Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор Литературы 11
1.1 Спектр фармакологического действия метронидазола 11
1.2 Эритроциты - объект для исследования протекторного действия лекарственных препаратов 13
1.3 Липосомы как простейшая модель эритроцитов 17
1.4 Ультрадисперсные алмазы как модель молекулярных и надмолекуляр ных структур 21
1.5 Водный матрикс в живых системах 23
1.5. 1 Молекулярное строение воды 23
1. 5. 2 Жидкая вода и массоперенос 26
1. 5. 3 Фазовые переходы в водной среде 29
1. 6 Воздействие электромагнитных излучений на живые организмы и поиск протекторов 32
1.6.1 Электромагнитные излучения в современном обществе 32
1.6.2 Механизм взаимодействия электромагнитных излучений крайне высоких частот с биологическими объектами 33
1.6.3 Влияние резонансных частот крайне высокого диапазона на состояние сетки водородных связей воды 37
Глава 2. Объекты и методы исследования 41
2.1 Приборы и материалы 41
2.2 Методы исследования 45
2.2.1 Методика выделения метронидазола и приготовления его растворов 45
2.2.2 Методика определения влияния метронидазола на гемолитичес кую устойчивость эритроцитов к действию додецилсульфата натрия 45
2.2.3 Выделение лецитина 46
2.2.4 Методика приготовления липосом и определения их устойчивости к воздействию додецилсульфата натрия 47
2.2.5 Методика молекулярного моделирования влияния метронидазола на водное микроокружение 47
2.2.6 Методика определения влияния метронидазола на состояние примембранной воды липосом 50
2.2.7 Методика измерения молекулярного рассеяния света водными растворами метронидазола 51
2.2.8 Методика определения вязкости гидрозоля наночастиц УДА .51
2.2.9 Методика синтеза не модифицированных резольных смол 52
2.2.10 Методика определения коэффициента диффузии флуоресцина натрия в водной фазе 53
2.2.11 Методика определения влияния метронидазола на гемолитическую устойчивость эритроцитов находящихся под воздействием ЭМИКВЧ 54
2.2.12 Методика подсчета эритроцитов с помощью камеры Горяева.55
2.2.13 Методика оценки токсичности метронидазола на культуру Paramecium caudatum 56
2.2.14 Статистическая обработка результатов экспериментов 57
Глава 3. Влияние метронидазола на гемолитическую устойчивость эритроцитов в присутствии додецилсульфата натрия 58
Глава 4. Влияние метронидазола на скорость разрушения липосом додецилсульфатом натрия 62
Глава 5. Оценка влияния метронидазола на водное микроокружение с помощью молекулярного моделирования 65
Глава 6. Флуоресцентная оценка подвижности приповерхностной воды липосом в присутствии метронидазола 70
Глава 7. Оценка флуктуации плотности воды в присутствии метронидазола 72
Глава 8. Влияние метронидазола на свободную воду мембран и их моделей 75
Глава 9. Вискозиметрическое измерение величины гидратной оболочіси моделей белков и мембран (наночастиц УДА) в присутствии метронидазола 84
Глава 10. Влияние метронидазола на гемолитическую устойчивость эритроцитов находящихся под воздействием ЭМИ КВЧ .88
Глава 11. Влияние метронидазола на двигательную активность Paramecium caudatum 98
Заключение 100
Выводы 104
Список используемой литературы 106
- Эритроциты - объект для исследования протекторного действия лекарственных препаратов
- Ультрадисперсные алмазы как модель молекулярных и надмолекуляр ных структур
- Методика определения влияния метронидазола на гемолитичес кую устойчивость эритроцитов к действию додецилсульфата натрия
- Влияние метронидазола на гемолитическую устойчивость эритроцитов в присутствии додецилсульфата натрия
Введение к работе
Актуальность темы. Биохимики и биоорганики проявляют повышенный
интерес к молекулярным механизмам действия биорегуляторов, в частности - к
лекарственным соединениям. Так, синтетический химиотерапевтическии
препарат широкого спектра действия 1-(2тидроксиэтил)-2-метил-5-
нитроимидазол (метронидазол, МЗ) давно привлекает внимание исследователей. Дело в том, что кроме "основного" - противомикробного действия МЗ оказывает протекторный эффект на эукариотические клетки при воздействии на них ксенобиотиков.
