Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы.
Глава 1. Роль полиэлектролит-белковых комплексов в биологических процессах .
1.1. Эндогенные и синтетические полиэлектролиты. Классификация 8
1.2. Неорганические полифосфаты 9
1.3. Гликозаминогликаны 11
Глава 2. Роль эндогенных полиэлектролитов в регуляции ферментов 13
Глава 3. Физико-химические механизмы взаимодействия ПЭ с белками .
3.1. Вклад электростатических взаимодействий 16
3.2. Расчет зависимости электростатических параметров белков от рН 16
3.3. Влияние жесткости цепи полиэлектролита на его конформационные параметры 27
3.4. Влияние жесткости цепи полиэлектролита на связывание с белком 29
3.4. Влияние гидрофобных взаимодействий на образование комплекса ПЭ-белок 30
Глава 4. Влияние ионной силы на взаимодействия полиэлектролитов с белками 31
Глава 5. Прикладные исследования полиэлектролит-белковых комплексов 35
ЧАСТЬ II. Объекты ц методы исследования.
II. 1. Метод расчета 38
П.2. Объекты 41
IL3. Методы измерения 44
ЧАСТЬ III. Результаты и обсуждение.
Глава 1. Расчет РЭП низкомолекулярных белков с учетом локального окружения аминокислотных остатков (смещения величины рК) 45
Глава 2. Расчеты рэп на поверхности лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы 55
Глава 3. Расчеты электростатического потенциала на поверхности моно- и тетрамерного белков с близкой структурой - миоглобина и гемоглобина 69
Глава 4. Исследование влияния различных солей на ферментативную активность ЛДГ в комплексе с ПСС 76
Глава 5. Взаимодействие уреазы с полиэлектролитами 81
Глава 6. Заключительная часть 85
Глава 7. Прикладное применение расчетов РЭП на белках 90
7.1. Формирование полиэлектролитной оболочки микрокапсул 90
7.2. Включение белков в сформированные микросферы ПАА/ПСС)4 93
Выводы 97
Цитированная литература
- Неорганические полифосфаты
- Влияние жесткости цепи полиэлектролита на его конформационные параметры
- Методы измерения
- Расчеты электростатического потенциала на поверхности моно- и тетрамерного белков с близкой структурой - миоглобина и гемоглобина
Введение к работе
В связи с успехами белковой инженерии, математическое моделирование взаимодействий белков с различными лигандами, низкомолекулярными или полимерными цепями представляется особенно важным как для понимания регуляции биологических процессов, связанных с образованием макромолекулярных комплексов, так и для создания белковых ансамблей с заранее заданными свойствами.
Моделирование полиэлектроит-белковых взаимодействий актуально при рассмотрении ДНК-белковых взаимодействий, при исследованиях иммунологических образований комплексов антиген-антитело, при исследованиях гормональных взаимодействий с рецепторами.. Моделирование полиэлектролит-белковых комплексов помогает понять механизм катализа, в ряде случаев, довольно сложный для отдельных ферментов.
Функции низкомолекулярных метаболитов и соответственно ферменты их метаболизма изучены к настоящему времени достаточно подробно, однако этого нельзя сказать о высокомолекулярных эндогенных полиэлектролитах. Успехи клеточной биологии постепенно приводят к пониманию того, что полиэлектролиты, образуют динамические комплексы как с отдельными белками, так и с клеточными компартментами, что определяет их решающую роль во внутриклеточных процессах.
Изучение функции полиэлектролит-белковых комплексов особенно важно для понимания медицинских аспектов, связанных с причинами заболеваний, обусловленных размножением и выживанием бактерий, в частности Helicobacter pylori за счет экзогенно выделяемых ферментов. Функционирование этих бактериальных ферментов в комплексе с внутренними мембранами клеток млекопитающих и другими эндогенными полиэлектролитами, сопровождается нарушением кислотно-щелочного баланса, индуцированного изменением содержания продуктов реакции, катализируемых этими ферментами.
