Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА II. Структурная организация трансмембранных (тм) а-спиральных димеров: современное состояние проблемы 9
II. 1. Общие принципы организации а-спиральных комплексов в липидном бислое 9
II.1.1 Геометрические аспекты упаковки спиралей 9
Н.1.2. Гидрофобная/гидрофильная организация комплексов 11
II. 1.3. Особенности взаимодействия а-спиралей с границей раздела мембрана/вода 12
II.1.4. Резюме 14
II.2. Перспективные а-спиральные димеры — уроки экспериментального изучения 14
Н.2.1, Гликофорин А человека 14
П.2.2. Рецепторы тирозин-киназы ErbB/Neu 19
П.2.3. ТМ сегмент белка BNIP3 семейства BCL-2 28
П.З. Методы компьютерного моделирования а-спиральных комплексов 32
11.3 Л. Метод молекулярной динамики в «вакууме» с отжигом 32
II.3.2. Моделирование с использованием неявно заданных моделей мембраны 34
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 39
III. 1. Разработка методики моделирования пространственной структуры а-спиральных
димеров в мембранном окружении на примере димера гликофорина A (GpA) 39
Ш.1.1. Подбор оптимальных характеристик моделей, имитирующих влияние мембраны, для изучения ассоциации мономеров GpA 39
III. 1.1.1. Моделирование в «вакууме» (мономер и димер GpA) 39
ПІЛ.1.2. Взаимодействие а-спиральных сегментов в мембранах разной толщины без приложенного ТМ потенциала 42
Ш.1.1.3. Резюме 48
Ш.1.2. Моделирование с приложенным ТМ потенциалом 49
III. 1.2, Влияние ТМ потенциала на ориентацию а-спиралей в комплексах 49
III. 1.2.2. Энергетические особенности полученных классов олигомерных состояний54 НІЛ .2.3. Сравнительный анализ моделей димера, полученных с помощью спектроскопии ЯМР и рассчитанных методом Монте-Карло 59
III.1.2.4. Гидрофобная организация tx-спиральных димерных комплексов GpA 62
III. 1.2.5. Модель димера, установленная методом спектроскопии ЯМР: поведение в неявно заданном мембранном окружении 64
III. 1.2,6, Энергетические аспекты димеризации 65
III, 1.2.7. Влияние толщины мембраны на упаковку димерных состояний 68
III, 1.2.8, Влияние степени гидрофобности мембраны на результаты моделирования. 69
Ш.1.2.9. Мутагенез insilico, влияние точечных мутаций на димеризацию GpA 74
ПІЛ .2.10. Резюме 76
Ш.2. Изучение димеризации ТМ сегмента белка BNIP3 методом Монте-Карло в неявно заданной мембране 77
Ш.2.1 Характер взаимодействия мономера BNIP3 с мембраной: роль заряженных остатков на концах 77
Ш.2.2. Гидрофобные/гидрофильные свойства ТМ сегмента BNIP3 80
ІІІ.2.3. Расчет димерных состояний BNIP3 с применением ограничений 82
Ш.2.4. АЪ initio моделирование димера BNIP3: роль остатка Hisl73 в димеризации 83 Ш.2.5. Мутагенез in silico: поиск гомологов ТМ пептида BNIP3, способных к эффективной димеризации 90
III.2.6. Резюме 94
ГЛАВА IV. Заключение 95
IV. 1. Обзор проведенных исследований и полученных результатов 96
IV.2. Научно-практическое значение работы 97
IV.3. Перспективы 97
ГЛАВА V. Методы 98
V.I. Вычислительные протоколы 98
V.2. Гетерогенная модель мембраны 103
V.3. Метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) 104
Список литературы
- Особенности взаимодействия а-спиралей с границей раздела мембрана/вода
- Подбор оптимальных характеристик моделей, имитирующих влияние мембраны, для изучения ассоциации мономеров GpA
- Модель димера, установленная методом спектроскопии ЯМР: поведение в неявно заданном мембранном окружении
- Гетерогенная модель мембраны
Введение к работе
Исключительно важная роль мембранных белков (МБ) в клетке обусловлена их способностью детектировать и передавать сигналы через липидный бислой, осуществлять транспорт ионов и различных веществ, участвовать в слиянии мембран и т.п. Кроме того, 30% всех белков, кодируемых целыми геномами, способны взаимодействовать с мембранами (Wallin et al., 1998; Arldn et al., 2002). Понимание связи между структурой МБ и их функцией представляет собой одну из актуальных и интереснейших задач структурной биологии. Решение указанной проблемы имеет и большой практический интерес. В частности, МБ являются привлекательными объектами для создания новых лекарственных препаратов ( 50% всех представленных на рынке лекарственных препаратов направлено па взаимодействие с МБ), осуществляющих коррекцию передачи сигнала через мембрану (взаимодействие с мембранными рецепторами, модификацию проводимости ионных каналов). Указанные процессы являются ключевыми при развитии ряда заболеваний. Многие такие белки содержат в своих мембранных доменах несколько участков полипептидной цепи и/или функционируют в олигомерных состояниях - в виде димеров, тримеров и т.д. Механизмы ассоциации и межбелкового узнавания, играющие важную роль в ряде клеточных процессов (Harder et al., 2003; Ubarretxena-Belandia & Engelman, 2001), являются ключом для понимания функционирования белковых-.: комплексов. В связи с этим, большой интерес представляют задачи по изучению детальных молекулярных механизмов межбелковых взаимодействий в такой гетерогенной среде, какой является липидный бислой. Получение структурной информации о процессах олигомеризации белков в мембранах с помощью современных экспериментальных методов крайне затруднено из-за больших сложностей с выделением, очисткой, приготовлением образцов (Liang et al., 2002). Многообещающей альтернативой в решении данной проблемы является применение методов компьютерного моделирования.