Поскольку, в современном мире резко возросло влияние физических (П. Я. Григорьев, 1997; С.Н. Бобраков, А.Г. Каташев, 2001; А.Г. Шеин, Р.Н. Никулин, 2003) и химических факторов на живые организмы, является актуальным поиск клеточных протекторов. В последнее время особое внимание уделяется исследованию "новых" возможностей "старых лекарств" (И.С. Северина, 2005). Если механизм антибактериального действия МЗ хорошо изучен, то механизм его протекторного действия не исследован.
Давно известно влияние на структуру сетки водородных связей воды некоторых низкомолекулярных соединений (Дж. Поллак, 2001). Некоторые из них оказывают на воду структуроразрушающее действие (мочевина, многие неорганические анионы и т.д.), другие — структуростабилизирующее (метанол, этанол, диоксан и др.) (Б.В. Дерягин, Н.В. Чураев, 1971; В.Я. Антонченко, 1983). Известно, что некоторые лекарственные соединения могут структурировать приповерхностную воду (А.Д. Кунцевич с соавт., 1998). Не вызывает сомнений тот факт, что эти вещества могут влиять не только на объёмную воду, но и на гидратные оболочки клеток и биополимеров и, как следствие, на конформацию и реакционную способность последних.
Есть основания полагать, что протекторный эффект МЗ обусловлен стабилизирующим воздействием вещества на структуру сетки водородных связей воды в примембранной области или у поверхности биомакромолекул. Результатом этого является прекращение доступа вещества к мембране,
7 интегральному ферменту или рецептору. Вероятно, с этим связано
протекторное действие препарата на клетки теплокровных. Представляет
определенный интерес использование возможности МЗ структурировать
примембранную воду не только для защиты клеток от воздействия химических
и физических факторов (П.Е. Кузнецов с соавт., 2005), но и для регуляции
биохимических процессов.
Важно детально понять, каким образом реализуется протекторный эффект
МЗ, поскольку это открывает путь к конструированию новых клеточных
протекторов и веществ, способных регулировать биохимические реакции.
Поэтому, изучение протекторного действия данного соединения обусловливает
актуальность темы настоящей работы.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в
изучении механизма протекторного действия метронидазола на клетки и их
модели, находящиеся под воздействием детергента додецилсульфата натрия и
электромагнитного излучения крайне высокочастотного диапазона.
Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:
Определить протекторное действие метронидазола на клетки и их модели, находящиеся под воздействием детергента додецилсульфата натрия.
Экспериментально и с помощью молекулярного моделирования изучить влияние метронидазола на состояние сетки водородных связей свободной и приповерхностной воды клеточных и модельных мембран.
Исследовать влияние метронидазола на гемолитическую устойчивость эритроцитов, находящихся под воздействием электромагнитного излучения крайне высокочастотного диапазона, изучить изолированное влияние метронидазола на эритроциты и Paramecium caudatum.
Научная новизна работы. Установлена способность МЗ в определенных концентрациях снижать коэффициент диффузии в примембранной водной среде. Выдвинуто и обосновано предположение, что этим обусловлен протекторный эффект МЗ.
8 Экспериментально и методами молекулярного моделирования установлено
выполнение необходимых условий фазового ^-перехода в объемной водной
среде и вблизи поверхности клеточных и модельных систем в присутствии
МЗ. Показано, что А,-переход является вероятной причиной образования
мощной гидратной оболочки клеток и их моделей.
