Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1 Функциональная роль белков bRHSRII 11
1.2 Транспорт протона 12
1.3 Структура бактериородопсина „ 13
1.3.1 Фотоцикл 15
1.3.1.1 КиЬ состояния..., 15
1.3.1.2 Ml,М2 и MN состояния 15
1.3.1.3 N и О состояния 16
1.4 Трансмембранные сигнальные белки 17
1.4.1 Структура NpSRII/NpHtrll комплекса 18
1.5 Методы получения пространственной структуры белков 19
1.5.1 Электронная и рентгеновская кристаллография 19
1.5.2 Нейтронная дифракция и неупругое рассеяние 19
1.5.3 ЯМР спектроскопия 19
1.5.4 Другие методы 20
1.6 Динамика молекул воды в белках 20
1.7 Методы компьютерного моделирования 21
1.8 Краткая формулировка целей и подходов диссертационного исследования...22
Глава 2. Материалы и методы 24
2.1 Силовые поля 24
2.1.1 Простая модель силового поля 24
2.1.1.1 Типы атомов 25
2.1.1.2 Растяжение связей 25
2.1.1.3 Колебания углов 26
2.1.1.4 Вращательные движения 26
2.1.1.5 Ложные вращения и движения вне плоскости 27
2.1.1.6 Непарные взаимодействия. Электростатика 27
2.1.1.7 Точечные заряды 28
2.1.1.8 Параметризация зарядов для больших систем 29
2.1.1.9 Поляризация 30
2.1.1.10 Взаимодействия ван-дер-Ваальса 31
2.1.1.11 Водородные связи 32
2.1.1.12 Силовые поля для объединенных атомов 33
2.1.2 Модели воды 33
2.1.3 Неявно заданные водное окружение и мембрана 34
2.1.4 Производные для функции энергии в молекулярной механике 35
2.2 Статистическая механика и термодинамика „ 36
2.2.1 Статистические ансамбли в моделировании 37
23 Вычисление термодинамических параметров системы 38
2.3.1 Внутренняя энергия 38
2.3.2 Теплоемкость 38
2.3.3 Давление 38
2.3.3.1 Вывод выражения вириала реального газа 39
2.3.4 Температура 39
2.3.5 Радиальная функция распределения 40
2.4 Уравнение Пуассона-Больцмана 40
2.4.1 Сеточное уравнение Пуассона-Больцмана 41
2.4.2 Вычисление энергии сольватации и энергии связывания при помощи уравнения Пуассона-Больцмана 42
2.5 Алгоритмы минимизации структуры 43
2.5.1 Метод быстрейшего спуска 44
2.5.2 Метод сопряженных градиентов .46
2.6 Обзор метода МД 47
2.6.1 Механика Ньютона и численное интегрирование 47
2.6.2 Связи 48
2.6.3 Статистические ансамбли в МД 50
2.6.4 Динамика при постоянной температуре 50
2.6.4.1 Методы шкалирования температур. Термостат Берендсена 50
2.6.4.2 Термостат Нозе-Хувера 51
2.6.4.3 Цепи термостатов Нозе-Хувера 52
2.6.4.4 Нагревание системы на границе 52
2.6.5 Динамика при постоянном давлении 53
2.6.5.1 Методы шкалирования давления. Алгоритм Берендсена 53
2.6.5.2 Алгоритм Нозе 54
2.6.6 Дальние взаимодействия 54
2.6.6.1 Метод суммирования Эвальда 54
2.6.7 Периодические условия на границе ~57
2.6.8 Равновесные характеристики системы 58
2.7 Подготовка системы для моделирования 58
2.7.1 Подготовка белка 58
2.7.2 Недостающие основания „ 58
2.7.3 Подготовка олигомеров 59
2.7.4 Протонирование перезаряжаемых групп и мутации 59
2.7.5 Солевые мостики 59
2.7.6 Параметризация новых молекул 59
2.7.7 Учет воды внутри структуры 60
2.7.8 Граничные условия 60
2.7.9 Подготовка мембраны 60
2.7.10 Подготовка водного окружения 61
2.8 Анализ Нормальных Мод 61
2.8.1 Вычисление В-факторов 63
2.8.2 Проекция нормальных мод „ 63
2.8.3 Квази-гармоническое приближение 63
2.8.4 Переход между несколькими конформациями 64
2.9 Анализ пространственной структуры белка 65
2.9.1 Лучшее наложение структур друг на друга 65
2.9.2 Определение поверхности белка 66
2.9.3 Вода внутри белка - 67
2.9.3.1 Первый алгоритм 67
2.9.3.2 Второй алгоритм 68
2.9.4 Анализ цепочек водородных связей 69
2.9.5 Анализ молекул воды 70
2.10 Структуры 71
2.10.1 Анализ и сравнение структур бактериородопсина 71
2.10.2 Анализ и сравнение структур сенсорного родопсина II 73
Глава 3. МД исследование механизма транспорта протонов в bR 75
3.1 Мономер .75
3.1.1 Подготовка структуры 75
3.1.2 Молекулярная динамика и вычислительные алгоритмы 76
3.1.3 Стабильность структуры 76
ЗЛ.4 Анализ данных 77
3.2 Тример 84
3.2.1 Подготовка структуры 85
3.2.2 Молекулярная динамика и вычислительные алгоритмы 85
3.2.3 Стабильность структуры „ 86
3.2.4 Анализ данных 87
3.2.4.1 Динамика молекул воды 87
3.2.4.2 Распределение молекул воды 90
3.2.4.3 Цепи водородных связей 92
3.3 Сравнение результатов мономер/тример и выводы 94
3.3.1 Стабильность структуры 94
3.3.2 Количество, распределение и динамика внутренних молекул воды 94
3.3.3 Цепочки водородных связей 96
3.4 Новые данные, полученные при помощи использованных методов 97
3.5 Границы применимости используемых методов 97
3.6 Перспективы развития метода 98