Сродство ферментов к этим полизаряженным компонентам клетки независимо от их агрегатного состояния есть функция присутствия моно- и дивалентных ионов, находящихся в составе любого компартмента живой клетки. Изучение влияния солевого состава среды на функциональные особенности ферментов в комплексе с полиэлектролитами может облегчить решение задач регуляции биологических процессов в живых организмах.
Выявление природы сил, формирующих полиэлектролит-белковый комплекс, а также изучение каталитических и структурных его характеристик особенно важно в связи с полифункциональностью многих ферментов. В частности показано, что растительные уреазы, исследуемые в настоящей работе, кроме уреалитической функции обладают инсектицидальной активностью, не менее важной для выживания растений в борьбе с паразитами -насекомыми, грызунамии т.д.. Многое выявлено в механизме действия этих ферментов на физиологическом уровне [Follmer (2001), (2004)], однако полное знание как участков присоединения фермента, так и механизмов, инициирующих это присоединение, в настоящее время отсутствует. Так или иначе, в основе инсектицидного действия ферментов лежит образование полиэлектролит-белкового комплекса, преобразующего свойства самого фермента и матрицы, с которой он связывается.
Ключевым вопросом в изучении влияния полиэлектролитов на структуру и функции белков является определение физико-химического механизма, который лежит в основе их влияния на активность ферментов при образовании с ними комплексов и определение параметров среды, влияющих на эффективность образования таких комплексов.
Электростатическое поле белковой молекулы является одной из важнейших ее физико-химических характеристик, влияющей на устойчивость пространственной структуры белка, а также определяющей скорость образования, конфигурацию и стабильность комплексов белков с клеточными компонентами разной степени полимеризации. В настоящей работе мы
рассмотрели роль электростатического поля во взаимодействиях белков с полиэлектролитами, т.е. роль поля за пределами белковой глобулы на расстояние 5,5 А от атома. Такой подход к рассмотрению электростатического поля в ближайшем окружении белка и его визуализации, предложенный Сивожелезовым В. С, основан на том, что расстояние от точки наблюдения потенциала до ближайшего заряда, принадлежащего белку, составляет около 7 А. При этом значения вычисляемых нами потенциалов таковы, что соответствующие энергии взаимодействия существенны на фоне энергии теплового движения.
Настоящая работа представляет исследование взаимодействия полиэлектролитов с ферментами, чтобы на основе теоретической (расчетной) и экспериментальной информации понять природу сил, лежащих в основе полиэлектролит-белковых взаимодействий.
Цель исследования.
Исследование физико-химических механизмов взаимодействия полиэлектролитов с мультисубъединичными белками и выявление общих закономерностей формирования таких комплексов с помощью расчетов электростатического потенциала на поверхности белков, определяющего их функциональное состояние
Задачи работы.
Провести расчеты распределения электростатического потенциала на поверхности односубъединичных белков в широком интервале значений рН и ионной силы с целью выявления условий, при которых усредненные значения рК титруемых аминокислотных остатков могут заменить истинные значения рК, когда они отсутствуют.
Провести расчеты электростатического потенциала на поверхности мультисубъединичных белков - лактатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, глюкозоксидазы, уреазы в широком интервале значений рН, и интерпретировать экспериментальные данные по ингибиторному действию полиэлектролитов на эти белки.
Произвести сравнительные расчеты электростатического потенциала на поверхности двух белков, имеющих близкую пространственную конфигурацию цепи, но с разным числом субъединиц — миоглобина и гемоглобина для интерпретации полученных в эксперименте различий в комплексообразовании этих белков с полиэлектролитом.
Экспериментально исследовать влияния различных солей в широком интервале значений ионной силы на изменение ферментативной активности ЛДГ при образовании комплекса с ПСС методом стационарной кинетики.
Провести расчеты распределения электростатического потенциала на поверхности ЛДГ в широком интервале значений ионной силы с целью интерпретировать аномальный ход зависимости функционального состояния полиэлектролит-белкового комплекса от ионной силы.
ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
Неорганические полифосфаты
В этой классификации приведена только часть наиболее характерных полиэлектролитов эндогенного происхождения. Это полипептиды, нуклеиновые кислоты, модифицированные полисахара - в частности, гепарин и конечно, полифосфат. Опишем подробней некоторые их них.
Неорганические полифосфаты (ПФК) по их значению для жизнедеятельности живых организмов в настоящее время можно отнести в первую строку наиболее важных компонент живой клетки. Именно несколько последних лет ознаменовались особенно бурным развитием во всем мире работ в области биохимии и биотехнологии полифосфатов, и особенно в Японии [X. Ota-ke] и Германии [X. Shreder)] Толчком к такому бурному развитию исследований полифосфатов послужили работы Розетты Рош (Мичиганский университет, США, [Reusch (1999)]). Она обнаружила в мембранах клеток Escherichia coli каналы, которые были сформированы высокополимерными полифосфатами. Рош Р., а затем и Артур Корнберг [Romberg А (1999)] доказали, что через эти каналы, образованные полифосфатами и поли-/?-гидроксибутиратом с участием ионов кальция, в клетки Е. coli, компетентные к генетической трансформации, транспортируется экзогенная ДНК. Далее было установлено, что эти небелковые каналы участвуют в транспорте кальция через мембраны, в том числе и в клетках высших животных. Последующие исследования, показали наличие полифосфатов в животных, растительных и бактериальных клетках и значительно расширили понимание их функций [Кулаев (2005)].
ПФК обнаружены практически во всех клеточных компартментах: ядрах, митохондриях, лизосомах и плазматических мембранах. Во многих клеточных линиях млекопитающих часто находят две или более популяций ПФК с ограниченным диапазоном длины цепи. Например, в лейкемических клетках человека HL-60 имеются два класса ПФК с -150 и 25-45 остатками фосфатов, в клетках NIH3Y3, РС12 и Jurkat присутствуют ПФК с длиной 500-800 и 5-15 остатков [Phillips (1999); Кулаев (2005)].
На примере полифосфатов можно видеть многообразие функций полиэлектролитов в живых организмах [Кулаев (2005)]: 1) молекулы, запасающие высокоэнергетические фосфаты, 2) хелаторы для Са" или других двухвалентных катионов, 3) регуляторы концентрации свободного внутриклеточного кальция 4) регуляторы внутриклеточного рН, 5) противоионы для основных аминокислот, 6) регуляторы осмотического давления 7) структурная основа мембранного канала в комплексе с поли-(К)-3 гидроксибутиратомрегуляторы кальцификации и декальцификации в костной ткани.
Кроме собственного физиологического значения, ПФК используют также в качестве модельных ПЭ-ов при изучении ДНК-белковых взаимодействий, поскольку основным остовом полимерной цепи ДНК и РНК является полифосфорная цепь.
Эти результаты в новом свете показывают регуляторное значение полиэлектролитов, составляющих структурную основу некоторых клеточных компартментов, и растворимой фракции этих органел.
Функции полифосфатов, и соответственно ферменты их метаболизма, изучены к настоящему времени достаточно детально, однако остается открытым вопрос о том, как эти полифосфаты взаимодействуют со всем пулом водорастворимых ферментов, которые присутствуют в клетке, но не участвуют непосредственно в метаболизме этих полиэлектролитов. Такие данные в литературе практически отсутствуют.
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой особый класс биополиэлектролитов: они являются линейными, переменно сульфатированными полисахаридами с неизвестной вторичной или третичной структурой (рис.1). ГАГ являются структурно разнородными (гетерогенными) благодаря тому, что в процессе их биосинтеза они проходят серию из 10 последовательных пост-полимеризационных модификаций, катализируемых ферментами. Селективность и специфичность гетерогенных структурных субпопуляций создают сложную задачу для биохимии. Из-за их структурного разнообразия они, взаимодействуя с белками, способны влиять на множество физиологических функций, включая клеточную дифференциацию, ангиогенезис, ассоциацию с тропоэластином, чтобы инициировать эластогенезис и выработку хемокинов в ответ на воспаление (хемокины малые иммунные белки, которые взаимодействуют с ГАГ, инициируя ответ клетки на воспаление).
