионной силы вокруг заряженной молекулы белка в растворе возникает облако