Глава 4. Исследование комплекса NpSRII с NpHtrll 99
4.1 Энергия связывания NpSRII с NpHtrll в липидной мембране 99
4.1.1 Система для моделирования 99
4.1.2 Вычисление энергии связывания 99
4.2 Вычисление нормальных мод для комплекса NpSRII с NpHtrll 101
4.2.1 Система для моделирования - 101
4.2.2 Вычисление нормальных мод 102
4.2.2.1 Движение конца спирали Htrll 102
4.2.2.2 Сравнение нормальных мод основного состояния с вектором смеще ния из основного в промежуточное состояние 106
4.3 Новые данные, полученные при помощи использованных методов 107
4.4 Границы применимости используемых методов 107
4.5 Перспективы развития метода - 108
Основные выводы работы 109
Библиографический список использованной литературы
- Структура NpSRII/NpHtrll комплекса
- Ложные вращения и движения вне плоскости
- Молекулярная динамика и вычислительные алгоритмы
- Вычисление энергии связывания
Введение к работе
Органические соединения, из которых построены все организмы, присущи лишь живой природе и в современных земных условиях являются продуктами только биологической активности. Эти соединения, называемые биомолекулами, играют роль строительных блоков при образовании биологических структур; они были отобраны в ходе биологической эволюции благодаря пригодности к выполнению строго определенных функций в живых клетках. Во всех организмах эти соединения одинаковы и выполняют одни и те же функции. Для своей работы клетки должны уметь запасать и преобразовывать энергию. Основным переносчиком энергии в клетках являются молекулы АТФ, которые расщепляются до АДФ с выделением энергии. Синтез АТФ возможен при помощи мембранного белка АТФ синтетазы, который для своей работы использует электрохимический градиент на мембране. Этот градиент, в свою очередь, в некоторых бактериях создается мембранным белком бактериородопсином, который является простейшим биологическим преобразователем световой энергии в электрохимическую.
В процессе эволюции клетки научились реагировать на внешнюю среду. На внешней поверхности их мембран появились специфические распознающие участки, функции которых состоят в распознавании определенных молекулярных сигналов. Эти сигналы могут быть достаточно разными и иметь разную природу. Так, в случае хемотаксиса, клетки «чувствуют» градиент химического вещества и реагируют на него, изменяя направление своего движения. В процессе фототаксиса клетки реагируют на изменение освещенности падающего света. В 1985 году был открыт новый рецептор фототаксиса, который оказался белком гомологичным бак-териородопсину и получил название сенсорного родопсина. Этот белок улавливает квант падающего света и передает сигнал на связанный с ним двуспиральный трансмембранный белок, называемый трансдьюсером, который, в свою очередь, передает сигнал к бактериальным моторам.
Актуальность:
Основой для изучения свойств и понимания функционирования биологических объектов является их структура. Однако, несмотря на обилие структур высокого разрешения основного состояния бактериородопсина, детальный механизм работы ретиналь содержащих белков, а для сенсорного родопсина и механизм в целом, до сих пор остается непонятным. Кристаллографические данные дают статическую информацию о структуре белка. Более того, кристаллографические структуры не являются полными. Это связано с тем, что данные усредняются в течении времени сбора информации, и конечная структура представляет собой среднее положение только тех атомов, которые достаточно фиксированы в белке. Так, подвижные молекулы воды в цитоплазматической и внутриклеточной частях белка остаются неразрешенными. "Невидимые" рентгеноструктурным анализом части белка, включая молекулы воды, могут играть ключевую роль в его функционировании. Кроме того,
известно что для осуществления определенных функций динамика макромолекул может быть так же важна, как и их структура. Таким образом, дополнительная информация к кристаллографическим данным о структуре и динамике является весьма необходимой для успешного понимания их функционирования. Она может быть получена как при помощи некоторых экспериментальных методик, таких как спектроскопия ЯМР, так и используя методы компьютерного моделирования, В последнее время широкое распространение получили методы молекулярной динамики. Это связано с возросшими компьютерными мощностями, которые на настоящий момент уже позволяют моделировать процессы в достаточно крупных молекулярных системах (до миллиона атомов) с характерными временами до 1-10 наносекунд.