Большое физиологическое значение имеет также взаимодействие с белками другого класса ГАГ-ов — пектинов. В условиях физиологического или экологического стрессов под действием секретируемых патогенами ферментов происходит процесс деградации пектина в клеточных стенках растений. Процесс деградации пектина ингибируется при образовании комплексов пектина с белками. В работах авторов [ Sakamoto Т., 2003], в которых показано, что полигалактуроназа-ингибирующие белки (PGIPs) при образовании комплекса с пектином (полигалактуроновой кислотой) предохраняют его от расщепления патоген-секретируемым ферментом - эндополигалактуроназай (endo-PG). Причем авторы показали, что из двух видов полисахаров - алгината и пектина только последний специфически связывается с PGIPs белками, хотя оба субстрата имеют одинаковое количество отрицательно заряженных групп.
Влияние жесткости цепи полиэлектролита на его конформационные параметры
Расчеты РЭП на поверхности белков необходимы при создании биосенсоров [Sivozhelezov (2005)], в процессах кристаллизации белков [Sivozhelezov (2006)], при исследовании полиэлектролит-белковых взаимодействий [Seyrek Е., (2003)] а также при изучении механизма РНК-белкового узнавания [Polozov R, (2006)].
Особенно незаменима роль электростатики в решении проблем полиэлектролит-белковых взаимодействий и белкового узнавания. Так узнавание ферментом области связывания происходит на расстояниях, превышающих 5 А и более (области узнавания превышают иногда 10 10A) и только электростатические силы, как самые дальнодействующие, дают вклад в энергию взаимодействия на этих расстояниях. Изучение ранней стадии узнавания участков связывания на транспортной РНК такими белками, как синтетаза и фактор элонгации EFU, с помощью исследования РЭП на этих макромолекулах позволило выявить разные механизмы узнавания [Polozov (2006)]. Как показано авторами, одним из возможных механизмов специфического узнавания является индукция дополнительного заряда на белке большим электростатическим потенциалом на РНК
При решении проблем полиэлектролит-белковых взаимодействий особая роль электростатики состоит в определении участков связывания полиэлектролита на ферменте.
Одним из конформационных параметров полиэлектролитов, характеризующих жесткость полимерной цепи, является персистентная длина. Персистентная длина отражает изменения конформации полиэлектролита при добавлении солей. Полная персистентная длина Lp есть сумма собственной (intrinsic) персистентной длины L\ и электростатической части Хе:
Собственная персистентная длинна L\ зависит от жесткости полимерного остова, т.е. от стерических ограничений боковых групп; электростатическая часть Le зависит от концентрации противоионов. Персистентная длина зависит также от концентрации полимера. Бесконечная персистентная длина означает бесконечно жесткую палочку, в то время как гаусов клубок имеет персистентную длину, стремящуюся к нулю.
Ранее исследователи, сталкивались с трудностями при определении персистентной длины при низких значениях ионной силы, используя такие экспериментальные методы как вязкость, из-за значительного увеличения размеров полиэлектролитов при снижении ионной силы или концентрации полиэлектролита. Сильное электростатическое взаимодействие между заряженными мономерами при низкой ионной силе приводит к увеличению жесткости цепи, что отражено в уравнении для персистентной длины как увеличение электростатического вклада Lc. Применение таких современных методов, как двойное лучепреломление в импульсных электрических и магнитных полях позволило получить более точные значения персистентной длины для ряда полиэлектролитов при сверхслабых ионных силах. Так авторы работы [Johner (1995)] провели измерения персистентной длины ПСС при особо низкой ионной силе «10 б М. Авторы измерили длину полиэлектролита (ПСС) с молекулярными весами в диапазоне 105 и 1,1 106 г/моль, что соответствует контурным длинам между 120 и 1350 нм. Они показали, что влияние ионной силы на такие свойства полиэлектролита как жесткость цепи критично. Ими получено, что при нулевой ионной силе экстраполированные величины персистентной длины ПСС порядка 500 А и не зависят то длины полиэлектролита при Mw выше 104.