Наиболее подходящими объектами для разработки и тестирования таких методов являются а-спиральные комплексы в мембранах. Эти системы достаточно стабильны и состоят из гидрофобных и/или амфифильных а-спиралей. Последние представляют наиболее часто встречающийся структурный элемент в мембранных доменах белков, ответственный за их связывание с липидным бислоем. Взаимодействия между мембраносвязанными а-спиралями обеспечивают функциональную активность огромного числа белков и пептидов. Среди них - интегральные мембранные рецепторы (например, семейство рецепторов, чье действие опосредовано G-белками, рецепторы гормонов, компоненты сенсорных систем), разнообразные ионные каналы (АТФазы, калиевые каналы, лиганд-зависимые ионные каналы) и молекулярные транспортеры, дефензины, мембрапо-активные пептиды, обладающие антибактериальной, фузогенной, мембрано литическои активностью и др. (Efremov et al., 2004). В настоящее время расшифрованы пространственные структуры около 50 белков, имеющих в своем составе комплексы трансмембранных (ТМ) сс-спиралей (сайт http://blanco .biomol.uci.edu/Membrane_Prote і ns_xtal .html)).
Появление пространственной модели ТМ димера гликофорина А человека (GpA) стимулировало разработку теоретических методов исследования взаимодействия а-спиралей в мембранных доменах белков (см. разд. И.З), т.к. появилась возможность сравнения результатов расчетов с экспериментом. Эти работы можно разбить на три группы: 1) Подходы, основанные на расчетах энергии спираль-спиральных взаимодействий. При этом жестко фиксируется сс-спиральная структура, и расчеты проводят либо в «вакууме», либо в однородной среде с низкой диэлектрической проницаемостью (см. разд. П.3.1); 2) Методы, использующие статистические данные по взаимодействию аминокислотных остатков а-спиральных пучков в белках с известной пространственной структурой (см. разд. П.3.3); 3) Моделирование, основанное на учете мембранного окружения неявным образом, например, с помощью обобщенной модели Борна, с использованием энергии поверхностного натяжения и др. (см. разд. П.3.2) (В дальнейшем термин «мембрана» будет употребляться и для математических моделей, , имитирующих влияние мембранного окружения). Поскольку в настоящее время предпринимаются лишь первые попытки создания указанных подходов, предлагаемые методики характеризуются целым рядом ограничений. Так, в методах первой группы, ввиду отсутствия гетерогенного мембранного окружения, «естественным образом» стабилизирующего а-спиральную конформацию ТМ участков субъединиц, приходится вводить искусственные ограничения, предотвращающие дестабилизацию спирали. Как будет показано в настоящей работе, в этих случаях нет возможности выявить специфичность взаимодействия спираль-спираль (см. разд. III. 1.1). Кроме того, ограниченное число доступных пространственных структур делает трудновыполнимой задачу использования статистики для предсказания спираль-спиральных контактов (методы группы 2). Наиболее перспективными являются подходы с использованием моделей неявно-заданной среды. С их помощью недавно были получены интересные результаты для ряда а-спиральных димеров (Ducarme et al., 2000; Im et al., 2003). Авторам удалось осуществить моделирование ассоциации спиралей в гетерогенном мембранном окружении без «стягивающих» межмономерных ограничений. Вместе с тем, следует отметить и ряд серьезных допущений, сделанных в этих работах. Так, ТМ сегменты заведомо располагали в гидрофобном слое мембраны, в ориентации «голова к голове», что не дает возможности проанализировать энергетические характеристики встраивания пептидов в мембрану. Кроме того, авторы избегают вопроса о роли заряженных остатков на концевых участках пептидов (Im et al., 2003).