Основными целями настоящей работы являлись изучение механизмов транспорта протона в бактериородопсине и трансмембранной передачи сигнала комплексом сенсорного родопсина при помощи методов компьютерного моделирования: молекулярной динамики и анализа нормальных мод.
Также изучались вопросы, относящиеся к динамике этих белков.
Основные результаты работы:
Для бактериородопсина было выполнено моделирование при помощи молекулярной динамики его основного (G) и ключевого из промежуточных (М) состояний. Были исследованы распределения и динамика молекул воды внутри белка в обоих состояниях. На основании полученных распределений были построены цепочки водородных связей, соединяющие ключевые группы внутри белка с водным окружением вокруг него, и проанализирован возможный транспорт протона вдоль этих цепочек. Были найдены дополнительные молекулы воды в структуре белка, невидимые в кристаллографических структурах, которые играют важную роль в образовании сети водородных связей.
Для проверки гипотезы о трансмембранной передаче сигнала хемо- и фото рецепторами при помощи поступательных коллективных движений альфа-спиралей в настоящей работе была исследована равновесная динамика комплекса сенсорного родопсина И. Также для этого комплекса была сделана оценка электростатического вклада в свободную энергию связывания комплекса и показана важная роль электростатики в стабильности структуры.
Научная новизна работы:
В данной работе впервые были изучены основное и М состояния бактериородопсина и проведен их сравнительный анализ. Также было показано, что динамика бактериородопсина отличается в мономерном и тримерном состояниях, что продемонстрировало важность окружения белка в мембране. Впервые было изучено М промежуточное состояние белка, что позволило получить новую информацию по механизму транспорта протона.
В настоящей работе предложены новые алгоритмы определения и определены внутренние молекулы воды, что позволило объяснить проводимость протона в ци-топлазматической части белка. Кроме того, было показано наличие молекул воды и упорядоченных цепочек водородных связей во внутриклеточной части белка, что продемонстрировало возможность транспорта протона в этой части.
Впервые в М состоянии были обнаружены дополнительные молекулы воды, что позволило сформулировать новую гипотезу о возможном механизме транспорта протона в цитоплазматической части белка.
Кроме того, в данной работе предложен метод расчета нормальных мод для мембранного белка. С его помощью в комплексе сенсорного родопсина II с трансдью-сером рассчитаны колебания молекулы.
Основываясь на известных структурах, были изучены коллективные движения в мембранной части комплекса и показано что альфа-спираль ТМ2 трансдьюсера, через которую передается сигнал в цитоплазму, обладает возможностью совершать колебания в направлении нормали мембраны с амплитудой 0.5-1 А и периодом 60 ps. Данный результат говорит в пользу гипотезы механизма трансмембранной передачи сигнала с помощью коллективных движений ТМ2 [1] и впервые позволяет оценить возможное характерное время передачи сигнала.
Практическая ценность работы:
Полученные результаты позволяют сформулировать новые эксперименты для изучения функционирования белка bR. В частности, показана важность нейтроно-структурного анализа в такого рода исследованиях.
Это может быть использовано для планирования будущих нейтронографических исследований структуры кристаллов по определению подвижных молекул воды на строящимся в США новом времяпролетном источнике нейтронов.
Разработанные методы и алгоритмы моделирования мембранных белков при помощи методов МД и НМА могут быть использованы при изучении широкого класса белков.
Апробашя работы:
Основные положения работы и е результаты докладывались на следующих международных конференциях: «Workshop on Lipid-Protein Interaction», Гомадинген, Голландия, 26.03.2002; «COST D22 Workshop on Nanotechnologies of Membrane Mimetic Systems» Грац, Австрия, 11.10.2002; «COST D22 Workshop on 'Protein-Lipid Interactions'», Мадрид, Испания, 31.10.2003; «Workshop of Simulation of Protein-Lipid Interaction», Тулуза, Франция, 28.10.2004,
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
A. Baumgaertner, М. Zuvic-Butorac andS. Grudinin, Recent results from computer simulations of membrane channels and pumps, Trans World Research, Recent Research Developments in Biophysics. Vol 2, 2003; 1-18.
