Содержание к диссертации
Введение
Глава II. Моделирование поведения мембрано-активных пептидов в явно заданных гидратированных мембранных системах (обзор литературы) 13
II.1. МД расчеты водно-липидных систем 13
II.1.1. .Цвиттерионные мембранные системы 14
II.1.2. Заряженные бислои и мицеллы 15
II.1.3. Многокомпонентные мембраны 17
II.2. МД расчеты пептидов в мембранах 19
II.3. Резюме 20
Глава III Результаты и обсуждение 21
III.1. Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем 21
III.1.1 Роль заряда полярной головки в структурной организации модельной
мембраны. Сравнительное моделирование заряженного и цвиттерионного бислоев.
22
III. 1.2. Создание базы данных (БД) модельных водно-липидных систем и изучение
их структурно-динамических свойств 34
Ш.1.3. Создание смешанных бислоев, имитирующих реальные клеточные мембраны 43
Ш.2. Определение структуры МАП в модельных мицеллах, сравнение с экспериментом. Влияние гидрофобной организации водно-липидного интерфейса на конформацию пептида в связанном состоянии 45
III.3. Влияние динамического состояния мембраны на характер встраивания МАП (на
примере фузионного пептида Е5) 49
III.3.1. Конформация пептида в связанном состоянии 50
III.3.2, Мода встраивания в липидные бислои 52
III.3.3. Связывание пептида на поверхности мембраны. Роль гидрофобных соответствий 54
III.3.4. Мембранный ответ, вызванный встраиванием ФП ,56
III.3.5. Резюме 58
III.4. Роль специфических контактов остатков пептида с полярными головками липидов в дестабилизации заряженных и нейтральных мембран 60
III.4.1. Расчеты МД пенетратина и его аналогов 63
III.4.2. Взаимодействие pAntp с цвиттерионными (ДОФХ) и заряженными (ДОФС) бислоями 63
III.4.3. Мембранный ответ, вызываемый пептидом. 71
III.4.4. Взаимодействие аналогов пенетратина с бислоем ДОФС 74
III.4.5. Влияние гидрофобной организации поверхности мембраны на характер связывания пептида 77
III.4.6. Резюме 78
III.5. Особенности аминокислотной организации МАП, обусловливающие различные
механизмы связывания с мембраной (на примере антимикробных пептидов) 83
III. 5.1 Основные результаты моделирования Ltc2a и Ltd в мембранах «Эритроциты» и «Грам-» 85
III.5.2. Разработка аналогов Ltc2ac измененной активностью 94
III.6. Краткое описание разработанной технологии моделирования МАП... 97
Этап I. Создание и оптимизация теоретических моделей полноатомных гидратированных мембран-имитирующих систем 98
Этап II. Моделирование периферически связывающихся пептидов в присутствии полноатомных гидратированных мембранных систем 100
Глава IV. Заключение 103
IV. I. Обзор проведенных исследований и полученных результатов 103
IV.2. Научно-практическое значение работы 106
IV.3. Перспективы 108
V. Методы 109
V.I. Используемые теоретические подходы 109
V. 1.1.Метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП),„„ ...109
V.1.2.Метод молекулярной динамики (МД) явно заданных гидратированных мембранных систем 109
V.2. Используемые МАП 111
V.3. Вычислительные протоколы 111
V.3.I. Получение равновесных структур бислоев и мицелл 111
V.3.2. МД Ltc2a с мицеллой ДСН60 112
V.3.3. МД Е5 с бислоями ДМФХ и ДПФХ 112
V.3.4. МД pAntp в воде и с бислоями ДОФХ / ДОФС 113
V.3.5. МД Ltcl и Ltc2a с бислоями «Эритроциты» / «Грам-» 113
V.4. Анализ данных МД 113
V.4.I. Картирование структурно-динамических свойств на поверхности модельных
мембран 113
V.4.2. Расчет основных параметров для пептидов и мембран 115
V.4.3. Визуализация молекулярных структур 115
VI. ВЫВОДЫ 116
Список литературы 117
- Заряженные бислои и мицеллы
- Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем
- Обзор проведенных исследований и полученных результатов
- Получение равновесных структур бислоев и мицелл
Заряженные бислои и мицеллы
В отличие от цвиттерионных мембран, существует не так много примеров моделирования заряженных систем - насыщенных и частично ненасыщенных фосфатидилсе риновых (ФС) бислоев (Lopez Cascales ct al., 1996; Pandit & Berkowitz, 2002; Mukhopadhyay et al., 2004), бислоев, содержащих ненасыщенные жирные кислоты (лино-леоиловая) (Hyvonen et al., 2001), частично ненасыщенных заряженных бислоев, содержащих в своем составе фосфатидилглицерол (ФГ) и фосфатидилэтаноламин (Rog et al., 2003). Одной из причин этого, по-видимому, следует считать то, что при изучении заряженных бислоев методами МД возникает ряд трудностей, связанных, в первую очередь, с возможными вычислительными артефактами при использовании различных алгоритмов учета электростатических взаимодействий (Rog et al., 2003; Anezo et al., 2003; Patra et al., 2003). Обычно используют алгоритмы, основанные на применении функций сферических отсечек или методов сумм Эвальда. Наиболее распространенным алгоритмом учета электростатических взаимодействий по Эвальду является РМЕ (англ. Particle-Mesh Ewald) (Essman et al, 1995). Ранее было показано, что использование функция сферических отсечек при