Электростатический вклад в персистентную длину Le изменяется линейно с Г и зависит от природы боковых групп полиэлектролита [Tricot (1984)], Это справедливо для значений ионной силы в области 1,0-0,005 М. Значения Lp для ПСС в зависимости от ионной силы приведены в таблице 5. При бесконечно большой ионной силе персистентная длина равна с хорошей точностью персистентной длине незаряженного полимера с эквивалентной структурой.
Так как положительные сайты белка и отрицательные сайты полиэлектролита не являются комплиментарными, сила связывания должна также зависеть от лабильности структуры полимера. Более лабильная конформация полимера может иметь конфигурацию с более низкой энергией связывания и таким образом более высокую константу связывания. Лабильность полимеров выражается величиной его персистентной длины Lp. Для полиэлектролитов Lp зависит от ионной силы раствора, поскольку с ее увеличением ослабляются внутримолекулярные электростатические силы отталкивания.
Чем ниже ионная сила, тем сильнее электростатическое взаимодействие между полиэлектролитом и белком (заряды слабо экранированы) с одной стороны, но тем жестче полиэлектролитная цепь (больше персистентная длина), и соответственно тем труднее обеспечить подобие расположения зарядов полиэлектролита с расположением противоположных зарядов на белке.
Отметим, что собственное значение L\ (независимое от I) — это значение Lp полиэлектролита при бесконечно большой ионной силе (при полном экранировании зарядов полиэлектролита противоионами). Если сравнивать близкие по структуре полиэлектролиты, например ПСС и ПАМПС, то при взаимодействии их с белком ПСС имеет более высокое сродство по сравнению с ПАМПС [Hattoiy (2000)]. Для ПСС и ПАМПС значения X, равны 14 и 24 А соответственно. Поэтому высокое сродство ПСС по сравнению с ПАМПС происходит частично из-за большей лабильности его цепи.
Методы измерения
Локальное окружение для каждого заряженного аминокислотного остатка в белке вызывает смещение ее рК на величину, иногда превышающую две единицы рН. Экспериментально измерить величины рК всех заряженных остатков в белке - задача сложная и поэтому в настоящее время такие данные имеются лишь для небольшого количества низкомолекулярных белков. Задачей настоящего исследования была оценка влияния отклонения величин рК- аминокислотных остатков от стандартно используемых на РЭП на поверхности белков.
Произведен расчет РЭП на поверхности шести низкомолекулярных белков: рибонуклеазы 1FS3, ксиланазы 1XNB, миоглобина 1JP6, лизоцима 2LZT, а-химотрипсина 2СНА, инсулина 1TRZ при значениях рН 4, 5, 6, 7 и 8 и ионной силе 0,1 М. Заряды на аминокислотных остатках распределяли по уравнению Гендерсона- Хассельбалха [Ленинджер (1974).]] в соответствии с точными экспериментально измеренными значениями [рЩжсп, а где они отсутствовали, то в качестве [рЩЖСп были использованы расчетные [Elcock, (1999); Mehler, (1999), (2002); Antosiewicz, (1994)]. (см. таблицу 6). Для сравнения расчеты РЭП на поверхности этих же белков были произведены по тому же уравнению, но без учета собственного локального окружения, т.е. со значениями [рК\о для полностью доступных растворителю заряженных аминокислотных остатков, для His 6.6, для Glu и Asp 4.5. Положительно заряженным аминокислотным остаткам Arg и Lys присваивали заряд +1, на атоме железа порфиринового кольца Mb заряд +1, на карбоксильных группах гемма-1.