A. Baumgaertner, S. Grudinin, J.-F. Gwan, J.-H. Lin, Molecular Dynamics Simulation of Membrane Proteins, NIC Symposium 2004, Proceedings, Dietrich Wolf, Gemot M'unster, Manfred Kremer (Editors), John von Neumann Institute for Computing, Jiilich, NIC Series, Vol. 20, ISBN 3-00-012372-5. 2003: 365-375.
S. Grudinin, G. Buldt, V. Gordeliy and A. Baumgaertner. Water Molecules and Hydrogen-Bonded Networks in Bacteriorhodopsin - Molecular Dynamics Simulations of the Ground State and the M Intermediate, Biophys J. 2005; 88: 3252-3261.
G. Papadopoulos, S. Grudinin, D.L. Kalpaxis and T. Choli-Papadopoulou, Changes in the rate of poly(Phe) synthesis in E. coli ribosomes containing mutants of L4 ribosomal protein from Thermus thermophilus can be explained by structural changes in the pep-tidyltransferase center: A Molecular Dynamics Simulation analysis, BMC Molecular Biology in press.
Структура NpSRII/NpHtrll комплекса
Дифракция нейтронов и их неупругое рассеяние используется для исследования динамики атомов водорода и молекул воды внутри белка. Атомы водорода хорошо рассеивают нейтроны, в то время как для рентгеновских лучей они, соответственно, прозрачны. Еще одно отличие этого метода состоит в том, что рассеяние ведется на растворе белка, даже не обязательно однородном. Нейтронные эксперименты дополняют структурную картину, полученную при помощи рентгеновской кристаллографии.
Еще одним методом помимо рентгеновской кристаллографии, позволяющим получать структуры белков высокого разрешения, является ЯМР-спектроскопия [86]. В этом методе белок помещается во внешнее магнитное поле и далее измеряется спектр магнитных резонансных частот всех ядер белка. Структуры, получаемые при помощи этого метода, содержат атомы водорода. Однако из-за сложности восстановления они не идентичны, а содержат сразу несколько структур, покрывающих некоторое конформационное пространство.
Для определения химического состава белков широко используются инфракрасная и другие спектроскопии. В частности, при помощи инфракрасной спектроскопии можно найти разницу в спектрах промежуточных состояниях и приписать отдельные спектральные линии определенным связям и структурным элементам. Также используются мутации белков, пришивание определенных меток, сшивание оснований при помощи цистеинов и другие методы, которые постоянно развиваются.
В кристаллографических структурах белков часто можно увидеть разрешенные атомы кислорода воды. Так, структура бактериородопсина 1CWQ [61] содержит 77 таких атомов. В то же время в кристаллографических структурах видны только малоподвижные молекулы, или точнее, те места в белке, где вероятность нахождения атомов воды достаточно велика. Подвижные молекулы воды остаются неразрешенными. Так, в случае бактериородопсина, было опубликовано множество работ о внутренних молекулах воды, определенных при помощи нейтронного рассеяния [87-90], а также при помощи магнитной релаксационной дисперсии [91]. Все авторы сходятся к тому, что число этих молекул больше, чем видно в кристаллографических структурах, но точное их количество остается неизвестным.
Средние времена жизни молекул воды на поверхности биомолекул и биомолекулярных комплексов (таких как рибонуклеаза А, лизоцим, миоглобин, трипсин, сывороточный альбумин) и в их полостях были измерены при помощи 170 спиновой релаксационной дисперсии [92-95]. Показано, что времена, на которых молекулы воды проникают в белок или обмениваются с внешней водой при нормальных условиях, лежат в пределах 10-50 ps для воды, связанной в поверхностных полостях [96], 0.1-1 ps для прочно связанной воды [97,98], и от наносекунд до миллисекунд для внутренних молекул воды [91,95].
При помощи ЯМР экспериментов было найдено, что гидрофобные полости человеческого интерлейкина-1В содержат от двух до четырех молекул воды, живущих в белке более 1 ns [99]. Эти молекулы воды не были видны на кристаллографических структурах высокого разрешения, так как молекулы воды со среднеквадратичным отклонением 1А практически не дают вклада в рентгеновский дифракционный спектр высокого разрешения [100]. Однако, тщательный анализ данных низкого разрешения показал, что разупорядоченные молекулы воды, найденные в работе [99] действительно присутствуют в структуре и было сделано предположение, что в большинстве случаев гидрофобные полости, наблюдаемые в структурах, заполнены разупорядоченной водой [100].