проведении МД-расчетов для бислоев может приводить к возникновению артефактов. В работе Anezo и др. показано, что использование отсечек различного радиуса при длительных МД-расчетах цвиттерионных бислоев (ДПФХ) приводит к незначительному отклонению от экспериментального в значениях равновесной площади на липид, асимметрии электростатического потенциала и др. (Anezo et al., 2003). При этом, по мнению авторов, использование РМЕ, несмотря на артефакты связанные с упорядочиванием системы, более приемлемо для расчетов МД бислойных систем. Однако это заключение выглядит достаточно спорным, поскольку целый ряд расчетных работ по цвитерионным бислоям свидетельствует о том, что подобные модельные системы, рассчитанные с использованием отсечек для учета электростатических взаимодействий, проявляют хорошее согласие с экспериментом (см. выше). Тем не менее, Patra и др. в своей работе приводят данные о более значительных артефактах, наблюдаемых при использовании отсечек для бислоя ДПФХ (Patra et al., 2003). Эти артефакты проявляются в уменьшении площади на липид в процессе расчета, увеличении параметра порядка ацильных цепей и специфическом упорядочивании головок в плоскости бислоя. При этом использование РМЕ позволяет избежать подобных артефактов. В свою очередь, Rog и др. сравнивают различные методы учета электростатических взаимодействий применительно к заряженным (ПОФГ / ПОФЭ) и незаряженным системам (ПОФХ). При этом сравнение эффективности использования отсечек и РМЕ для бислоя ПОФХ не обнаруживает существенных отличий. При расчете смешанного бислоя ПОФГ / ПОФЭ при использовании отсечек наблюдаются артефакты, связанные с аномальной подвижностью заряженных липи-дов и величиной параметра порядка их ацильных цепей. Кроме того, в зависимости от используемого алгоритма учета электростатических взаимодействий, показаны отличия в значениях равновесных макроскопических средних бислоя (площади на липид, толщины бислоя). С другой стороны, при использовании РМЕ в МД-расчете заряженного бислоя ДПФС наблюдается хорошее согласие с экспериментальными данными, и в целом система ведет себя стабильно (Pandit & Berkowitz, 2002). Кислой, содержащие заряженные липиды, активно используют в моделировании различных МАП и, в том числе - антимикробных пептидов, поскольку такие системы в определенной степени имитируют заряженные бактериальные мембраны (см. далее). Кроме того, моделирование МАП часто проводят в заряженных мицеллах додецилсульфата натрия - ДСН (Brace et al., 2002; Khandelia & Kaznessis, 2005a). Этот детергент также применяют в ЯМР-спектроскопии белков и пептидов в качестве модели мембранного окружения. Поэтому сравнение экспериментальных и расчетных данных для разных пептидов в мицеллах ДСН позволяет в достаточной степени судить об адекватности используемых методов моделирования (Wymore& Wong, 2001).
Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем
Целью данной работы являлась оптимизация методов моделирования явно заданных мембранных систем и создание базы данных (БД) липидных бислоев и мицелл разного липидного состава, а также изучение их структурно-динамические свойств. В качестве таких систем были использованы липидные бислои, включающие в свой состав молекулы с различными физико-химическими свойствами (длина и насыщенность ациль-ных цепей, заряд полярной головки), а также мицеллы нескольких типов. Исследование картины взаимного влияния при взаимодействии пептидов с модельными мембранными системами проводили на основании расчетов МД с помощью программного пакета GROMACS (версии 3.1.4, 3.2 и 3.3.1). Большинство расчетов было осуществлено с помощью высокопроизводительных многопроцессорных кластеров, имеющихся в распоряжении Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. При этом особое внимание было уделено методологическим аспектам моделирования. Как было отмечено ранее (см. раздел ИЛ.2), неправильный выбор схемы МД для конкретной системы может приводить к значительным вычислительным артефактам. Поэтому в процессе выполнения работы были апробированы различные алгоритмы учета электростатических взаимодействий и баростатирования, а также вариации стартовой геометрии системы. Отработку методик осуществляли на «чистых» (в отсутствие пептидов) водно-липидных системах. При этом выбирали липидные бислои (и мицеллы) с известными по литературным данным физико-химическими свойствами (средняя площадь на липидную молекулу - AL, профили электронных плотностей водно-липидных систем в направлении нормали к плоскости мембраны, дейтериевый параметр порядка ацильных цепей - Scd, коэффициенты латеральной самодиффузии липндных молекул - D] и др.). Процедура отработки и тестирования методик проиллюстрирована на примере сравнительного моделирования заряженного (дио-леилфосфатидилсерин - ДОФС) и цвиттерионного (диолеилфосфатидилхолин - ДОФХ) ненасыщенных бислоев (раздел ІІІЛ.1).
