Содержание к диссертации
Введение
1. Бурая жировая ткань . 8
1.1. Физиологическая роль жировых тканей. 11
2. Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях бурой жировой ткани. 13
2.1. Термогенин - разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани. 15
2.2. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования. 18
3. Норадреналин-как основной регулятор термогенеза. 19
3.1. Адренергические рецепторы клеток бурого жира. 21
3.1.1. Агонисты и антагонисты адренорецепторов клеток бурого жира. 27
4. Са2+-Система сигнализации клеток бурого жира. 28
5. Ключевые молекулы аденилатциклазного пути. 35
6. Агенты, повышающие [Са2+]і в клетке. 40
2. Материалы и методы исследований. 45
1. Метод выделения клеток бурого жира. 45
2. Состав изоляционного раствора. 45
3. Измерение [Ca2+]j. 46
4. Стандартный солевой раствор. 47
5. Определение количества клеток. 47
6. Описание установки. 48
7. Используемые реактивы. 50
3. Результаты и их обсуждение. 5
2 1. Роль cti и р-адренорецепторов в формировании Са +-сигнала в преадипоцитах бурого жира. 52
2. Действие ингибиторов и активаторов сАМР-зависимого пути на Са2+-сигнал в преадипоцитах. 57
3. Депо-зависимый Са2+-сигнал в преадипоцитах бурого жира. 65
4. Са -каналы в преадипоцитах бурого жира. 67
5. Иономицин-резистентные свойства преадипоцитов бурого жира. 71
Заключение 77
Выводы 79
- Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования.
- Са2+-Система сигнализации клеток бурого жира.
- Состав изоляционного раствора.
- Действие ингибиторов и активаторов сАМР-зависимого пути на Са2+-сигнал в преадипоцитах.
Введение к работе
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
БУРАЯ ЖИРОВАЯ ТКАНЬ. 8 1.1. Физиологическая роль жировых тканей. 11
Особенности разобщающего действия жирных кислот
в митохондриях бурой жировой ткани. 13
Термогенин - разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани. 15
Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования. 18
3. Норадреналин-как основной регулятор термогенеза. 19
3.1. Адренергические рецепторы клеток бурого жира. 21
3.1.1. Агонисты и антагонисты адренорецепторов
клеток бурого жира. 27
Са2+-СИСТЕМА СИГНАЛИЗАЦИИ КЛЕТОК БУРОГО ЖИРА. 28
Ключевые молекулы аденилатциклазного пути. 35
Агенты, повышающие [Са2+]і в клетке. 40 Глава 2/МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 45
Метод выделения клеток бурого жира. 45
Состав изоляционного раствора. 45
Измерение [Ca2+]j. 46
Стандартный солевой раствор. 47
Определение количества клеток. 47
Описание установки. 48
Используемые реактивы. 50 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 52 1. Роль cti и р-адренорецепторов в формировании
Са +-сигнала в преадипоцитах бурого жира. 52
2. Действие ингибиторов и активаторов сАМР-зависимого
пути на Са2+-сигнал в преадипоцитах. 57
3. Депо-зависимый Са2+-сигнал в преадипоцитах
бурого жира. 65
Са -каналы в преадипоцитах бурого жира. 67
Иономицин-резистентные свойства преадипоцитов
бурого жира. 71
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
ВЫВОДЫ 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 109
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЦ - аденилатциклаза;
сАМР - циклический аденозинмонофосфат;
НА - норадреналин;
ОК - окадаиковая кислота;
ПКА - протеинкиназа А;
РБ-1 или UCP-1 - разобщающий белок 1;
ЭР - эндоплазматический ретикулум;
1Рз - инозитол-1,4,5-трифосфат;
[Ca2+]i- внутриклеточная концентрация Са2+;
DAG- 1,2-диацилглицерол;
Рига-2/АМ-{1[2-(5-карбонилоксалол-2-ил)-6-аминобензафуран-5-окси] -2-(21 -
амино-З'-метилфенокси^этил-Ы^Ы'^^К'-тетрауксусная кислота}
ацетоксиметиловый эфир;
ГВМХ - З-изобутил-1-метилксантин;
Н-89 - 1Ч-[2-(р-бромоцинамиламино) этил1]-5-изокуинолинесульфонамид;
ОРС-39 П - К-циклогексил-М-(2-гидроксиэтил)-4-(6-(1,2-дигидро-2-
оксокуинолилокси))бутирамид;
Ro 20-1724 - 4-(3-бутокси-4-митоксибензшг)-2-имидазолидон; СаМ-ФДЭ - Са27кальмодулин - фосфодиэстераза; АКАР — «заякоривающий белок»;
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Бурая жировая ткань впервые была описана несколько сот лет назад. Эта ткань локализована близ жизненно важных органов и играет главную роль в производстве тепла, необходимого для поддержания постоянной температуры, в особенности у мелких животных, живущих в условиях холода и/или впадающих в зимнюю спячку, а также у новорожденных, в том числе и человека [Rial et al., 1983; Nicholls & Locke, 1984]. Нейротрансмиттер норадреналин инициирует термогенез и увеличивает термогенную активность ткани при хроническом холодовом стрессе, стимулируя её гиперплазию и гипертрофию. Норадреналин многократно ускоряет как пролиферацию клеток, так и их дифференцировку. В бурых преадипоцитах норадрекалин стимулирует синтез ДНК и белка по сАМР-зависимому пути. В постконфлуентных клетках норадреналин стимулирует экспрессию гена белка-разобщителя. Была показана линейная корреляция между экспрессией гена и повышением концентрации cAMP [Bronnikov et al., 1992]. Таким образом, процессы; пролиферации, дифференцировки и термогенез а, опосредованы одним и тем же мессенджером - сАМР и инициируются через р-адренорецепторы. Роль осі-адренорецепторов в указанных процессах оказалась минорной и сводилась к синергическому усилению сигнала, индуцированного через Р-рецепторы и с AMP. В этом случае ионы Са2+ усиливали стимулирующее действие с AMP на термогенез клеток и экспрессию ряда генов [Thonberg et al., 1994; Zhao et al., 1997].