Для предсказания динамики белковых молекул на временах порядка ps-ns в настоящее время широко применяются методы компьютерного моделирования. Различные методы молекулярной динамики (МД) позволяют с определенной точностью описывать динамику различных молекулярных систем, от небольшого кластера воды для квантовой МД [101] до огромных молекулярных комплексов, таких как олигомерные белки в мембране с водой [102-104] или рибосомальный комплекс 70S, содержащий около 2 млн атомов [105], для классических методов МД.
Методы компьютерного моделирования также успешно использовались в таких направлениях, как предсказание пространственной структуры белка по его первичной последовательности [106,107], различные методы оптимизации структур [108,109], предсказание зарядовых состояний групп [110-112], предсказание энергии связывания различных биомолекул [113,114], предсказания эластичности молекулярных фрагментов [115,116] и многих других.
МД уже успешно применялась для исследования распределения молекул воды внутри белков, [103,104] и ссылки далее. В работе [103] исследовалось распределение молекул воды внутри тримера бактериородопсина. Были показаны плотности воды внутри белка и посчитаны вероятности образования водородных связей основаниями, расположенными рядом с цитоплазматической и внеклеточной поверхностями. В работе [104] исследовалась динамика молекул воды в цитохром с оксида-зе. Было показано, что количество внутренних молекул воды намного больше чем в кристаллографической структуре, а также были исследованы соответствующие цепи водородных связей.
Белок бактериородопсин, структура которого была решена в 1990 году [47], является объектом постоянного интереса для групп, занимающихся компьютерным моделированием. В 1995 году вышла работа по МД бактериородопсина, в которой изучались мономер и тример с мембраной и без [117]. В работе были исследованы детали структуры, построены фазы рассеяния и исследованы флуктуации белка и мембраны. В работе [118] при помощи МД на тримере бактериородопсина были исследованы структурные изменения в белке после изомеризации ретиналя. В работах [37-39] при помощи гибридной классической/квантовой МД были исследованы структуры окружения ретиналя в первых стадиях фотоцикла бактериородопсина. В работе [103] по МД тримера бактериородопсина в мембране акцент был сделан на водном кластере и его сети водородных связей около оснований Glul94 и Glu204 во внеклеточной части белка. В работе [40] при помощи нахождения путей наименьшей энергии между структурами бактериородопсина были показаны возможные пути транспорта протона на ранних стадиях фотоцикла.
Ложные вращения и движения вне плоскости
Молекулярная механика работает с системами размера до миллиона атомов. Для больших систем параметризация зарядов производится путем разбивки системы на маленькие компоненты. В случае белковых молекул они разбиваются на отдельные пептиды. Наборы точечных зарядов, полученные после фитирования потенциалов, очень сильно зависят от базисных наборов, из которых формируются волновые функции для вычисления потенциалов эмпирическими методами. Более того, заряды часто не улучшаются при использовании более полных базисных наборов. Для белковых систем обычно вычисления проводятся в достаточно маленьком базисе 6-31G , который для вычислений в вакууме дает точечные заряды, завышенные примерно на 10-20% [150] по сравнению с вычислениями в полном базисе. Поэтому вычисления 6-31G базисом в вакууме приблизительно соответствуют вычислениям при помощи полных базисов белковых систем в водном окружении (с диэлектрической проницаемостью 10-80).
Некоторые силовые поля позволяют распределению зарядов меняться во времени. Это может быть сделано путем помещения фиксированного заряда на мнимый атом, соединенный каким-либо образом с молекулой (например, как в моделях воды TIP4P и BF [151]), а также путем включения поляризации для атомов (как в поле AMBER02 [152,153]). Внешнее электрическое поле наводит в среде диполи с дипольными моментами и ш, пропорциональными напряженности поля Е: »М=«Е (17) Энергия взаимодействия наведенных диполей со внешним полем определяется как; v(a,E)=-SE0dEv =-J E«E=ya2 (18)
Следует отметить, что включение поляризуемости для молекулы А вызовет наведенную поляризуемость в молекуле Б, которая, в свою очередь, опять сделает вклад в поляризуемость А. Вычисления поляризуемости проводятся итеративно, пока изменение диполя между итерациями не станет достаточно мало. Такие вычисления проводятся по следующей схеме: сначала вычисляются наведенные диполи на атомах ііш=и.ЕІУ где «, - это поляризуемость отдельного атома, считающаяся изотропной. Потом вычисляется полная энергия на атоме /, как векторная сумма всех вкладов: гЕ +Ем (з -1) (19)
Эти два шага повторяются несколько раз, пока изменение энергии не станет достаточно малым. Сходимость метода ускоряется, если результаты вычисления наведенных диполей на каждом шаге используются как начальные значения наведен ных диполей на последующем шаге. Данный метод реализован в пакете AMBER8 [154].