Обзор проведенных исследований и полученных результатов
Проведена разработка и оптимизация процедур и протоколов расчета и анализа МД явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем с применением высокопроизводительных многопроцессорных вычислительных платформ. Апробация полученных наработок была проведена на «чистых» (в отсутствие пептидов) однокомпонентных липидных бислоях (-200 липидов) и мицеллах (-100 молекул детергента) с разной химической структурой полярной головки и ацильных цепей {ДМФХ, ДПФХ, ПОФХ, ПОФЭ, ДОФХ, ДМФС, ПОФС, ПОФГ, ДОФС, ДФС, ДСН). Для ряда теоретических моделей мембран, полученных в результате длительных расчетов МД (-10 8с), показано хорошее согласие с экспериментальными данными. На основании этого были созданы модели смешанных бислоев, близких по составу к реальным биологическим мембранам (эритроцитов человека, грам- и грам+ бактерий). В результате была собрана БД равновесных структур бислоев и мицелл. Полученные теоретические модели мембран и данные об их структурно-динамической организации были использованы в моделировании МАП. Основные результаты:
а) На основании сравнительного моделирования бислоев ДОФС и ДОФХ была показана важность корректного учета электростатических взаимодействий в процессе МД для заряженной мембранной системы (с помощью метода суммирования по Эвальду), позволяющего избежать вычислительных артефактов. Оптимизированные протоколы с незначительными модификациями были использованы во всех последующих расчетах.
б) Получены данные о влиянии заряда полярной головки, ее химического строения, а также длины и насыщенности ацильных цепей на структурно-динамическую ор ганизацию мембраны (толщина бислоя, площадь на липидную молекулу, параметры порядка, глубина интерфейса, подвижность липидов и др.) По ряду приведенных параметров показано хорошее согласие теоретических моделей мембранных систем с имеющимися экспериментальными данными, в) Разработаны новые методики анализа поверхностных свойств модельных мембран. При этом использовали алгоритмы двумерного картирования различных параметров системы - подвижность полярных головок липидов, характер упаковки липидов (Scii, ориентация полярных головок), рельеф поверхности. Разработан новый критерий, позволяющий описывать гидрофобную организацию поверхности модельных мембран. Показано, что доли гидрофобной и гидрофильной поверхности являются характеристическими параметрами для бислоев и мицелл и определяются их липидным составом.
Получение равновесных структур бислоев и мицелл
На основании PDB-структур молекул липидов и детергентов создавали бислойные (транслирование молекулы вдоль осей X[n], Y[n] и Z[2]; значение п в соответствии с размером системы, обычно п=8) и мицеллярные модели (транслирование молекулы вдоль радиусов сферы с характерным размером детергента). Для этого использовали специально написанные программы тк_Ы!ауег, mk_micelle. Геометрические параметры мембранных моделей задавали с учетом имеющихся экспериментальных данных (площадь на ли-пидную молекулу, толщина мембраны, радиус мицеллы и др.) Полученные бислои и мицеллы помещали в кубическую ячейку (GROMACS/editconf) и добавляли молекулы растворителя (GROMACS/genbox, обычно SPC модель воды). В полученных системах удаляли молекулы воды, локализованные в гидрофобных областях ацильных цепей. В расчетах использовали топологические справочники молекул липидов и детергентов, оптимизированные под тяжело-атомные силовые поля с полярными протонами Gromos87/96. В случае заряженной системы добавляли необходимое число противоионов (GRO-MACS/genion, обычно Na и СГ). Дальнейшие расчеты проводили в соответствии с общей схемой (см. раздел V.1.2). Для заряженных систем с противоионами учет электростатических взаимодействий проводили с помощью модифицированного метода сумм Эвальда (РМЕ), для незаряженных систем (мембрана + вода) использовали функции сферических отсечек.