Единственным указанием на возможное участие ионов Са в активации пролиферации бурых преадипоцитов являлась установленная ранее корреляция между эффектами нейропептидов на [Са2+]і в свежевыделенных преадипоцитах и модуляцией пролиферации культивируемых клеток пептидами при тех же концентрациях [Bronnikov et al., 1997]. Однако оказалось, что [Са ]і, инициируемый
норадреналином и пептидами в преадипоцитах и зрелых клетках бурого жира отличается по ряду параметров (кинетика, амплитуда и т.д.). Более того, создавалось впечатление, что Са -сигналы, инициируемые в преадипоцитах разными агонистами, обладают разными физиологическими функциями в этих клетках и связаны, по-видимому, со стимуляцией противоположно направленных процессов [Bronnikov et al., 1997]. Поэтому мы считаем весьма важным на первом этапе установить, причины существенных отличий Са2+-ответов на норадреналин в преадипоцитах и зрелых клетках бурого жира. Это позволит в последующем использовать полученные знания для контролируемого управления за развитием клеток и ткани.
К важным свойствам бурой жировой ткани относится её
способность наращивать свою массу в случае хронического холодового
стресса. Запуск этого процесса, также как и термогенеза,
осуществляется в основном норадреналином. Бурая жировая ткань
представляет собой хорошую модель для исследования механизмов
гормонального контроля за развитием ткани и клеток.
Цель и основные задачи исследования. Цель настоящей работы:
установить роль аі-и Р-адренорецепторов и исследовать особенности
функционирования фосфоинозитидного и аденилатциклазного путей в
формировании уникального Са2+-ответа, инициируемого
норадреналином в бурых преадипоцитах. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Установить тип адренорецепторов, участвующих в формировании [Са2+]і на норадреналин в свежевыделенных бурых преадипоцитах мыши. Оценить вклад ai- и р-адренорецепторов в формировании [Са2+]і в свежевыделенных бурых преадипоцитах мыши.
Определить ключевые молекулы сигнального пути, отвечающего за проведение сигнала от момента связывания лиганда с рецептором до повышения уровня ионов Са2+ в цитоплазме клеток.
Продемонстрировать влияние вторичного мессенджера сАМР на Са -ответ бурых преадипоцитов
3. Изучить особенности регуляции [Са ]j в бурых преадипоцитах
(участие каналов, внутриклеточных пулов).
4. Сравнить действие модуляторов Са2+-ответа в бурых преадипоцитах и
зрелых бурых адипоцитах.
Научная новизна работы. Показано, что медленный Са2+-ответ на норадреналин в бурых преадипоцитах инициируется преимущественно через р-адренорецепторы и сАМР/протеинкиназа А-зависимый путь, тогда как си-адренорецепторы играют второстепенную роль. Активация отдельных участков аденилатциклазного пути, непосредственная активация аденилатциклазы форсколином или инкубация клеток с проникающим аналогом сАМР ВгсАМР приводит к более
9-і-
существенному росту [Са ]i, чем действие на преадипоциты норадреналина. Показано, что участники сАМР-зависимого пути, активируемого через Р-адренорецепторы (аденилатциклаза, фосфодиэстераза и протеинкиназа А), способны инициировать и модулировать Са2+-ответы в бурых преадипоцитах. С помощью ингибиторного анализа клеточных ответов показаны присутствие в преадипоцитах незначительных внутриклеточных кальциевых пулов и низкая проводимость плазматической мембраны для ионов Са2+. Блокатор Са -каналов L-типа нифедипин и Са -ионофор иономицин увеличивали уровень [Са \ в преадипоцитах.
Научно-практическая ценность. Знание механизмов может иметь важное значение для предотвращения и лечения ожирения и сопутствующих болезней, в частности диабета. Восстановление бурой жировой ткани у людей с помощью фармакологических средств позволит контролируемо «сжигать» белый жир и заметно понизить уровень жирных кислот в крови, Это в свою очередь позволит уменьшить возможность развития сахарного диабета второго типа.
Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования.
Среди природных веществ-разобщителей большой интерес представляют длинноцепочечные жирные кислоты. Их разобщающее действие было открыто в 1956 г. На протяжении многих лет внимание к жирным кислотам как к эндогенным разобщителям было направлено в основном на изучение их роли в термогенезе [Скулачев, 1962; Nichols & Locke, 1984; Скулачев, 1989; Bmstovetsky et al., 1990; Brustovetsky et a!., 1992; Daikoku et al., 1997] и в повреждении клеток и тканей при различных патологических состояниях организма [Boime et al., 1970; Corr et al., 1984; Биленко, 1989; Lenton et al., 1995]. По характеру своего действия на митохондрии жирные кислоты похожи на классические разобщители-протонофоры (ДНФ, ТТФБ, SF6847), что позволило говорить о наличии общего механизма действия [Shorts & Zakharova, 1977; Schonfeldet al., 1989; Shinohara et al., 1995]. Следует, однако, заметить, что сам факт установления протонофорной активности жирных кислот на изолированных митохондриях нельзя рассматривать как свидетельство в пользу того, что эти соединения функционируют как классические разобщители-протонофоры, для которых характерна способность пересекать фосфолипидную мембрану митохондрий, как в форме нейтральной молекулы, так и в форме аниона [Hanstein, 1976; Terada, 1981; Скулачев, 1989]. Предполагается, что в реализации протонофорной активности жирных кислот на митохондриях принимают участие белки-переносчики анионов внутренней мембраны [Samartsev et al, 1999]. В связи с этим говорить о том, что жирные кислоты функционируют как разобщители-протонофоры, можно только в том случае, если известно, что эти соединения в процессе разобщения способны переносить протоны непосредственно через фосфолипидные структуры мембраны без участия переносчиков анионов. Однако заметный прогресс в выяснении механизма разобщающего действия жирных кислот был, достигнут тогда, когда стало ясно, что в специфическом разобщении в отсутствие ионов кальция принимают участие белки внутренней мембраны митохондрий: разобщающий белок или термогенин в митохондриях бурой жировой ткани [Nicholls & Locke, 1984; Klingenberg & Huang, 1999]. 3.