Экспериментально установлено протекторное действие МЗ на эритроциты,
подверженные действию резонансных частот электромагнитного излучения
крайне высокочастотного диапазона (ЭМИ КВЧ).
Научно-практическая значимость. Установленное протекторное действие МЗ на клеточные и модельные мембраны за счет стабилизации их гидратного окружения может составить основу для поиска клеточных протекторов нового поколения и создания низкомолекулярных веществ, влияющих на протекание определенных биохимических процессов.
В связи с тем, что МЗ является лекарственным препаратом широкого спектра действия и применяется при целом ряде инфекционных заболеваний, а также обнаруженная у него способность оказывать цитопротекторный эффект, делает исследование протекторного действия МЗ на молекулярном уровне интересным для врачей-клиницистов.
По материалам диссертационной работы написаны "Методические рекомендации к практикуму по молекулярной биологии - фолдинг белка и изучение влияния на него веществ, снижающих диффузионную подвижность воды" для проведения практических занятий со студентами, специализирующимися в области биохимии и молекулярной биологии, рекомендованные учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета СГУ (выписка из протокола №104 от 10 октября 2005 г.).
Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета Саратовского государственного университета.
9 Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены
и обсуждались на первой и второй Российских школах-конференциях "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине"(Саратов, 2002, 2004), на Международных конференциях "Saratov Fall Meeting" (Саратов, 2003, 2004), "The Human Proteome Organisation 2nd Annual & International Union Biochemistry and Molecular Biology XIX World Congress" (Canada, Montreal, 2002), 42nd Congress of the European Societies of Toxicology (Poland, Cracow, 2005), на 7-ой, 9-ой и 10-ой Пущинской школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пушино, 2003,2005), на итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием "Молодежь и медицинская наука в XXI веке" (Киров, 2005), на VI Международном конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке"(Томск, 2005), на студенческой научной конференции биологического факультета СГУ "Студенческие исследования в биологии" (Саратов, 2003, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ в зарубежных и отечественных изданиях.
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики биологического факультета Саратовского государственного университета в соответствии с плановой тематикой НИР "Воздействие антропогенных факторов на природные экосистемы", номер гос. регистрации 01.200.201974. Научный руководитель д.х.н, профессор Кузнецов П.Е.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Метронидазол проявляет свойства протектора клеточных и модельных мембран при воздействии на них детергента додецилсульфата натрия и под влиянием резонансных частот ЭМИ КВЧ.
В присутствии метронидазола выполняются необходимые условия фазового ^.-перехода в водной фазе.
Метронидазол увеличивает гидратную оболочку и снижает коэффициент диффузии приповерхностной воды клеточных и модельных мембран.
10 Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы
исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения,
заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 156
источников, в том числе 29 зарубежных. Работа изложена на 120 страницах
машинописного текста, содержит 27 рисунков и 4 таблицы.