Рассмотрим дисперсное взаимодействие (взаимодействие возникающее благодаря диполям, возникающим из-за флуктуации электронных облаков) двух ядер заряда +q на расстоянии г, окруженных электронными облаками заряда -д. Отрицательные заряды гармонически колеблются с частотой со около ядер. Если жесткость такого осциллятора к и масса заряда т, то потенциальная энергия каждого осциллятора будет равна — kz , где z - это расстояние между ядром и зарядом. Уравнение Шредингера для каждого осциллятора запишется как: — Ь 6 ф 1,2 - ,,п, +-кг?Ф=Ец/ (20) 2т dz2 2 v J Решением такого уравнения является энергия Ev={v+—)Hw. Когда два таких осциллятора находятся достаточно близко, возникает диполь-дипольное взаимодействие с энергией [155]: , -3« На При включении взаимодействий высших порядков выражение (21) приобретает вид: )=-У-1+С-То+- (22) г г г где все коэффициенты С отрицательны. Для описания эффекта обычно первого члена в разложении оказывается достаточно.
При сближении двух атомов начинается перекрывание их электронных облаков и согласно принципу Паули, запрещающему двум электронам находится в одной и той же конфигурации, возникает смещение плотности электронов и отталкивание ядер на маленьких расстояниях. На очень маленьких расстояниях энергия отталкивания имеет вид 1/г из-за кулоновского отталкивания ядер с деформированными электронными оболочками, на дальних расстояниях эта энергия спадает экспоненциально как ехр(-2/7а0)? где «о - это радиус Бора.
В молекулярном моделировании сумма притягивающего и отталкивающего членов представляется обычно в виде потенциала Ленарда-Джонса: v(r)=4e[[r-{f] (23) с двумя параметрами а- - диаметром соударения (расстоянием, на котором энергия равна нулю) и є - глубиной потенциальной ямы. Член г12 не имеет теоретического обоснования, но несмотря на это этот потенциал в силу простоты вычислений широко используется в моделировании. Существует также несколько более точных выражений для потенциала, но они пока не используются в аналитических силовых полях.
Для системы, состоящей из N типов атомов, требуется N(N-l)/2 наборов параметров взаимодействия между ними. Определение параметров ван-дер-Ваальса не является легкой задачей и поэтому обычно параметры взаимодействия пары атомов получают из параметров самих атомов используя правила смешивания. Диаметр соударения (тлд для атомов А-В равен среднему арифметическому диаметров самих атомов, и глубина ямы еАВ задается средним геометрическим: "АВ АА В (24) АВ " АА ВВ =V e„ (25)
Параметры взаимодействий ван-дер-Ваальса могут быть получены несколькими путями. В старых силовых полях использовались экспериментальные данные, полученные анализом кристаллографических структур и их упаковки. В современных силовых полях параметры определяются из молекулярного моделирования жидкостей и подстраиваются так, чтобы моделирование воспроизводило набор термодинамических свойств этих жидкостей.
Молекулярная динамика и вычислительные алгоритмы
Как было описано выше, все молекулы воды внутри белка были разделены на связанные и подвижные. Пример траектории подвижных молекул воды показан на рис. 19. На этом рисунке приведены Z-траектории трех молекул воды. Горизонтальные линии обозначают примерное положение липидных голов мембраны. Молекула воды номер 3, находившаяся внутри белка в момент начала моделирования, покинула его Через 1500 pS. Рисунок 19: Z-траектории трех подвижных молекул воды. Гори М0ЛЄКУла ВОДЫ НОМер 2 ПрОНИКЛа нтаяъными линиями обозначены средние положения полярных J ллл голов мембраны. в белок через 1000 ps после начала моделирования и оставалась внутри до конца моделирования. Молекула воды номер 1 проникла внутрь и через какое-то время покинула белок. Также было посчитано количество связанных и подвижных молекул воды с течением времени. Число связанных молекул воды не меняется со временем и равно 20, в то время как распределение числа подвижных молекул воды N {t) показано на рис. 20. Из этого рисунка среднее число молекул воды в белке (N{ (t)) равно 24.
Связанные молекулы воды также могут совершать движения вокруг своих позиций. Так, на рис. 21 показана динамика водного кластера, расположенного рядом с ретиналем. Из рисунка видно, что в течении определенного момента времени молекулы воды 401 и 402 меняются местами. Такое поведение молекул говорит о том, что определенные места в белковой молекуле, всегда занятые молекулами воды, как видно кристаллографически, могут обмениваться этими молекулами.