Норадреналин - как основной регулятор термогенеза. В клетках бурого жира симпатический нейротрансмиттер норадреналин (НА) стимулирует, по крайней мере, два фундаментальных для развития ткани процесса: термогенный ответ зрелых клеток (адипоцитов) и вовлечение молодых (преадипоцитов) в процесс пролиферации [Geloen et al., 1992; Gillon-Zyzek et al., 1993; Nedergaard et al., 1995, Cannon et al., 1996]. Исследования в данном направлении активно ведутся лишь в последнее десятилетие. Было показано, что стимулирование бурых адипоцитов норадреналином приводит к экспрессии гена разобщающего белка (UCP1) [Rehnmark, 1989; Kopecky et al., 1990]. Оптимальные условия для индукции экспрессии зарегистрированы при концентрации норадреналина ниже 0,1 мкМ, более высокие концентрации являются менее эффективными [Rehnmark, 1990; Kopecky et al., 1990]. Показано, что на холоду в бурой жировой ткани увеличивается высвобождение норадреналина из симпатических нервных окончаний [Cottle et al., 1967; Alexander et al., 1975; Kennedy et al., 1977; Tsukazaki et al., 1995; Shimizu et al., 1997], также как и потребление кислорода тканью [Smith & Hock, 1963; Foster & Frydman, 1979], что свидетельствует об увеличении термогенной активности. Давно известно, что норадреналин способен увеличивать метаболические скорости у интактных животных, тогда как адреналин не оказывает действия [Moore & Underwood, 1963]. Ранее полагали, что функционирование бурой жировой ткани существенным образом регулируется через Р-адренергические процессы, опосредованные процессом увеличения уровня цитозольного сАМР. Норадреналин, высвобождаясь при стимуляции нервных волокон, вызывает образование с AMP в клетках бурого жира [Bronnikov et al., 1992] и стимулирует, таким образом, липолиз триглицеридов. Образующиеся свободные жирные кислоты являются физиологическим субстратом для несократительного термогенеза [Hemon et al., 1976; Triandafillou et al., 1982]. На зрелых клетках нейротрансмиттер взаимодействует с р- и а-адренорецепторами, что приводит к генерации таких вторичных мессенджеров как с AMP и Са2+. При этом р-адренорецепторы дифференцированных клеток бурого жира осуществляют передачу сигнала по сАМР-зависимому пути [Rehnmark et al., 1990; Bronnikov et al., 1992; Zhao et al., 1994; Nedergaard et al., 1994], a ai-адренорецепторы сопряжены с фосфоинозитидным путем и генерацией Са2+ сигнала [Kuusela et al., 1997]. В ответ на добавление норадреналина в зрелых клетках повышается уровень сАМР (10-25pmol), тогда как в свежевыделенньгх преадипоцитах не удалось зарегистрировать изменения уровня с AMP. Ранее было показано, что кинетика изменения [Са ]; в свежевыделенных (еще не вовлеченных в процесс пролиферации) бурых преадипоцитах мыши в ответ на норадреналин (НА) весьма существенно отличается от кинетики в зрелых клетках, дифференцированных в результате культивирования свежевыделенных бурых преадипоцитов [Broimikov et aL, 1997]. В результате воздействия норадреналина на дифференцированные клетки бурого жира происходило быстрое и высокоамплитудное изменение концентрации кальция в цитозоле.