Эритроциты - объект для исследования протекторного действия лекарственных препаратов
При изучении механизмов биологической активности химических веществ и лекарственных препаратов особое значение приобретают сведения об их влиянии на систему крови, которая является важной составной частью внутренней среды организма (П.Д. Горизонтов, 1981; А.Я. Ольшанская с соавт., 1984). Общность строения плазматических мембран различных органов и тканей (М.М. Козлов, B.C. Маркин, 1986) позволяет думать, что процессы, происходящие в эритроцитарной мембране, отражают изменения в мембранах других органов и тканей (Е.М. Васильева, 2005). Мембрана эритроцита отражает особенности биохимического строения клеточных мембран различных тканей, а именно, представляет пластичную молекулярную мозаику, состоящую из белков, липо- и гликопротеинов и чисто липидных участков (И. Ивенс, Р. Скейтлак, 1982; А.Я. Ольшанская с соавт., 1984; Р. Шмидт, Г. Тевс, 1986; В.М. Покровский, Г.Ф. Коротько, 2001; Е.М. Васильева, 2005). Наряду с тем, что мембрана эритроцита проницаема для катионов Na+ и К+, она особенно хорошо пропускает О2, СО2, СГ и НСО з. Цитоскелет в виде проходящих через клетку трубочек и микрофиламентов в эритроците отсутствует, что придает ему эластичность и деформируемость -это необходимые свойства при прохождении через узкие капилляры (М.М. Козлов, B.C. Маркин, 1986; В. М. Покровский, Г.Ф. Коротько, 2001). Фактор стабильности липидного бислоя определяется липидными порами, которые образуются в местах дефектов жидкокристаллической структуры липидного бислоя. Если липидная пора не превышает некоторый критический размер, то структура сохраняется. Минимальные размеры липидных пор могут стать сравнимыми с размерами избирательных белковых каналов, регулирующих в норме ионную проницаемость клеточных мембран (В.Ф Антонов с соавт., 1992; Б. Альберте с соавт., 1994). Морфофункциональные характеристики, обеспечивающие целостность эритроцитов, могут изменяться при воздействии ряда внешних и внутренних факторов. Нормальный эритроцит способен до определенного предела противостоять действию осмотических, механических, химических, температурных влияний.
Это характеризуется понятием резистентности. При "ум шьще и резистетности эритроцитов до минимума начинается процесс гемолиза. Гемолизом называется разрыв оболочки эритроцитов и выход гемоглобина в плазму, благодаря чему кровь приобретает лаковый цвет. Гемолиз может проходить in vivo и in vitro. Например, при сильном встряхивании ампулы с кровью происходит механической гемолиз. Если эритроциты заморозить, а затем согреть, то возникает гемолиз, получивший название термического. Под биологическим гемолизом понимают гемолитическое действие ядов змей, некоторых насекомых. В искусственных условиях гемолиз эритроцитов может быть вызван помещением их в гипотонический раствор. Например у здорового человека минимальная граница осмотической стойкости соответствует раствору, содержащему 0,42-0,48 % NaCl, полный же гемолиз происходит при концентрации 0,3-0,34% NaCl. Наконец, при переливании несовместимой крови и наличии аутоантител к эритроцитам развивается иммунный гемолиз. Гемолиз in vivo и in vitro может быть вызван химическими агентами (хлороформ, эфир, сапонин, различные кислоты и основания, т.д.), разрушающими мембрану эритроцитов (А.К. Гулевский, 1981; В.М. Покровский, Г.Ф. Коротько, 2001).
Так, измерение in vitro устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу часто используется в клинике для оценки возрастного состава клеток крови и при характеристике различных патологий. В эксперименте этот подход может быть использован для оценки действия различных биологически активных веществ на мембрану эритроцитов. В ряде работ описан окислительный гемолиз; в качестве окислителей, способных его вызвать, известны гилохлорид натрия (В. В. Черный с соавт., 1992), этанол (О. В. Тюлина с соавт., 2000), супероксидные, гидроксильные, пероксильные и некоторые другие радикалы (Y. Sato at al., 1995; В. Pekiner at al., 1994). Различают быстрый (происходит в течение нескольких минут) и медленный (до нескольких часов) гемолиз (О.А. Сенькович, Е.А. Черницкий, 1997). В настоящее время в литературных источниках (Е.А. Черницкий, А.В. Воробей, 1981; А. Ленинджер, 1985; Р. Геннис, 1997) имеются многочисленные сведения о влиянии химических и физических факторов на гемолиз эритроцитов. Установлено, что детергенты способны вызывать гемолиз эритроцитов, параметры которого зависят от температуры, рН среды и химического состава мембран. В качестве детергента наиболее часто используется ДСН. При взаимодействии с эритроцитами ДСН вызывает разрушение липидного бислоя (Е.А. Черницкий с соавт., 1999). Известно, что ряд гемолитиков - гемолитические вирусы, бактериальные и животные токсины, компоненты активизированного комплемента и катионные белки вызывают увеличение проницаемости мембран клеток, которое ингибируется двухвалентными катионами и усиливается при повышении ионной силы среды. Предполагается, что указанные выше вещества образуют в мембране поры, в результате чего может произойти коллоидно-осмотический лизис клеток (Е.А. Черницкий, А.В. Воробей, 1981). ДСН может вызвать как быстрый, так и медленный гемолиз, которым соответствуют различные поры в мембране эритроцитов. Методом ингибирования гемолиза осмотическими протекторами (сахароза и полиэтиленгликоль) была произведена оценка размеров пор, возникающих в эритроцитах под воздействием детергентов. Установлено, что поры, ответственные за быстрый гемолиз имеют большие размеры по сравнению с порами возникающими при медленном гемолизе. Необычный эффект ингибирования скорости и процента быстрого гемолиза обусловлен побочным действием протекторов - ускорением процесса везикуляции эритроцитов, который конкурирует с процессом образования пор (О.А. Сенькович, Е.А. Черницкий, 1997).