Значения рК аминокислотных остатков, используемые в нашем расчете РЭП для белков приведены в таблице 6. Как видно из этой таблицы, экспериментальные величины [р-К]Эксп Для кислых аминокислотных остатков имеют относительно большие смещения по сравнению с [рК]о полностью доступных растворителю боковых остатков олигопептидов. При этом смещение сильнее для Asp, чем для Glu в сторону снижения рК. Исключением для перечисленных белков являются Glu 172 в ксиланазе и Glu35 в лизоциме, для которых [рК]эксп с учетом микроокружения увеличиваются более чем на 1,3 ед. рН, вместо обычного уменьшения, по сравнению с [рК]о Во многих белках His является составной частью его активного центра, и тогда рК его сильно зависит от присутствия соседних остатков, участвующих в катализе, а также наличия субстрата, ингибитора и т.д., с которыми он связан водородной связью. Естественно, что рК такого His значительно отличается от остальных гистидиновых остатков. Например, в а-химотрипсине активный центр составляет триада аминокислотных остатков Serl95-His57-Aspl02 и в присутствии разных ингибиторов рК этих остатков смещается на несколько единиц [Нортроп, (1950); Мосолов, (1971)]. Аналогично для ксиланазы Hisl49 и Glul72 образуют ионную napy.[Fitch (2002); Bas, (2008), Manish, (1997)]
На рис. 9-13 приведены РЭП на поверхности исследованных нами белков, используя экспериментально измеренные значения рКэкт и стандартные, т.е. рКо для полностью доступных растворителю аминокислотных остатков при разных рН. Протяженные области положительного потенциала на поверхности этих белков предопределяют высокое связывание анионных полиэлектролитов в случае образований с ними комплексов, возможный ингибиторный эффект и разрушение структуры белка. Величины площадей пятен с положительным потенциалом численно рассчитаны нами при значениях рН 4, 5, 6, 7 и 8 и ионной силе 0,1 М для всех шести белков и в качестве примера представлены для ксиланазы, РНКазы и лизоцима в таблице 7.
Расчеты, сделанные нами для а-химотрипсина, миоглобина, инсулина, аналогичные представленным в таблице 7, приводят к такой же зависимости величины/от рН. В результате расчета РЭП на поверхности белков, площадей с разноименным потенциалом и оценки величин/показано, что учет окружения заряженных аминокислотных остатков изменяет РЭП на поверхности ферментов, но в ограниченной области рН 3-5. Это вызвано спецификой смещений величины рК преимущественно кислых аминокислотных остатков, определяемой расположением их преимущественно в изолированной от растворителя области. В области рН 6-8 учет окружения аминокислотных остатков для рассмотренных белков при расчете РЭП можно не осуществлять. Выполненные расчеты позволили применить полученные результаты к белкам с высоким молекулярным весом, для которых отсутствуют точные экспериментальные значения величин рК.
Расчеты электростатического потенциала на поверхности моно- и тетрамерного белков с близкой структурой - миоглобина и гемоглобина
Остальные пятна менее значительны по размеру. Величины их площадей приведены в таблице 8. Отметим сразу, что в отличие от ЛДГ, где самое большое синее пятно приходится на область соединения по оси Р двух димеров, имеющих самый слабый контакт между субъединицами, то в ГДГ самое большое синее пятно приходится на область наиболее сильного контакта между субъединицами, т.е. на область, где три субъединицы переплетены между собой (Рис. 16). Эта область контакта между субъединицами в тримере обеспечивает им большую стабильность. Это подтверждается экспериментальными данными по диссоциации ГДГ на субъединицы в растворе мочевины. Для того чтобы разрушить нативную молекулу ГДГ на два димера, состоящих из тримеров, требуется концентрация мочевины около 1,5 М, в то время как для разрушения тримера на мономеры требуется значительно большая концентрация мочевины - 5-6 М [Strambini, (1989); Fisher, (1985)]. Это означает, что наиболее слабый контакт между субъединицами ГДГ - это контакт между тримерами. Анализ распределения электростатического потенциала на молекуле ГДГ, проведенный нами, показывает, что именно в этом контакте сконцентрированы участки с отрицательным электростатическим потенциалом, т.е. участки, не доступные для связывания полиэлектролита.