Необычная кинетика -сигнала и отсутствие сАМР-ответа на норадреналин послужили причиной настоящего исследования роли ai- и р-адренорецепторов в формировании Са2+-сигнала в свежевыделенных бурых преадипоцитах мыши. 3.1. Адренергические рецепторы клеток бурого жира. Фармакологическая классификация адренергических рецепторов на а- и р-адренергические классы была впервые сделана в 1948 г. [Ahlquist, 1948]. Позже а-адренергические рецепторы были подразделены на подтипы ai и аг [Langer, 1974] и Р-адренергические рецепторы на подтипы $i и р2 [Lands et aL, 1967; Kurahashi & Kurashima, 1981; Seydoux et al., 1982; Assimacopoulos-Jeannet et al., 1982; Svartengren et ai., 1982, 1984]. Адренорецепторы относятся к серпентиновым рецепторам, локализованных по всему телу в нейрональных и ненейрональных тканях, где они опосредуют широкий ряд ответов на эндогенные катехоламины -норадреналин и адреналин. Спустя четверть века, а-адренорецепторы были дальше разделены по их анатомической локализации, те адренорецепторы, которые локализованы на окончаниях периферического симпатического нерва определили как аг-адренорецепторы, а те, которые локализованы на постсинаптической мембране определили, как cci-адренорецепторы [Langer, 1974]. Эта анатомическая классификация предоставила подходы для идентификации фармакологических различий между а-адренорецепторами. Так, например, бьшо показано, что йохимбин и ровалсцин действуют как антагонисты ссг-адренорецептора. Последующие исследования, использующие фармакологические и молекулярные биологические методики, далее подразделили оіі-адренорецепторную семью на три подтипа, внутри каждой группы сразу же были клонированы и фармакологически охарактеризованы ссрадренорецепторы [Wang et al., 1995]. Подтип ai-адренорецепторов был классифицирован на аід, &ів, и ссю-адренорецепторы, а подтип сі2-адренорецептороБ был классифицирован на ссгд (ct2D вид отличается от осгд человека), ссгв и агс-адренорецепторы. Р-Адренорецепторы являются также гетерогенными по природе и были в начале разделены на Pi и Рг-адренорецепторы на основании соответствующих воздействий катехоламинов в системах in vitro и in vivo [Lands et al., 1967]. Далее Р-адренорецепторы классифицировались с использованием функциональных исследований, связыванием рецепторов и генетических методик. Семья р-адренорецепторов подразделяется на 3 подтипа, pi- рг-адренорецепторы и атипичный рз-адренорецептор [Arch et al,, 1984; Arch, 1989; Kaumann, 1989; Strosberg & Pietri-Rouxel, 1996]. Добавочный р-адренорецептор, который был обнаружен в сердечной ткани и является мнимым подтипом и классифицируется как Р4-адренорецептор.
Са2+-Система сигнализации клеток бурого жира.
Впервые важная роль Са2+ как внутриклеточного регулятора была установлена английским физиологом Сиднеем Рингером в 1883 г., который показал, что механическая активность сердца тормозится, если во внешней среде нет Са [Ringer, 1883]. Спустя 100 лет появилось сообщение о возможности измерения внутриклеточной концентрации свободного С а ([Са2+]і) в клетках млекопитающих с помощью Са2+-флуоресцентного зонда Quin 2 [Tsien et al., 1984]. В настоящее время существует уже несколько поколений высоко чувствительных флуоресцентных Са2+-зондов, позволяющих измерять концентрацию Са2+ в цитозоле и во внутреклеточных органеллах [Grynkiewicz et al., 1985; Левицкий, 1990; Као, 1994; Takahashi et al., 1999; Baylor & Hollingworth, 2000]. Са является универсальным вторичным мессенджером, действующим в клетках бактерий, растений и животных. Са1+ необходим для жизнедеятельности клеток, и в то же время длительное повышение [Са ]; приводит к гибели клеток [Berridge et аЦ 1998], поэтому такой параметр, как [Са +]І, должен жестко регулироваться. Концентрация свободного Са2+ в покоящихся клетках поддерживается на очень низком уровне (-1 10 М), тогда как концентрация Са2+ в наружной среде выше в 10000 раз (1-2 мМ). Са2+-сигналы в бурых адипоцитах оказывают влияние на широкий спектр клеточных ответов, от острой стимуляции термогенеза [Tuchiya & Nagai, 1994; Zhao et al., 1997] до долговременной модификации термогенной способности [Cannon et al., 1996]. Основные системы транспорта Со2 .
Эукариотические клетки содержат системы транспорта Са2+ в плазматической мембране, в митохондриях, эндоплазм этическом ретикулуме и в саркоплазматическом ретикулуме. Как правило, плазматическая мембрана содержит три системы: Са2+-каналы, специфичную АТРазу и Na+/Ca2+-обменник. Вход Са2+ в клетки по градиенту концентрации осуществляется, в основном, по Са2+-каналам плазматической мембраны. Выведение Са2+ из цитоплазмы осуществляется Са +-АТРазой и Na+/Ca + обменником. Уровень [Ca2+]i поддерживается также Са2+-АТРазой эндоплазм атического ретикулума (ЭР) и митохондриальными Са -транспортирующими системами. Повышение [Са2+]і происходит при открывании кальциевых каналов и возникновению кальциевого потока по градиенту концентраций. Механизмы входа Со2 в невозбудимых клетках. Основными путями входа Са2+ в клетку являются Са2+-проницаемые ионные каналы. В нервных, мышечных и других электрически возбудимых клетках вход Са обеспечивается потенциал-зависимыми Са -каналами. В невозбудимых клетках механизмы входа Са менее изучены. Исследования проведенные, в частности с использованием метода пэтч-кламп, выявили наличие в плазматической мембране многих типов клеток рецептор-управляемых Са2+-каналов, открывание которых связано с активацией специфических рецепторов в мембране [Mahaut-Smith et al., 1990; Mozhayeva et al., 1991; Naumov et al, 1992; Авдонин и Ткачук, 1994]. Выделяют три типа рецептор-управляемых Са -каналов [Meldolesi & Pozzan, 1987]: 1) собственно рецептор-управляемые Са2+-каналы, у которых участок связывания лиганда и ионный канал находятся на одном и том же полипептиде или на одном и том же молекулярном комплексе. К этой группе относят катионный канал никотинового ацетилхолинового рецептора, канал NMDA-рецептора; 2) Са -каналы, регулируемые вторичными посредниками (то есть каналы, связанные с рецептором через растворимый вторичный посредник); 3) Са -каналы, управляемые G-белками, то есть связанные с рецептором через G-белок.