В данной работе предлагается метод моделирования а-спиральных димерных комплексов в мембранном окружении, основанный на поиске наиболее энергетически выгодных состояний системы «спираль-спираль-мембрана» методом Монте-Карло (МК). Важно отметить, что вычисления проводятся без применения каких-либо ограничений. Метод МК позволяет эффективно исследовать кон формацио иные возможности полипептидной цепи небольшой системы, состоящей из двух а-спиральных сегментов. Ключевым моментом в предлагаемой методике является применение модели неявно заданной мембраны, основанной на совместном использовании атомных параметров сольватации для воды и углеводородов, описывающих гидратированные полярные группы и ацильные цепи липидов, соответственно (Efremov et al., 2001). Данная модель обладает высокой вычислительной эффективностью и хорошо себя зарекомендовала при описании основных особенностей взаимодействия белок-мембрана. Так, применение МК метода в совокупности с неявно заданной моделью мембраны позволило адекватно описать особенности взаимодействия целого ряда пептидов и белков с различным типом укладки полипептидной цепи (а-спиральные, р- и а/р-структурные) и с различным характером связывания с мембраной (ТМ, периферические).
Работа состоит из трех частей. В первой рассматривается, каким образом окружение с разными характеристиками влияет на ассоциацию белковых субъединиц. Вторая часть посвящена описанию результатов моделирования структуры димера GpA в гетерогенном мембранном окружении и сравнению результатов расчетов с известными экспериментальными данными. Сделан вывод о том, что разработанный подход позволяет адекватно описать структуру димера GpA в мембрано-подобном окружении. В третьей части показано применение разработанной методики для изучения возможных механизмов димсризации ТМ сегмента белка BNIP3, пространственная структура которого еще не установлена. Полученные модели комплексов хорошо согласуются с данными мутагенеза.
Научная новизна.
В ходе выполнения работы был впервые создан комплекс новых вычислительных методик и компьютерных программ, позволяющих получать информацию о структуре белок-белковых комплексов в липидном бислое. Кроме того, применение разработанных оригинальных подходов к анализу димерных структур помогло установить ряд факторов и закономерностей, имеющих фундаментальное значение для понимания особенностей димерной организации и функционирования белков. Среди них: механизм взаимодействия ТМ а-спиральных пептидов, взаимосвязь между гидрофобной/гидрофильной организацией пептидов и их укладкой в димере, физические принципы встраивания а-спиральных пептидов в мембранное окружение, энергетические аспекты димеризации в «бислое» и др.
Основные результаты.
1. Исследована роль гетерогенного, полярно-неполярного, растворителя при моделировании белок-белковых взаимодействий. Выводы: а) Моделирование без учета эффектов среды не позволяет корректно описать поведение двух ТМ а-спиралей GpA; б) Присутствие второго пептида при расчете МК двух мономеров GpA в «вакууме» стабилизирует а-спиральную структуру мономеров за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Однако полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах. Кроме того, не наблюдается специфичности межепиральньгх контактов.
2. Исследованы механизмы ассоциации пептидов в гетерогенном мембранном окружении. Выводы: а) Моделирование пептидов GpA в мембране без приложенного ТМ потенциала показало, что пептиды, сохраняя а-спиральнуїо структуру, располагаются в ТМ положении, образуя димеры как в ориентации «голова к хвосту», так и в ориентации «голова к голове». Найдена только одна группа структур с антипараллелыюй ориентацией пептидов хорошо коррелирующая с данными мутагенеза (GPAMKU); б) При расчете с разной толщиной мембраны наблюдается эффект подстройки димера GPAMKU П°Д толщину гидрофобного слоя без нарушения межспиральных контактов; в) Субъединицы в комплексах обладают а-спиралыюй структурой при толщине мембраны D ЗбА, при дальнейшем увеличении толщины наблюдаются нарушения а-спиральной конформации.
3. Димеры GpA в мембране с приложенным потенциалом. Выводы: а) Пептиды, сохраняя а-спиральиую конформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении и образуют димеры в ориентации «голова к голове»; б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо согласуются с данными мутагенеза; в) найдена группа состояний с правой закруткой, по параметрам упаковки близкая к экспериментально установленной димерной структуре (GpAaMp); г) Наблюдается группа плотно упакованных димерных структур с левой закруткой, также хорошо согласующаяся с данными мутагенеза и удовлетворяющая ограничениям на расстояния, полученным методом спектроскопии ЯМР (MacKenzie et al., 1997); д) Исследованы энергетические аспекты встраивания а-спиралей в мембрану и их олигомеризации, проведен анализ особенностей образования лево- и правозакрученных димерных упаковок, рассмотрено влияние мутаций на упаковку димера и т.д. Таким образом, впервые предложена методика моделирования димерных комплексов в мембранном окружении.