На основе анализа экспериментальных данных, с учётом кинетики инактивации ферментов полиэлектролитом, а также расчета РЭП, произведенного на поверхности белков, процесс разрушения белков полиэлектролитом можно описать схемой, представленной на рис. 20: Согласно предложенной схеме первой стадией взаимодействия ПЭ с белком является быстрое обратимое связывание ПЭ, вторая стадия (лимитирующая) это диссоциация белка на субъединицы. Это более медленная стадия (т 1 мин"1, по данным спектральных исследований). Она сопровождается конформационными изменениями в структуре белка, инициируемыми гидрофобным включением полиэлектролитного остова в белковую глобулу или в межъсубъединичный контакт. Третья необратимая стадия - дальнейшее разрушение третичной и частично вторичной структур (т часы).
Таким образом, проведенные расчеты РЭП на поверхности этих белков позволили выявить особенности структурно-функциональных свойств белков, обуславливающие эффективность их повреждающего действия полиэлектролитом, а) Наличие протяженных участков на поверхности ЛДГ с положительным потенциалом в отличие от мозаичного распределения на ГДГ. б) Расположение участков с положительным потенциалом на ЛДГ в области наиболее слабых контактов между димерами. Для ГДГ участки с положительным потенциалом расположены в области плотно скрученных мономеров в тримеры.
В данной главе мы рассмотрим механизм разрушающего действия анионного полиэлектролита - полистиролсульфоната, наиболее активного из других исследованных нами полиэлектролитов, на структуру гемсодержащих белков - гемоглобина (Hb) 2МНВ и миоглобина (Mb) 1JP6. Методами оптического поглощения простетическои группы гема в видимой части спектра и кругового дихроизма в полосах поглощения пептидных групп и ароматических аминокислотных остатков (Рис. 21) показано, что в присутствии полистиролсульфоната (ПСС) компактная структура обоих белков разрушалась. Содержание а-спирали НЬ и Mb при образовании комплекса с ПСС падало от 81 % до 43 %. Кинетика разрушения обоих белков полиэлектролитом представляла двухфазный процесс: первая фаза разрушения НЬ осуществлялась с константой скорости в 4 раза более медленной (т« 24,5 с), чем Mb (г» 6 с); вторая медленная фаза с полупериодом порядка 6 часов одинакова для обоих белков (Рис. 21-Ж).
Следует отметить еще одно различие в механизмах разрушения НЬ и Mb это состояние гема в комплексах этих белков с полиэлектролитом. Как видно из Рис. 21-А,Б при повышении концентрации ПСС свыше 0.05 мг/мл, т.е. когда соотношение ПСС / Mb превышает 1/1, на спектрах оптического поглощения Mb появляется полоса с максимумом 397 нм, интенсивность которой значительно повышается при возрастании концентрации ПСС вплоть до соотношения ПСС / Mb, равному 10/1. В растворах НЬ с ПСС даже при пятикратном избытке ПСС по сравнению с белком такой полосы не наблюдается. Аналогичную полосу с максимумом при 397 нм имеет свободный гем в растворе метанола [Babu, (2000)]. Возможно, что в комплексе с ПСС структура НЬ хотя и разрушена, связь с гемом сохранена, в то время как в Mb при высокой концентрации ПСС гем теряет связь с белком, конкурентно связываясь с гидрофобной частью полиэлектролита, в результате чего спектр его приобретает характеристики свободного гема в неполярной среде.
Похожие диссертации на Применение расчетов электростатического поля белков для анализа взаимодействия полиэлектролитов с белками