Все отмеченные типы Са2+-каналов различаются по способу активации и, вероятно, по характеру Са2+-сигналов, которые они генерируют. Потенциал-зависимые Са -каналы обеспечивают быстрый, но кратковременный вход Са2+. Открывание же рецептор-управляемых Са2+-каналов приводит к быстрому и длительному увеличению концентрации цитоплазматического Са2+. Потенциал-управляемые кальциевые каналы. Потенциал-управляемые кальциевые каналы впервые были обнаружены в электровозбудимых клетках. Эти каналы чаще обнаруживают там, где Са2+ вызывает процессы секреции. Процессы секреции характерны не только для электровозбудимых клеток, но и для эндокринных. В настоящее время известно несколько типов потенциал-управляемых кальциевых каналов (L-, Т-, N- и Р-типы), которые обладают различной проводимостью и различной чувствительностью к мембранному потенциалу, фармакологическим веществам [Dascal, 1990; Hille, 1992; Spedding & Paoletti, 1992; Hofmann et al., 1994; Alekseev et al., 1996; Catterall, 1996; Mori et al., 1996; Randall, 1998; Hille, 2001]. L-тип Са2+-каналов найден практически во всех электровозбудимых, и во многих электроневозбудимых клетках [Tsien & Tsien, 1990], таких как эпителиальные клетки, гепатоциты, адипоциты белого жира [Pershadsingh et al., 1989; Graur et al., 1996, 1998; Abernethy & Soldatov, 2002]. Каналы L-типа (долгоживущие), которые, будучи активированы, сохраняют это состояние довольно долго. Их повторяющиеся открывания обеспечивают длительный кальциевый ток через мембрану. Характерным признаком кальциевых каналов L-типа является их чувствительность к дигидропиридинам и другим кальциевым антагонистам. Блокатором Са2+-каналов L-типа является нифедипин [Mori et al., 1996; Randall, 1998]. На культивированных бурых адипоцитах было показано, что Са2+-ответ к 1 мкМ норадреналину на 50 % подавляется после инкубации с 20 мкМ нифедипина [Graur et al., 1998; Zhang, 1999]. Авторы делают вывод о присутствии L-типа Са2+ каналов в дифференцированных бурых адипоцитах [Zhang, 1999]. Депо-зависимый вход Са2 в клетки. Гипотеза о сопряжении входа наружного Са2+ с его высвобождением из внутриклеточных кальциевых депо была выдвинута в 1981 году [Casteels & Droogmans, 1982] и затем получила свое дальнейшее развитие в работе Патни [Putney, 1986]. Суть гипотезы первоначально заключалась в том, что после высвобождения Са2+ из эндоплазматического ретикулума и других чувствительных к гормонам эндогенных кальциевых хранилищ, их последующее заполнение происходит не только за счет обратного транспорта Са2+ из цитоплазмы АТРазами, но и в результате прямого поступления туда внеклеточного Са .
Предполагалось, что образуется физический контакт между плазматической мембраной и мембраной внутриклеточных резервуаров Са2+. В месте контактов образуется пора, через которую и пополняются внутриклеточные кальциевые депо. Согласно обсуждаемой гипотезе, необходимым условием активации входа Са2+ по такому механизму является опустошение эндоплазм атического ретикулума или других хранилищ эндогенного кальция. В настоящее время предполагают, что одним из основных механизмов входа Са в электрически невозбудимые клетки является так называемый депо-зависимый или "емкостной" вход Са2+, впервые постулированный Джеймсом Патни [Putney, 1986, 1990]. "Емкостная" (capacitative) модель входа Са2+ в клетки, объясняющая рецептор-активируемый вход Са2+ в клетки, основывается на исследованиях Са2+ -сигнализации в невозбудимых клетках, таких как ацинарные клетки околоушной железы и эпителиальные клетки. Ті Емкостной вход Са стимулируется различными агентами, такими как Са2+-мобилизующие агонисты или фармакологические агенты, общим свойством которых является способность вызывать освобождение Са + из депо. Удобными инструментами для прямого исследования емкостного входа Са2+ оказались специфические ингибиторы эндоплазматических Са2+-АТРаз, обеспечивающих накопление Са в ретикулуме. К этим ингибиторам относятся тапсигаргин [Jackson et al., 1988; Thastrup et al., 1990; Zhong & Inesi, 1998], циклопьязониковая кислота [Goeger et al., 1988; Mason et al., 1991; Demaurex et al., 1992] и 2,5-ди(трет-бутил)-1,4-бензогидрохинон (DBHQ) [Mason et al, 1991]. Различие структуры тапсигаргина, циклопиазониковой кислоты и DBHQ свидетельствует в пользу того, что активация входа Са2+ не является побочным эффектом этих агентов, не связанным с ингибированием Са2+- АТРаз. S Использование ингибиторов эндоплазматических Са -АТРаз и других методических подходов позволило идентифицировать депо-зависимый вход Са + в различных типах невозбудимых клеток (эндотелиальные клетки, клетки крови, ооциты, гепатоциты и др.), а также в ряде возбудимых клеток (гладкомышечные клетки и др.) [Parekh & Реппег, 1997; Putney, 1997; Holda et al., 1998]. Депо-зависимый вход Са2+ является, по-видимому, универсальным механизмом регулируемого входа Са в клетки.
Состав изоляционного раствора.