Ультрадисперсные алмазы как модель молекулярных и надмолекуляр ных структур
В настоящее время в научных исследованиях и в промышленности широко применяются материалы, полученные методами нанохимии. Эти системы по размеру занимают промежуточное положение между молекулами и макроскопическими объектами и обладают уникальными физико-химическими свойствами, которые до сих пор мало изучены (И.Д. Морохов, Л.И. Трусов, 1984; Г.В. Сакович с соавт., 1990; Г.А. Чиганова, 1997,2000).
В современной науке проявляется повышенный интерес к гидрозолям наночастиц УДА (Г.А. Чиганова, 1994, 1997, 2000), в которых объем гидратных оболочек частиц значительно превышает дисперсную фазу. Гидрозоли УДА представляют собой коллоидные системы, состоящие из дисперсионной фазы (воды) и дисперсной фазы (твёрдых частиц). Сложное строение коллоидных частиц и их большой объём позволяют говорить о поверхности раздела между частицами и средой, следовательно, о поверхностной энергии, поверхностном слое, разделяющем дисперсионную и дисперсную фазы.
Думанский (Б.В. Дерягин, Н.В. Чураев, 1971) впервые акцентировал внимание на том, что на поверхности дисперсных частиц всегда имеются стойкие жидкостные оболочки. Эти оболочки затрудняют слияние частиц друг с другом. Исследуя различные коллоидные системы, Дерягин (Б.В. Дерягин с соавт., 1985) развил учение о "связанной" воде у поверхности дисперсных частиц, обладающей отличительными свойствами по сравнению с водой в дисперсионной фазе, и определил, что толщина поверхностной оболочки может достигать 75 нм. Молекулы в поверхностном оболочке находятся не в фиксированном положении, а в непрерывном движении. Время нахождения молекулы в оболочке измеряется величиной равной примерно 10"7 с. За это время молекула должна ориентированно расположится относительно других молекул на поверхности частицы, совершить колебательное движение в положении равновесия и покинуть поверхность частицы, т.е. перейти из одного слоя в другой и далее покинуть поверхностную оболочку вообще.
Дерягин показал, что тонкие слои воды вокруг коллоидных частиц обладают аномальными свойствами по сравнению со свободной водой в объеме. При толщине слоя 100 нм он обнаружил значительное увеличение упругих и прочностных свойств воды (Б.В. Дерягин с соавт.,1985).
В целом можно заключить, что при погружении любого адсорбента в воду непосредственно у самой поверхности расположится прочный мономолекулярный слой жидкости, а далее над ним расположатся последующие слои жидкости все менее связанные по мере увеличения сферы водной оболочки. Поэтому верхние слои водной оболочки получили название диффузных. Диффузные слои водной сферы легко разрушаются под действием ряда факторов, например, при повышении температуры.