4. Разработанная методика применена для моделирования димера с неизвестной пространственной структурой - ТМ сегмента белка BNIP3. Выводы: a) АЬ initio поиск низкоэнергетических состояний выявил несколько возможных групп димерных состояний как с правой, так и с левой закруткой. Наблюдается высокая корреляция с данными мутагенеза; б) Сделан вывод о роли состояния ионизации остатка H1S173 в ассоциации а-спиралей; в) Предложены мутантные формы BNIP3 с потенциально более высокой, чем в белке дикого типа, димеризационной способностью.
Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I) сформулированы основные цели и задачи, их взаимосвязь с общими тенденциями развития моделирования олигомерных взаимодействий в а-спиральпых комплексах. Глава II представляет собой обзор литературы, посвященный известным теоретическим моделям упаковки спиралей, наиболее изученным экспериментально димерным комплексам, в том числе и представляющих интерес для биомедицинских применений. Полученные результаты и их обсуждение представлены в Главе III, состоящей из 2-х разделов. В разделе ПІЛ на примере димера GpA показана поэтапная разработка методики моделирования димерных комплексов в гетерогенном мембранном окружении. В разделе III.2 предложенный подход использован для исследования возможных механизмов димеризации ТМ сегмента белка BNIP3, пространственная структура которого еще не установлена. Глава IV (Заключение) содержит перечень основных результатов работы, обсуждение их научно-практического значения, а также дальнейшие перспективы исследований в данной области. Описание методов, использованных в работе, дано в Главе V. Завершает диссертационную работу Список литературы.
Основные результаты работы изложены в одной статье, опубликованной в Journal of Chemical Theory and Computation, а также в 11 тезисах всероссийских и международных конференций. Направлено в печать две статьи.
Особенности взаимодействия а-спиралей с границей раздела мембрана/вода
Гликофорин А - один из двух главных белков, выступающих на внешней поверхности эритроцитов человека. Он оказался первым мембранным белком, для которого была определена полная аминокислотная последовательность. Гликофорин представляет собой небольшой ТМ гликопротеин (131 аминокислотный остаток), большая часть массы которого находится на наружной поверхности мембраны, где локализован и его гидрофильный N-концевой участок. Гидрофильные С-концевые «хвосты» гликофорина погружены в цитозоль, а гидрофобный а-спиральный участок (73-96) пронизывает липидный бислой (Adair & Engelman, 1994). Несмотря на то, что в клетках содержится много молекул гликофорина (более 6-Ю5), их функция остается неизвестной. Более того, люди, в эритроцитах которых отсутствует большинство этих молекул производят впечатление совершенно здоровых. Гликофорин обнаружен только в эритроцитах, хотя в структурном отношении его можно отнести к общему классу мембранных гликопротеинов, пронизывающих бислой в виде одиночной а-спирали. Гликофорин Л образует стабильные димерные комплексы. Система из двух а-спиралей представляет собой наиболее простую модель для изучения механизма ассоциации и узнавания а-спиральпых субъединиц в мембрано-подобном окружении как экспериментальными так и теоретическими методами.
Методом направленного мутагенеза был выявлен ряд остатков, влияющих на димеризацию (Lemmon et al., 1992). Так, остатки, оказывающие наиболее сильное влияние на ассоциацию GpA мономеров, определяют спираль-спиральные контакты в димерном комплексе. Суммарный анализ относительной величины влияния данных мутагенеза на димеризацию (Рис.И.2) с помощью Фурье-анализа (Рис.П.З) позволил выявить периодичность в расположении остатков, влияющих на образование димера: 3,9-4,0 остатка на виток, а также рассчитать угол 0/2 между осью спирали и линией, соединяющей остатки, наиболее важные для димеризации. В результате было показано, что димер представляет собой суперспираль с правой закруткой и углом 0 —40 между осями а-спиралей, то соответствует геометрической укладке і, і+4 (см. разд. П.2.1) (Рис. П.4). Аминокислотная последовательность, обусловливающая димеризацию по данным такого анализа, может быть представлена в виде: LIxxGVxxGVxxT, где х обозначает любой остаток. В экспериментах по внедрению данного шаблона в другие гидрофобные ТМ сегменты было показано, что данный мотив вызывает димеризацию (Lemmon et al., 1994).
С помощью глобального конформационного поиска в «вакууме» с «моделируемым отжигом», выполненного методом молекулярной динамики (МД), и опираясь на данные мутагенеза, была предложена модель пространственной структуры димера (см. разд.И.3.1). Позже, с помощью ограничений, полученных методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в мицеллах додецилфосфотидилхолина ДФХ (MacKenzie et al., 1997) и в липидных бислоях (Smith et al., 2001), была предложена трехмерная модель димера GpA в виде правой суперспирали. Модель оказалась очень близка к рассчитанной ранее методом МД. Так, среднеквадратичное отклонение, вычисленное по тяжелым атомам на участке 74-91, составило 0.8 А. Несмотря на большую разрешающую способность метода спектроскопии ЯМР, оба эксперимента дают лишь пять пар ограничений на расстояния между спиралями. Кроме того, наблюдаются отличия в упаковке димера в мицеллах и липидных бислоях (MacKenzie et al., 1997; Smith et al., 2001). Таким образом, вопрос об ориентации спиралей друг относительно друга и о специфической укладке аминокислотных остатков на интерфейсе до сих пор остается открытым (MacKenzie et al., 1997; Smith et al., 2001).