Равновесное распределение молекул воды в бактериородопсине показано на рис. 22. На этом рисунке изображена плотность распределения связанных и подвижных молекул воды Njz) по отношению к оси z, т.е. среднее число молекул воды в слое белка толщиной б а = 1 А. Центр отсчета z = 0 совмещен с центром масс белка, который находится близко к Шиффовому основанию с z = -2,7 А, Из распределе ния подвижных молекул воды на рис. 22 видно, что центральная часть белка остается недоступной для подвижной воды. 3000 t[ps] Также интересно сравнить распределение воды в кристаллографической структуре с распределением, полученным в результате моделирования. Такое сравнение приводится на рис. 23. Сплошная линия показывает распределение воды при моделировании (по-движной+связанной), общее количество молекул воды равно 44. Пунктирная линия показывает распределение воды в кристаллографической структуре [61], общее число молекул воды равно 18.
Оба распределения СОВПадаЮТ ПО Рисунок 20: Число подвижных молекул воды N (?) как функция форме, ХОТЯ И Значительно ОТЛИЧа- времени Горизонтальная линия показывает среднее число моле-ЮТСЯ ПО КОЛИЧеСТВу МОЛекуЛ ВОДЫ, кулводы (#0(,)) = 23.6. N если проинтегрировать эти распределения. Одно из объяснений такой большой разницы в количестве молекул воды состоит в высокой скорости обмена молекул воды с окружающим резервуаром. Поэтому далее будут даны динамические характеристики распределения воды. 2500 3000 На рис. 24 показано количе ство внутренних молекул воды Аг/(0 в определенном ансамбле, все еще находящихся внутри белка после времени t по строенное как описано в 2.9.5 и усредненное по всем ансамблям. ., , W3 рИС. Z4 ВИДНО ДВа режима — Рисунок 2 1: Z-траектории связанных молекул воды внутри бактерио-ДЛЯ боЛЬШИХ t 100 PS фуНКЦИЯ родопсина. Номера молекул воды даны как в структуре 1СЗW [240]. ведет себя экспоненциально: -г/т ), t 100ps (164) Л«» ехр( где время обмена r lSOps характеризует временную эволюцию диффузных процессов внутри белка. Для малых времен / 100 функция ведет себя как: Из этого распределения был получен закон затухания времени жизни молекулы: » 0 С KT.O00/W (166) Для этого распределения было также посчитано среднее время жизни, как показано в 2.9.5, (rJ S2pS .
Для цитоплазматической части белка произведен анализ молекул воды и цепочек водородных связей методами, описанными в 2.9.3-2.9.5. Найдены цепочки водородных связей, соединяющие ключевые основания с внешней водой уже в основном состоянии фотоцикла белка. На рис. 26 показаны вероятности образования цепочек водородных связей между различными ключевыми группами в цитоплазматической части bR друг с другом и с внешним окружением. Обозначения OD, О и Н соответствуют атомам 5 -кислорода, кислорода и водорода, соответственно. Так как каждое основание может быть соединено с внешней водой многими путями, вероятность его протонирования подсчитать достаточно сложно. Однако в случае схемы, показанной на рис. 26 можно посчитать вероятности протонирования отдельных оснований в предположении, что все указанные на рисунке вероятности независимы. Под вероятностью протонирования здесь понимается вероятность образования цепочки водородных связей до поверхности белка. Так, для Asp38,OD вероятность протонирования будет равна рх+{1-р Ргрг, где р, - это вероятность связи между
Вычисление энергии связывания
Для новой структуры комплекса [260] было произведено наложение и выравнивание структур двух состояний (G и М), после чего был определен вектор перехода из одного состояния в другое. Далее искались совпадения по направлению этого вектора с масс-нормированными векторами нормальных мод, вычисленными для G-состояния. Для этого находились коэффициенты вовлечения, как показано в (152). Эти коэффициенты приведены в третьем и четвертом столбцах таблицы 8. Коэффициент равный 1 означает полное совпадение вектора нормальной моды с вектором смещения, равный 0 означает перпендикулярное к вектору смещения движение. Все посчитанные коэффициенты меньше значения 0.05, что говорит о плохом совпадении направления нормальных мод со смещением в конформации белка в следствие того, что низшие нормальные моды представляют лишь коллективные движения молекулы, в то время как в переходе между структурами G— М отображены все изменения. Далее были посчитаны коэффициенты вовлечения только для атомов основной цепи. Результаты приведены в столбцах 5 и 6 таблицы 8. Эти коэффициенты уже больше чем посчитанные для всех атомов. Так, для низшей моды данный коэффициент больше в 3 раза. Коэффициенты вовлечения нормальных мод с 6 по Nm0de как функция Nmode также показаны на рис. 44.