Связанная вода диффузионного слоя при замораживании переходит в обычный лед не при нуле, а при более низкой температуре, т.к. это связано с разрушением слоев воды, безусловно, легче разрушаются верхние слои водной оболочки.
Диффузные слои водной сферы легко разрушаются также при внесении растворимых веществ. Однако характер влияния вносимых веществ на диффузные слои зависит от их природы, т.е. одни вещества с увеличением их концентрации будут разрушать диффузные слои, а другие - укреплять. Например, спирты разрушают диффузные слои (Б.В. Дерягин с соавт.,1985). Некоторые лекарственные вещества создают "гидратные шубы" вокруг наночастиц (А.Д. Кунцевич с соавт., 1998).
Проведенные исследования (И.Д. Морохов, Л.И. Трусов, 1984; Г.В. Сакович с соавт., 1990; Г.А. Чиганова, 1994, 1997, 2000) позволяют предположить, что гидрозоли УДА целесообразно использовать в качестве моделей биосистем молекулярного и супрамолекулярного уровня, в частности, при изучении воздействия различных факторов на водное окружение биологических структур (A.M. Апаркин с соавт., 2003).
Поскольку существует предположение о том, что МЗ может оказывать протекторный эффект путем изменения свойств приповерхностной и объемной водной фазы биообъектов, то необходимо более подробно рассмотреть химическую структуру и свойства жидкой воды.
Вода является основным компонентом живых организмов. Органы взрослого человека содержат 70-80% воды, полуторамесячный зародыш 97%. На долю молекул воды приходится около 80% всей массы клетки. Несомненно, вода играет не только роль универсального растворителя и транспортной среды в процессах метаболизма, а выполняет в процессе жизнедеятельности более глубокую, фундаментальную функцию. На основании выше сказанного становится понятным повышенный интерес к изучению состояния воды в биологических системах любого уровня организации (от клетки до организма).
Для того чтобы понять уникальность воды необходимо рассмотреть ее молекулярную структуру. Молекула воды состоит из одного атома кислорода и двух атомов водорода, причём атом кислорода имеет не спаренную р-электронную пару (СИ. Аксёнов 1990). Длина связи О-Н составляет 0,957 А, угол между связями — 104,523.
Атом кислорода из-за своей высокой электроотрицательности смещает на себя электроны от атомов водорода, на которых создаётся избыточный положительный заряд. Избыточный отрицательный заряд атома кислорода концентрируется вокруг двух центров, соответствующих его не спаренному р-электронному облаку в соответствии с (рис. 2). Таким образом, центры зарядов молекулы оказываются расположенными в вершинах тетраэдра (рис. 2 ).
Методика определения влияния метронидазола на гемолитичес кую устойчивость эритроцитов к действию додецилсульфата натрия
Применялась методика, предложенная в работе (Е.А. Черницкий с соавт., 1999). В кювету, содержащую 1,5 мл фосфатного буфера (рН 7,2) и 80 мкл водного раствора ДСН в концентрации 160 мкМ, добавляли суспензию эритроцитов, выделенных путем центрифугирования (3000g, 15 мин) и трижды отмытых от плазмы в изотоническом 0,9% растворе NaCl. Исходная оптическая плотность суспензии при Я=670 нм равнялась 0,8 (d=0,5cM), для предотвращения оседания эритроцитов суспензию периодически перемешивали. В течение 4 часов при комнатной температуре на указанной длине волны измерялась оптическая плотность суспензии эритроцитов, подвергающихся действию ДСН, как в отсутствие (контроль), так и в присутствии МЗ в концентрациях 5х10"1-5х10"12%. Поскольку оптическая плотность эритроцитов пропорциональна количеству целых клеток (П.Д.