X. Петраше и др. 2002 методом МД рассматривали поведение экспериментально установленной структуры димера GpA (MacKenzie et al., 1997) в липидных бислоях разного состава. Они обнаружили, что разные типы мембранного окружения оказывают влияние на а-спиральную структуру мономерной/димерной формы GpA и на характеристики интерфейса димеризации GpA. Интересно, что взаимодействия между остатками разных мономеров оказались энергетически выгодными (имели отрицательное значение) за исключением взаимодействия между остатками Gly, несмотря на то, что эти остатки являются важными для димеризации (Lemmon et al., 1992). Как утверждают авторы, эти контакты дают положительный вклад в энергию за счет невыгодных электростатических взаимодействий между карбонильными группами и 0 группой. Интересно, что энергия взаимодействия мономера А с мономером Б очень близка к энергии взаимодействия мономера А со средой (аналогичные наблюдения были сделаны и в наших расчетах). Возникает вопрос, при каких условиях мономерам энергетически выгодно димеризоваться, а при каких - контактировать только с мембранным окружением? Так, было показано, что взаимодействие между остатками зависит от типа липидного окружения, и интерфейс димеризации имеет максимальное отклонение (менее сильные взаимодействия между остатками) в липидном бислое палмитоил-олеил-фосфатидилхолина (ПОФХ). Данный факт говорит о том, что некоторые виды окружения способствуют диссоциации мономеров; к сожалению, в настоящий момент времена, на которых можно было бы с помощью расчета проследить за такими процессами, недоступны из-за их вычислительной трудоемкости. Интересно, что в расчете наблюдалась тенденция в изменении толщины липидного бислоя рядом с димерным комплексом, т.е. возникала своеобразная подстройка граничащих с белком липидных молекул под толщину гидрофобного домена белка. Подобный эффект наблюдался также в экспериментах с искусственными пептидами на модельных мембранах (Killia & Von Heine, 2000) и при моделировании грамицидина A (Chi et al., 1999). Недавно группой Д, Энгельмана (Braun et al., 2004) был проведен расчет методом МД, в ходе которого наблюдали процесс формирования мицеллы вокруг димера GpA в течение 30 не и рассматривали поведение димера в сформированной мицелле (2,5 не). Было показано, что сборка липидов вокруг димера стабилизирует сс-спиральную структуру. Модель димера GpA стабильна в мицеллярном окружении - в отличие от пептида с мутацией Glyg3— Leu. Представляется важным, что в обоих расчетах в явно заданном окружении зафиксировано влияние липидов на упаковку а-спиральных субъединиц. Так, липидные молекулы, взаимодействуя с субъединицами, вызывают ротационные перестройки мономеров относительно друг друга, в результате чего угол между а-спиралями может меняться на величину 10-15, но при этом межспиральные контакты существенно не нарушаются. Таким образом, данные вычислительные эксперименты показывают, что для понимания принципов образования олигомерных комплексов необходимо также понимание влияния липидных молекул на поведение белков в мембранном окружении.
Подбор оптимальных характеристик моделей, имитирующих влияние мембраны, для изучения ассоциации мономеров GpA
МК-поиск без учета влияния среды показал, что стартовая а-спиральная структура мономера не является энергетически выгодным состоянием и разрушается в своей центральной части (структуры такого вида в дальнейшем будут называться «шпилькой», Рис. Ш.1). Существенное влияние на формирование подобных состояний оказывают пары заряженных аминокислотных остатков на концах - Glu7o,7i и Arg96,97- В природе они обычно служат для «заякоривания» на мембране, здесь же, в отсутствие мембранного окружения, противоположно заряженные группы атомов формируют выгодные электростатические контакты (понижение энергии ДЕэлкт 60 ккал/моль). Анализ вторичной структуры пептида показывает, что а-спираль нарушается преимущественно на участке Gly79-Gly86 - в области, наиболее подверженной конформационным перестройкам. (Как известно, остатки Gly в глобулярных белках являются плохими «спиралеобразователями» (Bywater et al., 2001). Значения S (площадь, доступная растворителю) для большинства гидрофобных и заряженных остатков сильно уменьшились - за счет формирования выгодных контактов между а-спиральными сегментами 73-82 и 87-97 . В области «излома» величина S увеличилась для остатков V80 и V84, что связано с нарушением а-спиральной структуры. Из анализа энергетических характеристик таких состояний видно, что понижение энергии комплекса происходит за счет ван-дер-ваальсовых (ДЕвдв - ЗОккал/моль) и электростатических взаимодействий. Ранее (Efremov et al., 2001) поведение мономера было исследовано аналогичным методом с применением модели неявно заданной мембраны. При этом в качестве стартовой конформации использовали либо а-спираль, либо полностью неупорядоченную структуру, помещенные вне гидрофобной области мембраны. В результате было показано, что, в полном согласии с экспериментальными данными (Mendelsohn et al., 1984; Welh et al., 1985), в обоих случаях наиболее энергетически выгодным состоянием является ТМ а-спираль. Таким образом, наличие сольватационного терма, имитирующего гетерогенное мембранное окружение, препятствует образованию нековалентных взаимодействий между удаленными по последовательности остатками.