Если предположить, что низшие моды колебания молекулы уже задают направление структурных изменений в сигнальном состоянии, то нужно ожидать корреляции коэффициента вовлечения со смещением спирали Htrll (столбцы 5 и 7 Таблицы 8Ї Пгтиняк-лип кит? чения обоих значений имеет только самая низшая мода колебаний (номер 6) и моды 12 и 14. При детальном рассмотрении оказывается, что в моде 12 движутся только атомы трех последних оснований конца спирали Htrll, не имеющих вторичной структуры, поэтому нужно оставить только моды 6 и 14. В обоих модах движение спирали происходит поступательно вдоль нормали к мембране. Это говорит о возможности поршнеобразного механизма передачи сигнала комплексом SRII-Htrll в его сигнальном состоянии [1].
Вычислением энергии связывания комплекса SRII-Htrll путем численного решения уравнения Пуассона-Больцмана была показана решающая роль электростатических взаимодействий в объединении рецептора с трансдьюсером. Учет только электростатических взаимодействий дает разницу энергий связывания между G и М равную 4.8 kcal/mol, которая сравнима с экспериментальными значениями 3 kcal/mol [80,128,129].
При помощи анализа системы методом Нормальных Мод были получены равновесные смещения спирали Htrll. Оказалось, что всего несколько низших мод приводят к поступательному движению этой спирали с высокой амплитудой 0.5-1 А, что сравнимо с экспериментальными значениями в сигнальном состоянии водорастворимой части хеморецептора (1-2 А [1,265]). При помощи сравнения коэффициентов вовлечения нормальных мод в переход между G и М состояниями были получены две моды, которые вносят основной вклад одновременно в движение спирали Htrll и переход G— М. Было найдено, что эти две моды возбуждают поступательные движения в Htrll, направленные вдоль нормали к мембране. Это говорит о возможности поршнеобразного механизма передачи сигнала комплексом SRII-Htrll в его сигнальном состоянии.
Метод численного решения уравнения Пуассона-Больцмана является единственным на сегодняшний день точным методом учета наличия границ разделов сред с различными значениями диэлектрической проницаемости в системе. Тем не менее в нем достаточно много допущений. Так, в стандартной его формулировке (60) не учитываются граничные силы (это можно обойти при помощи (63)). При высоких концентрациях ионов начнут появляться ион-ионные взаимодействия, которые также не учитываются данным методом. Также существуют некоторые трудности при расставлении зарядов на сетку, подборе сетки и учете гидрофобных взаимодействий. Хороший обзор всех проблем и методов их решения дан в [161].
Метод вычисления нормальных мод для белковых систем является достаточно трудоемким, так как затраты памяти растут как N3 от количества атомов в системе N. В нашем случае являлся критичным выбор полного базиса, так как предварительные тесты показали, что на упрощенных базисах вектора нормальных мод выглядят совершенно иначе. В данной работе метод нормальных мод применялся к мембранному белку, который был минимизирован в вакууме. Для определения направлений векторов нормальных мод нашей системы этот метод применим, в то время как значения частот колебаний он правильно дать не может.
В дальнейшем нами планируется модернизация метода вычисления нормальных мод для его применения к мембранным белкам. Для этого расчитываются поправки к вакуумному Гауссиану за счет внешней воды и мембранного окружения. Планируется добавить поправку за счет вязкости воды, которая приводит к решению уравнения Ланжевена [264], а также электростатическую поправку из-за наличия границ сред с различными диэлектрическими проницаемостями. Последняя поправка к Гессиану считается путем двойного численного дифференцирования энергий, получаемых в уравнении Пуассона-Больцмана. Сложность данного метода заключается в написании эффективного интегратора для минимизации структуры с внешними поправками из уравнения Пуассона-Больцмана.
При появлении новых структур высокого разрешения для комплекса NpSRlI-NpHtrll планируется продолжить анализ структуры этого белка при помощи вычисления низших нормальных мод его колебаний. Также планируется изучить структуры мутантов и сравнить их с дикими состояниями.
Основные результаты работы состоят в следующем. Разработаны новые методы и алгоритмы определения, описания и характеристики динамики и распределения молекул воды внутри белковых молекул. Предложены методы вычисления нормальных мод для определения тепловых колебаний наибольшей амплитуды в мембранных белках.
Путем моделирования мембранного белка бактериородопсина мономера и тримера основного и М-промежуточного состояний обнаружены новые детали структуры белка, не видимые экспериментально.
При вычислении и анализе нормальных мод комплекса SRII-Htrll были обнаружены колебания низкой частоты, отвечающие за переход между конформациями G—»М и за смещение спирали Htrll. Оказалось, что смещение данной спирали происходит поступательно в направлении нормали мембраш. Амплитуда смещения равна 0.5-1 А для 1-20 первых нормальных мод. Это говорит о возможности поршнеобразного механизма передачи сигнала комплексом, а также указывает на колебания, которые нужно возбудить в сигнальном состоянии для больших смещений спирали Htrll.