Горизонтов, 1981), то их гемолитическую устойчивость оценивали по изменению оптической плотности суспензии во времени. Лецитин выделяли по методике, предложенной в работе (Л.Д. Бергельсон с соавт., 1981). Желтки 10 куриных яиц гомогенизировали на гомогенизаторе (Homogenizer MPW-302, Польша) при комнатной температуре в 400 мл абсолютного ацетона в течение 5 мин со скоростью 8000 об/мин. Гомогенат переносили в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл и выдерживали 2 ч при t 5С. Смесь центрифугировали (g 3500, 20 мин) с охлаждением до 0С. Ацетоновый слой сливали, остаток смешивали с 400 мл свежего ацетона и центрифугировали, как указано выше. Ацетоновый слой отбрасывали, а остаток переносили в круглодонную колбу емкостью 500 мл и упаривали. Сухой остаток экстрагировали дважды порциями по 200 мл смесью хлороформ : этанол (1:1 об ). Объединенный экстракт упаривали, остаток растворяли в 500 мл петролейного эфира и разбавляли в 10 раз абсолютным ацетоном. Смесь в течение 1 ч выдерживали при 10JC — 6С до просветления и фильтровали через стеклянный фильтр с диаметром пор 100 нм. Процедуру осаждения повторяли и остаток высушивали в вакууме при t=4C. Полученные суммарные фосфолипиды (около 8 г) растворяли в 40 мл смеси хлороформ : метанол (1:1 об).
Выделение лецитина проводили хроматографическим методом на окиси алюминия. Суспензию 180 г окиси алюминия в 200 мл смеси хлороформ : метанол (19:1 об) вносили в хроматографическую колонку размером 2,5х 50 см и промывали ее 400 мл той же смеси растворителей. Затем на колонку наносили раствор суммарных фосфолипидов в смеси хлороформ : метанол. Элюирование проводили смесью хлороформ : метанол (9:1 об). Элюат собирали фракциями по 50 мл, контролируя ход разделения с помощью тонкослойной хроматографии. Пятна, дававшие положительную реакцию с реактивом Драгендорфа (1,7 г основного нитрата висмута в 100 мл 20%-ной уксусной кислоты и 10 г йодистого калия в 25 мл воды, перед использованием 20 млпервого раствора смешивали с 5 мл второго и разбавляли смесь 70 мл воды), проявлялись во фракции 4. Чистый лецитин вымывался во фракциях 4-7, которые объединяли и упаривали. Выход хроматографически чистого яичного лецитина составил около 5 г.
Влияние метронидазола на гемолитическую устойчивость эритроцитов в присутствии додецилсульфата натрия
Для изучения влияния МЗ на примембранную воду в качестве тест-объекта были выбраны эритроциты белых крыс. Они имеют характерную и типичную для всех эукариотических клеток мембрану, которая не содержит специфических рецепторов. Чтобы оценить влияние МЗ на клеточную мембрану и примембранную водную фазу целесообразно изучить его действие на структурно-функциональное состояние плазматической мембраны в целом. Влияние МЗ на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов определяли по гемолитической устойчивости клеток к действию ДСН в концентрации 160 мкМ. В течение 4 часов проводились измерения оптической плотности эритроцитов, подвергающихся действию ДСН, как в отсутствие, так и в присутствии различных концентраций МЗ. Полученные результаты свидетельствуют о повышении гемолитической устойчивости эритроцитов в присутствии МЗ. Значимые отличия наблюдались в интервале концентраций МЗ 5x10 -5x10" %. Следует подчеркнуть, что концентрация ДСН составляет 4,6x10"3 %, т.е. при концентрациях М3 10 % его концентрация намного меньше, чем концентрация ДСН и образованием комплекса МЗ с ДСН нельзя объяснить протекторное действие МЗ на эритроциты. Установлено, что в условиях проведения эксперимента скорость гемолиза хорошо описывалась кинетическими кривыми первого порядка с независящей от времени константой скорости к, о чем свидетельствует линейность приведенных на рисунке 5 графиков. Тогда для зависимости оптической плотности D от времени t справедливы соотношения Эта константа в присутствии МЗ возрастает (рис.6) с уменьшением его концентрации в пробе, значимые отличия (р 0.05) от гемолиза в отсутствие МЗ наблюдались в интервале 5x10" -5x10" %.