Суммируя, можно заключить, что структура пептида определяется балансом следующих групп энергетических вкладов: сольватационного терма и энергии водородных связей - с одной стороны, и ван-дер-ваальсовых и кулоновских взаимодействий - с другой. При моделировании в «вакууме» нарушение такого баланса за счет пренебрежения эффектами среды приводит к преобладанию взаимодействий второй группы и, следовательно, к дестабилизации наблюдаемой в эксперименте вытянутой а-спиралыюй конформации и образованию «шпильки».
Интересно отметить, что именно участки мономера в «шпильке», где сохраняется а-спиралыгость, вовлечены в ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия друг с другом (Рис. Ш.1Б-Г). Предположив, что эти взаимодействия стабилизируют оставшуюся а-спиралыгую конформацию, возникают вопросы: «Насколько энергетически выгодной будет а-спиральная структура в случае двух мономеров?», «Можно ли моделировать димер без учета эффектов среды?» Для ответа на эти вопросы были выполнены МК-расчеты указанной системы в «вакууме». Моделирование двух а-спиральных сегментов в «вакууме».
Среди низкоэнергетических состояний наблюдалось два вида топологий: «спираль-шпилька» и димерные состояния в ориентации «голова к хвосту» (антипараллельный димер, !!) Заметим, что ос-спиральность в центральной части мономеров практически не нарушается, расплетание наблюдается лишь на концевых остатках мономеров. Возникает образование множества выгодных ван-дер-ваальсовых и электростатических контактов между мономерами, что, по-видимому, приводит к стабилизации а-спиральной конформации (Рис. ІП.2). Интересно понять, какова природа остатков, вовлеченных в олигомерные взаимодействия в «вакууме», для этого был рассчитан интерфейс димеризации (см. разд. «Методы расчета»). Оказалось, что образуется большое число выгодных электростатических контактов на концах мономеров (Рис. Ш.2). В центральной части димера плотной упаковки между а-спиралями не наблюдается, что хорошо видно из Рис. ІІІ.Б-В, поэтому взаимодействуют мономеры преимущественно за счет остатков с длинными боковыми цепями.
Таким образом, межмономериые контакты для структур, рассчитанных в «вакууме», сильно отличаются от «мотива димеризации» LIxxGVxxGVxxT, установленного экспериментально. По-видимому, мембранная среда оказывает существенное влияние как на взаимную ориентацию мономеров (в структуре, полученной методом спектроскопии ЯМР, мономеры расположены «голова-к-голове»), так и на плотность их упаковки. Следовательно, необходимо рассмотреть механизм межмолекулярного взаимодействия с учетом гетерогенного мембранного окружения «вода-мембрана-вода». Ниже приводятся результаты, полученные с использованием подобной модели, в которой обе поверхности эквивалентны с точки зрения их математического описания. В этом приближении модель представляет собой мембрану без приложенного ТМ электростатического потенциала.
Модель димера, установленная методом спектроскопии ЯМР: поведение в неявно заданном мембранном окружении
Кроме описанных выше параметров моделей димеров, интересно также сравнить энергии рассчитанных состояний и модели ОрАямр в присутствии неявно заданной мембраны. Во-первых, это необходимо для оценки предсказательных возможностей разрабатываемого подхода - можно ли для выбора правильных решений использовать энергетические характеристики моделей, и какие именно? Во-вторых, сравнение результатов моделирования при старте с «корректной» структуры димера (ОрАямр) и с расположенных произвольным образом а-спиралей позволит понять, насколько существенной в последнем случае является выборка генерируемых состояний. Для решения указанных задач методом МК был проведен конформационный поиск, в котором исходной структурой являлась модель ОрАямр, помещенная вне мембраны. Анализ полученных пизкоэнергетических состояний показал (Рис. Ш.З, Табл. III.3), что комплекс принимает ТМ ориентацию, а концы а-спиралей экспонированы в полярное водное окружение (в дальнейшем эти структуры будут называться СрАямр-мем)- При этом структура и взаимное расположение мономеров хорошо сохраняются среднеквадратичное отклонение координат атомов основной цепи от стартовой ЯМР-модели составляет 2,1 А. Заметим, что на заключительном этапе моделирования не применяли каких-либо искусственных ограничений на структуру комплекса и его положение относительно мембраны.