Эксперименты проводили на суспензии свежевыделенных бурых преадипоцитов. Мышей-самцов линии NMRI возрастом 3-5 недель содержали в отсутствие холодового стресса (температура в помещении 20-23С). Для опытов животных забивали методом цервикальной дислокации. Увлажняя шерсть спиртом кожу надрезали, и аккуратно снимали, получая доступ к бурому жиру. Забор ткани производили из межлопаточной, и шейных областей (рис. 4.). Кусочки бурого жира помещали в чашку Петри с 2 мл охлажденного изоляционного буфера [Nechad et al., 1983b; Bronnikov et al., 1999a]. 123 мМ NaCl (хч., Реахим); 5 мМ КС1 (осч., Реахим); 1,3 мМ СаС12 (Flow Laboratories); 5 мМ глюкозы (ч., Реахим); 20 мМ HEPES (Sigma); 0,5 % BSA (Serva). (СаС12 и BSA добавляются после доведения рН до 7,4) [Методы культивирования клеток, 1988]. Бурую жировую ткань очищали от белой жировой ткани, соединительной ткани и крови, затем тщательно измельчали с помощью ножниц и переносили в пробирки с раствором коллагеназы для удаления внеклеточного матрикса. 0,5-0,6 мг коллагеназы (Sigma) на 1 мл изоляционного буфера, готовится непосредственно перед опытом из расчета 2-2,5 мл раствора на одну мышь. Суспензию ткани в коллагеназе инкубировали на водяной бане при 26 С в течение 25 мин, периодически встряхивая. Процесс разрушения межклеточных контактов останавливали охлаждением во льду в течение 15-30 мин. Суспензию клеток отфильтровывали на грубом нейлоновом фильтре (размер пор 250 микрон) и центрифугировали при 1200 g в течение 10 мин на центрифуге К-23 ("MLW", Германия). Слой белого жира удаляли и супернатант отсасывали шприцем с длинной иглой. Затем осадок ресуспендировали в 9 мл среды DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (BSA) рН 7,4, отфильтровывали на нейлоновом фильтре (размер пор 25 микрон) и центрифугировали при 1200 g в течение 10 минут. Супернатант отсасывали шприцем, осадок ресуспендировали в DMEM (без альбумина), доводя объем до 1 мл. Полученная суспензия содержала молодые преадипоциты, так как зрелые адипоциты содержат жировые капли и не осаждаются при данных параметрах центрифугирования. 3. ИЗМЕРЕНИЯ [Ca2+]i. Для измерения [Са ]j клетки бурого жира нагружали флуоресцентным красителем Fura-2/AM [Tsien et al., 1982; Grynkiewicz et al., 1985].
Эти соединения имеют большой отрицательный заряд и поэтому не способны проходить через плазматическую мембрану клетки. Отрицательные заряды карбоксильных групп нейтрализуются путем эстеризации. В виде ацетооксиметильного эфира Fura- 2/АМ пассивно проникает через плазматическую мембрану. В цитоплазме клеток эфирные связи расщепляются внутриклеточными эстеразами, зонд становится гидрофильным и не выходит из клетки [Borle & Snowdowne, 1987; Авдонин и Ткачук, 1994]. Суспензию клеток (1-Ю8 клеток/мл) инкубировали с 2 мкМ флуоресцентного красителя Fura 2/АМ в течение 40 минут при 37С. Окрашенные клетки отмывали от внешнего красителя и ресуспендировали в среде Хенкса с добавлением 10 мМ HEPES, рН= 7,2 при 37С, Полученную суспензию инкубировали 10-15 мин при 37С, центрифугировали 2 мин при 7000 об/мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в нужном объеме рабочей среды. 4. Стандартный солевой раствор: Стандартный солевой раствор представлял собой раствор Хенкса и содержал (в мМ) [Культура живых клеток, 1989]: СаС12 - 1,26 мМ; КС1 - 5,36 мМ; КН2Р04 - 0,44 мМ; MgCl2 6 Н20 - 0,49 мМ; MgS04 7 Н20 - 0,41 мМ, NaCI - 137 мМ; Na2HP04 7 Н20 - 0,34 мМ. + 10 мМ Hepes, рН=7.2 при 37С. Бескальциевая среда представляла собой стандартный солевой буфер без добавления СаСЦ, но с 0,5 мМ ЭГТА. 5. Определение количества клеток
Определение количества клеток в суспензии проводили в камере Горяева. Как правило, одновременно определяли жизнеспособность клеток при использовании трипанового синего. Живые клетки не проницаемы для красителя, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются. Однородность фракции преадипоцитов анализировали на микроскопе ConfoCor (Carl Zeiss). И как видно на рисунке 5, суспензия свежевыделенных преадипоцитов содержит только молодые клетки бурого жира размером 4 urn. Известно, что размер зрелых адипоцитов составляет больше 15 ц.т [Nechad, 1983а]. Эксперименты выполнены на установке, специально сконструированной для изучения суспензий клеток и органелл [Холмухамедов и др., 1980]. Установка представляет собой комплекс микроспектрофлуориметра и сложной термостатируемой ячейки со встроенными Н1-- и ЬС -электродами и магнитной мешалкой. Особенностью флуориметра также является применение высокоаппертурной контактной оптики, обеспечивающей концентрацию возбуждающего света в небольшом объёме постоянно перемешиваемой суспензии. Схема установки представлена на рис. 6. Регистрация сигналов осуществлялась на компьютере при помощи программы Signal и Record 4. Спектрофлюориметр снабжен приставкой (1) к монохроматору (2) для одновременного измерения интенсивности оптического сигнала на трех выбранных длинах волн. Приставка (1) представляет собой блок из трех фотоэлектронных умножителей (ФЭУ), по одному ФЭУ на каждый оптический канал. Свет возбуждения люминесценции от источника (6) через систему фильтров (5) отражается от свето делительной пластинки (4) и фокусируется контактным объективом (7) на суспензию клеток, находящихся в ячейке. Сигнал для измерения 90-СР подается от другого источника света (15) через соответствующие светофильтры (14).