Поскольку скорость гемолиза в интервале концентраций МЗ 5ХЮЛ 5У-\0 % снижена по отношению к контролю (действие ДСН в отсутствие МЗ) можно утверждать что, в этом концентрационном интервале МЗ проявляет выраженное протекторное действие по отношению к эритроцитам. Можно предположить, что повышение гемолитической устойчивости эритроцитов, возможно, зависит от увеличения упорядоченности примембранной водной фазы, что снижает доступность к мембране гемолизирующих веществ, в данном случае ДСН. Для того чтобы оценить, является ли протекторное действие МЗ на клеточную мембрану специфичным (например, обусловлено связыванием МЗ с каким-либо рецептором), мы использовали простейшую модель клетки -липосомы из яичного лецитина. Эта модель построена из липидных бислоев и лишена белковой и полинуклеотидной компоненты. Следовательно, если присутствие МЗ будет оказывать сходное действие на липосомы, препятствуя их разрушению ДСН, то можно полагать, что протекторное действие МЗ является неспецифичным. Действительно, в присутствии МЗ разрушение липосом ДСН (рис.7) значительно замедляется. Через 1 час инкубации значимые отличия оптической плотности суспензии от контроля (р 0,05) наблюдались в интервале концентраций МЗ 5x10"1- 5x10"14 % Однако, в интервале концентраций МЗ SxlO xlO"4 % мы не можем быть полностью уверенны в том, что МЗ не оказывает влияние на липидный бислой липосом, а именно не встраивается в него, поскольку концентрация липида составляет 2х10"3 %, т.е. сопоставима с концентрацией МЗ. Вероятно, протекторное действие МЗ в концентрациях от 5x10"5 % до 5x10"14 % обусловлено непосредственным воздействием на приповерхностную воду липосом. Поскольку молекулы МЗ не обладают выраженной амфифильностью, то в довольно низких концентрациях (до 5x10 14 %) они не могут существенно модифицировать структуру бислоя липосом за счет встраивания в него. Представляет интерес кинетика взаимодействия компонентов системы с МЗ. При условии, что зависимость концентрации липосом, также как и концентрации эритроцитов, подчиняется кинетике первого порядка, динамика оптической плотность липосом описывается уравнением (10). Если при этом наблюдается зависимость оптической плотности от концентрации (С) МЗ, то где: а - порядок процесса по МЗ. Если а=0 (процесс нулевого порядка), то это соответствует избытку МЗ (количество МЗ избыточно по отношению к необходимому для протекания процесса, т.е. большая часть МЗ в процессе не участвует). Из графика видно, что при высоких концентрациях МЗ наблюдается незначительная зависимость оптической плотности (D) от концентрации МЗ (а - незначимо отличается от нуля). Процесс идет в условиях избытка МЗ по отношению к необходимому его количеству. При концентрациях МЗ (С) 10"9% порядок реакции значимо отличается от нуля 0,029±0,003. Таким образом, показано снижение разрушающего действия ДСН по отношению к не содержащим рецепторы липосомам в присутствие МЗ аналогично тому, как это происходит с эритроцитами. Это позволяет полагать, что процесс протекторного действия МЗ не связан со специфическим воздействием на мембранные рецепторы. Если предположить, что причиной протекторного эффекта является снижение диффузионной подвижности примембранной воды клеток или их моделей, то в этом случае ДСН будет медленнее диффундировать через слой малоподвижной приповерхностной воды. В пользу такого предположения говорит и тот факт, что некоторые химические соединения способны вызывать изменение параметров водородной сетки приповерхностной воды в низких концентрациях (А.Д. Кунцевич с соавт., 1998; П.Е. Кузнецов с соавт., 2004), не проявляя при этом выраженной поверхностной активности.