В неявно заданной мембране модель ЄрАямр имеет полную энергию, близкую к энергии состояний, полученных со случайных стартов (Табл. Ш.З ). Сравнение с одной из таких структур (d 8.3 А; 0 -27") показывает, что оба комплекса расположены одинаковым образом относительно мембраны (Рис. Ш.4) и имеют сходный интерфейс димеризации (Табл. Ш.З) - мотив LIxxGVxxGVxxT. Исключение составляют остатки Leii75, боковые цепи которых в модели GPAMK не образуют плотного межмономерного контакта, как это наблюдается в экспериментальной структуре. Несмотря на существенное среднеквадратичное отклонение между координатами атомов основной цепи (3.8 А) и завышенные значения расстояний для ряда межмономерных контактов (Табл. Ш.4-5), в целом структура димера GpAMK достаточно хорошо «аппроксимирует» наблюдаемую экспериментально в мицеллах ДФХ (MacKenzie et al., 1997).
Результаты моделирования показывают, что димерные состояния, хорошо согласующиеся с данными экспериментов, могут быть получены только в присутствии неявно заданного мембранного бислоя с приложенным ТМ потенциалом. Важно понять, каковы основные факторы, определяющие ассоциацию а-спиралей в мембране, какие энергетические взаимодействия обусловливают межмономерные контакты - интерфейс димеризации.
Рассмотрим энергетические характеристики системы на разных этапах моделирования. В начале МК-поиска существенное уменьшение полной энергии обусловлено независимым встраиванием каждого из мономеров в гидрофобный слой мембраны. Основной вклад в этот процесс вносят взаимодействия остатков с неполярной средой и с границей раздела мембрана-вода - в результате ЕсоЛе снижается на 70 ккал/моль (Стадия 1 - Рис. Ш.9). Заметим, что в таких состояниях мономеры сохраняют а-спиральную конформациго и не взаимодействуют между собой (Стадия 2 - Рис. Ш.9). На дальнейших стадиях МК-расчета (Стадия 2, Рис. Ш.9) появляются энергетически выгодные контакты между мономерами, и основной вклад в понижение полной энергии системы обусловлен ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями спираль-спираль (ДЕвдв 80ккал/моль). Анализ индивидуальных вкладов остатков пептидов в термы ЕвдВ и Еэлект. энергии межмолекулярного взаимодействия позволяет выявить аминокислотные остатки, наиболее важные для ассоциации мономеров GpA. Как следует из Табл. Ш.З, в моделях GpA\it и брАямр интерфейс димеризации определяется остатками с наиболее низкими значениями Евдв. Характер распределения Евдв в структурах с параметрами d « 8.3 А, 0 « -27 (Рис. III. 10Б) наиболее близок к наблюдаемому в димере ЄрАямр ((Рис. Ш.10А). Поскольку мономеры в модели СрАмк расположены дальше друг от друга, чем в модели GpAflMP, наиболее сильные взаимодействия в центральной части осуществляются за счет остатков с длинными боковыми цепями: ІІЄ76, Valso Val&b Thr87- Напротив, в плотно упакованных комплексах с левой закруткой (d б А; 0 55) в формировании интерфейса участвуют остатки с короткими боковыми цепями: GIy79 Ala82, Glyg3, Glyse (Рис. Ш.10В).
Таким образом, при встраивании двух изолированных сс-спиралей из водной фазы в мембрану основную роль в формировании ТМ комплекса играют два фактора. На первом этапе - взаимодействие с мембранным окружением, а затем - ассоциация спиралей с последующей их «тонкой подстройкой» за счет ван-дер-ваальсовых контактов. Важная роль среды на первом этапе заключается в том, что гидрофобные пептиды поодиночке встраиваются в неполярную область мембраны и принимают ТМ ориентацию. Контакт с неполярной средой, в которой пет доноров и акцепторов водородных связей, значительно стабилизирует а-спиральную конформациго каждого из мономеров - факт хорошо изученный в экспериментах (White & Wimley , 1999). За счет действия электрического поля мембраны а-спирали располагаются в ориентации «голова-к-голове».
Гетерогенная модель мембраны
Анализ ориентации пептидов относительно мембраны и относительно друг друга осуществляли с помощью программ, специально написанных для этих целей. В первом случае вычисляли углы осей а-спиральных сегментов с плоскостью мембраны, координаты центра масс пептидов и т.д. Во втором - углы (0) и расстояния (d) между осями сс-спиралей мономеров (PHC.V.I). В случае, если точка пересечения между осями спиралей находилась вне мономеров, в качестве величины d брали расстояние между проекциями на оси последних Са-атомов мономеров.