Объективом (13) этот свет фокусируется на торец световода диаметром 1 мм (12) и подается в ячейку. Рассеянный свет и свет люминесценции собирается контактным микрообъективом (7) и направляется в спектрограф. В спектрографе этот световой поток разлагается в спектр, выделенные участки которого попадают в приставку (1) на соответствующие ФЭУ. После усиления сигналы ФЭУ, ион-селективных электродов выводятся на монитор компьютера. Длина волны возбуждения флуоресценции - 337 нм, регистрации - 520 нм. Измеряемый сигнал регистрировали с помощью компьютера с частотой опроса 1 Гц. Значения интенсивности флуоресценции пересчитывали в [Ca2+]i, используя графическую программу Origin 7.0. [Са ], рассчитывали по формуле: [Ca K F-F F F), где; F-наблюдаемая интенсивность флуоресценции, Fmax - флуоресценция красителя, насыщенного Са2+, Fmin- флуоресценция красителя, свободного от Са2+, Ка = 224нМпри370С. Fmax измеряли после добавления 6 мкМ дигитонина. Fmin измеряли после добавления 4 мМ ЭГТА. Уровень собственной флуоресценции вычитали после добавления 100 мкМ Mn . Средние значения рассчитаны по 5-7 независимым экспериментам. 7. Используемые реактивы. В работе использовали СаС12 (Flow Laboratories, USA); HEPES, DMEM, среду Хенкса; Fura 2/AM, коллагеназу, норадреналин, изопротеренол, окадаиковую кислоту, дигитонин, ГВМХ, ВгсАМР, форсколин, Н-89 (Sigma, USA); BSA (Serva Germany); оксиметазолин (RBI, USA); циразолин (Synthekbo Recherche, Швеция); NaCl, KC1, глюкозу (Реахим, Россия); Г тапсигаргин, тимеросал, ОРС-3911, Ro 20-174 (Lund University); DMSO, фентоламин, надолол, нифедипин, иономицин.
Действие ингибиторов и активаторов сАМР-зависимого пути на Са2+-сигнал в преадипоцитах.
В связи с тем, что главенствующая роль в формировании Са2+-ответа в бурых преадипоцитах принадлежит р-адренорецепторам, нам представлялось весьма важным выяснить механизм, по которому активация р-адренорецепторов вызывает повышение уровня [Са2+]і в преадипоцитах. Наиболее вероятными причинами могли быть следующие; 3-адреноререцепторы непосредственно связаны с системой кальциевой сигнализации, например, через сопряженные с G-белками Са -каналы [Sako et al., 1997], либо аденилатциклазная система участвует в стимуляции Са -сигнала путем фосфорилирования Са -каналов протеинкиназой А, по типу описанному ранее для кардиомиоцитов [Sako et al., 1997]. На дифференцированных клетках бурого жира показано, что активация р-адренорецепторов приводит к опосредованной Gs-белками стимуляции аденилатциклазы (АЦ) и к образованию вторичного мессенджера сАМР [Chaudhry & Granneman, 1991; Svoboda et al, 1993; Abramson et al, 1999]. Увеличение внутриклеточного уровня сАМР можно достичь двумя способами: 1) либо добавлением к клеткам проникающего через плазматическую мембрану аналога с AMP - BrcAMP, 2) либо добавлением форсколина - непосредственного активатора аденилатциклазы. На рис. 9 представлены кинетики Са -ответов бурых преадипоцитов на норадреналин, ВгсАМР (500 цМ) и форсколин (10 цМ).
Как видно из рисунка, увеличение [Са2+]і в ответ на форсколин и ВгсАМР (кривые 3 и 4) заметно выше, чем при аппликации норадреналина, что еще раз подчеркивает ведущую роль р-адренорецепторов в формировании [Ca2+]i. В настоящем исследовании показано, что воздействия, приводящие к увеличению сАМР в преадипоцитах, вызывают повышение [Са ]j. Известно, что уровень с AMP в клетке определяется балансом между двумя процессами; процессом синтеза, опосредованным активацией аденилатциклазы, и процессом деградации, опосредованным активацией фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов (рис. И.). Неспецифическим ингибитором фосфодиэстераз циклических нуклеотидов является соединение 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX). Оптимальная концентрация IBMX для преадипоцитов бурого жира была выбрана в результате титрования вышеупомянутого ингибитора в широком диапазоне концентраций. Как следует из рисунка 12, добавление 30 цМ ШМХ является самой эффективной концентрацией. Таким образом, за счет ингибирования фосфодиэстераз в присутствии IBMX, происходит увеличение уровня с AMP, что и приводит к повышению кальциевого ответа на норадреналин. Показано, что в адипоцитах бурого жира наиболее широко представлены фосфодиэстеразы 3- и 4-типов [Degerman et al., 1987]. Селективными ингибиторами фосфодиэстераз 3- и 4-типов являются, такие соединения как ОРС-3911 и Ro-20-1724, соответственно. Ранее было показано, что ингибиторы фосфодиэстераз 3-й 4-типов синергично увеличивали внутриклеточный уровень с AMP [Poison & Strada, 1996]. Подобное явление наблюдалось, также на культивируемых дифференцированных бурых адипоцитах [Bronnikov et al., 1999b]. Совместное применение этих ингибиторов в данном исследовании на бурых преадипсцитах вызывало меньшее усиление Са2+-ответа на норадреналин, чем вызывали эти ингибиторы по отдельности (рис. 13.). На наш взгляд такое действие полностью согласуется с колокол оо бразньши кривыми дозозависимости эффекта BrcAMP (рис. 10.) и ЮМХ (рис. 12.) на величину Са2+-ответа в бурых преадипоцитах. Известно, что активность Са2+-каналов зрелых клеток модулируется процессами фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемыми протеинкиназой