Вторичную структуру и площади поверхности остатков, доступные растворителю (S), рассчитывали с помощью программы DSSP (Kabsch and Sander, 1983). Остаток і считали находящимся на интерфейсе димеризации, если AS, 25 А (в случае глицина — при AS/ Ю А2), где ASi - разность величины S в свободном мономере и в димере. Аналогичным образом выявляли внутримолекулярные контакты в мономерах и "шпильках". Графические изображения пространственной структуры пептидов выполняли с помощью программы MOLMOL (Koradi et al., 1996). Учет ТЫ потенциала мембраны.
Для учета ТМ электростатического потенциала модель неявно заданной гетерогенной мембраны была модифицирована путем введения в выражение для потенциальной энергии системы дополнительного терма EAw (Efremov et al., 2001; Efremov et al., 2003). Вычисления проводили с Лу/= 300 мВ. N при zi Zo Где qs и zj - парциальный заряд и координата Z атома I, F - константа Фарадея, D -толщина мембраны. T(z)=const при zi] zo. Остальные детали моделирования описаны в работах (Efremov et al., 2001/20026).
Пространственную структуру гипотетической модели GpAi, с левой закруткой о спиралей конструировали следующим образом. В качестве структурного шаблона использовали низкоэнергетическое состояние с параметрами (d 5.5 А; 0 55), полученное методом МК в неявно заданной мембране с Лц/= 300 мВ. В указанную модель методом наименьших квадратов вписывали две идеальных а-спирали GpA. Таким образом, удавалось сохранить основные геометрические параметры взаимного расположения а-спиралей, присущие исходной МК-модели. Минимизацию энергии GpAL в «вакууме» осуществляли методами наискорейшего спуска (3 10 шагов) и сопряженных градиентов ( 2-Ю4 итераций). При этом использовали набор из пяти пар ограничений на межмономерные расстояния, полученных на основании данных ЯМР-спектроскопии димера в мицеллах ДФХ (MacKenzie et aL, 1997).
Расчет и визуализацию гидрофобных и гидрофильных свойств поверхностей а-спиралей мономеров GpA выполняли с помощью разработанного ранее метода молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) (Efremov & Vergotten, 1995). Значения МГП рассчитывали в точках доступной растворителю поверхности а-спиральных сегментов Е72-!95 в моделях GpAjiMP, GpAL и GpAMK- Вычисления проводили с помощью оригинального программного обеспечения, как описано ранее. При анализе ван-дер-ваальсовых взаимодействий между мономерами GpA вклад каждого аминокислотного остатка одного из мономеров определяли как сумму вкладов взаимодействий каждого атома данного остатка со всеми атомами другого мономера.
Модели «менее гидрофобной мембраны» и «более гидрофобной мембраны» были построены путем модифицирования модели гетерогенной мембраны (Efremov et al., 2002) с Ау/= 300 мВ и D = ЗОА. Для описания области липидного бислоя (z 15 А) вместо атомных параметров сольватации (АПС), рассчитанных для системы «водяной пар -циклогексан», использовали АПС, полученные для системы «водяной пар - октанол» (Efremov et al., 1999) в случае «менее гидрофобной мембраны». В случае «более гидрофобной мембраны» гидрофобная область (z 15 А) аппроксимировалась АПС, соответствующими растворителю с более гидрофобной природой по сравнению с циклогексаном («вода-циклогексан"-вода»). АПС были модифицированы следующим образом АПСмем = АПС"Ш - (а-1) АПСВ0Д-, где АПСМСМ and АПСВ0Д - оригинальные АПС, полученные на основании свободной энергии переноса в системах газ-циклогексан и газ-вода, соответсвенно (Efremov et al., 2001). Коэффициэнт увеличения степени гидрофобности мембраны а=1.4.
Система для моделироания димерных состояний была построена таким же образом, что и для ТМ сегментов GpA (см.выше). Моделирование димера производилось с «средними» пептидами. В расчете модели M1RR использовались только ограничения 20А на расстояние между N и С концевыми участками для предотвращения антипараллельной ориентации мономеров (расчет № 1). В расчете № 2 дополнительно использовали набор межспиральных ограничений на центральный участок между Са и С атомами остатков о о Аіапб, Glyiso, Sern2 - 5А, а также Hism - 8.5А. Исследование конформационного пространства методом Монте-Карло подробно описано выше. Для расчета димерных состояний M21RR, M22RR было проведено 2-Ю5 МК шагов. , "без ограничений" 6-Ю4. Для расчета остальных моделей (Табл. III.7) без ограничений использовались последовательности BNIP3R. Анализ результатов осуществлялся таким же образом как для ТМ сегмента GpA.