А и серии- треонин специфической фосфатазой [Sako et al., 1997]. В данном исследовании показано, что специфический ингибитор протеинкиназы А (Н-89) подавлял Са2+-ответы на норадреналин дозозависимым образом (не показано) и форсколин. Значительное подавление Са2+ -ответа на форсколин ингибитором протеинкиназы А ([Н-89]= 1 цМ) составляло 55 % (рис. 14.). Добавление ингибитора фосфатазы, окадаиковой кислоты (ОК), существенно увеличивало Са2+-ответ на норадреналин (рис. 13.). Эти факты говорят в пользу того, что протеинкиназа А, фосфатаза и фосфодиэстераза участвуют в процессе формирования Са2+-ответа на норадреналин в бурых преадипоцитах. Таким образом, в данной работе показано, что Са -ответ в свежевыделенных бурых преадипоцитах инициируется главным образом через р-адренорецепторы и далее опосредуется через сАМР/протеинкиназа А-зависимый путь. Это является отличительной чертой бурых преадипоцитов. В зрелых адипоцитах Са2+-ответы инициируются через оц-адренорецепторы [Bronnikov et a!., 1999b; Zhang, 1999]. Колоколообразный характер кривой зависимости увеличения [Са ]І ОТ концентрации ВгсАМР в некоторой степени подобен колоколообразным дозозависимостям аккумуляции сАМР в зрелых бурых адипоцитах при аппликации норадреналина и изопротеренола [Bronnikov et al., 1999b]. Ингибирующее действие высоких концентраций (1-Ю цМ) норадреналина и изопротеренола в этом случае было обусловлено активацией ими Са2+-сигнала. Возросший уровень [Са +]j приводил к активации СаМ/Са2+-зависимой фосфодиэстеразы и расщеплению с AMP. Колоколообразный характер кривых может быть связан с наличием отрицательной обратной связи. Так, например, адренергическая стимуляция Са -каналов L-типа в кардиомиоцитах вызывает увеличение [Са ]„ что приводит к подавлению аккумуляции сАМР, связанному с Са2+-индуцированным ингибированием аденилатциклазы [Sako et al., 1998], либо -с активацией СаМ-зависимой фосфодиэстеразы [Yu et al., 1993]. Более того, с помощью моделирования показано, что наличие двух участков фосфорилирования Са2+-каналов в большей степени соответствует экспериментальным данным о двойственном эффекте изопротеренола на кардиомиоцитах [Hartzell et al., 1995; Kokoz et al., 1997; Kokoz et al., 1999]. В теоретическом исследовании
Ровати и Никоей [Rovati & Nicosia, 1994] представлены объяснения для колоколообразной доза-зависимости действия агонистов: что агонист может иметь двойной эффект на процесс трансдукции сигнала: 1) стимулирующий эффект при низких концентрациях и 2) ингибирующий эффект при более высоких концентрациях. Принимая во внимание, что сАМР является вторичным мессенджером для адренергически активированного Са2+-сигнала в преадипоцитах бурого жира, можно сказать, что кол околообразные кривые могут быть результатом отрицательной обратной связи: возросший уровень [Ca2+]j активирует фосфодиэстеразы, деградирующие сАМР. Ранее было показано, что в клетках предшественниках и в зрелых клетках присутствуют различные типы аденилатциклаз и фосфодиэстераз [Chaudhry et al., 1996; Rybalkin et al., 1997], и что Ca2+- зависимая активность этих ферментов реализует отрицательную обратную связь при повышении [Са +]І. Так, например, показано, что Са2+/СаМ-зависимая фосфодиэстераза в культивируемых зрелых бурых адипоцитах, была ответственна за ингибирование накопления сАМР и что увеличение уровня внутриклеточного Са всего лишь на 100 нМ было достаточно, чтобы уменьшить наполовину уровень внутриклеточного сАМР [Bronnikov et al., 1999b]. В настоящем исследовании показано, что воздействия, влияющие на образование с AMP, влияет и на величину кальциевого ответа клетки на адренергические агонисты. И активация р-адренорецепторов соответствующими агонистами, и активация непосредственно аденилатциклазы форсколином, и увеличение уровня сАМР в результате инкубирования с проникающим устойчивым аналогом с AMP (BrcAMP) - все эти воздействия приводили к увеличению [Ca2+]j. Ингибирование фосфодиэстераз в присутствии ГВМХ, также увеличивает кальциевый ответ на нор адреналин. Таким образом, во всех случаях воздействия, приводящие к увеличению концентрации сАМР, приводят к увеличению Са -сигнала клетки. Для дифференцированных клеток бурого жира, также показано, что аденилатциклазный путь является главенствующим, как в стимуляции синтеза ДНК и белка в пролиферирующих клетках [Broimikov et al., 1992; Fredriksson et al., 2000], так и в экспрессии белка - разобщителя, маркера дифференцировки взрослых клеток [Bronnikov et al., 1999b] и в стимуляции клеточного дыхания [Zhao et al., 1997]. В классическом аденилатциклазном сигнальном пути увеличение уровня сАМР приводит к активации сАМР-зависимой протеинкиназы, которая является ключевым ферментом ряда регуляторных процессов почти во всех типах клеток. Увеличение уровня фосфорилированного интермедиата, продукта протеинкиназы А, в присутствии ингибитора фосфатаз окадаиковой кислоты, или подавление активности протеинкиназы А (ПКА) ингибитором Н-89, также соответствующим образом отражается на уровне Са + в цитозоле [Долгачева и др., 2002].
