Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Химические факторы окружающей среды и ожирение 15
1.1 Современный взгляд на эпидемиологию и патогенез ожирения . 15
1.2 Влияние химических соединений на патогенез ожирения . 26
1.3 Возможные механизмы воздействия железа и меди на патогенез ожирения 28
Глава 2. Материалы и методы исследования . 33
2.1. Характеристика экспериментальных животных и условий их
содержания 33
2.2. Морфометрические методы 36
2.3. Гистологические методы . 38
2.4. Химические и биохимические методы анализа 39
2.5. Статистический анализ полученных результатов . 42
Глава 3. Собственные исследования 43
3.1 Влияние солей железа и меди на анатомо-физиологические показатели животных при стандартной и высоко-жировой диетах . 43
3.2 Влияние солей железа и меди на морфологию жировой ткани животных при стандартной и высоко-жировой диетах 47
3.3 Влияние солей железа и меди на содержание металлов в организме животных при стандартной и высоко-жировой диетах . 53
3.4 Влияние солей железа и меди на показатели метаболической дисфункции жировой ткани при стандартной и высоко-жировой диетах 58
3.5 Влияние солей железа и меди на состояние липидтранспортной системы лабораторных животных при стандартной и высоко-жировой диетах 64
3.6 Влияние солей железа и меди на состояние процессов свободнорадикального окисления в организме животных при стандартной и высоко-жировой диетах 68
3.7 Влияние перинатального воздействия железа на анатомо-физиологические показатели потомства . 73
3.8 Влияние перинатального воздействия солей железа на морфологию жировой ткани животных при стандартной и высоко-жировой диетах 76
3.9 Влияние перинатального поступления солей железа на содержание металлов в организме животных при стандартной и высоко-жировой диетах . 79
3.10 Влияние перинатального поступления солей железа в организм на показатели метаболической дисфункции жировой ткани при стандартной и высоко-жировой диетах 82
3.11 Влияние перинатального воздействия железа на состояние липидтранспортной системы лабораторных животных при стандартной и высоко-жировой диетах . 87
3.12 Влияние перинатального поступления солей железа на состояние процессов свободнорадикального окисления в организме животных при стандартной и высоко-жировой диетах . 89
Заключение 94
Выводы 98
Список сокращений 99
Список литературы
- Влияние химических соединений на патогенез ожирения
- Химические и биохимические методы анализа
- Влияние солей железа и меди на показатели метаболической дисфункции жировой ткани при стандартной и высоко-жировой диетах
- Влияние перинатального воздействия железа на анатомо-физиологические показатели потомства
Влияние химических соединений на патогенез ожирения
Исследования проведены на 108 крысах линии Wistar (58 самок и 50 самцов), полученных из питомника филиал "Столбовая" ГУ НЦБМТ РАМН и в условиях вивария (при исследовании перинатального программирования ожирения), в соответствии с «Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных». Заключение локального этического комитета на проведение серии экспериментов получено 26.09.2012 г (протокол заседания Локального Этического Комитета ГБОУ ВПО ОрГМА №68).
Для изучения влияния железа и меди на развитие ожирения использовались две экспериментальные модели: модель алиментарного ожирения с алиментарным поступлением солей металлов в организм, а также модель перинатального программирования ожирения путем воздействия исследуемого фактора на материнский организм с последующей регистрацией чувствительности потомства к развитию алиментарного ожирения во взрослом возрасте. Планирование эксперимента проводилось совместно с научным руководителем, д.м.н., профессором Никоноровым А. А. (зав. кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России).
В ходе эксперимента по исследованию влияния употребления железа и меди с питьевой водой на интенсивность адипогенеза животные содержались на стандартной диете (СТД) и высоко-жировой диете (ВЖД). В качестве питьевой воды использовали бутилированную воду высшей категории. Для изучения влияния железа и меди на исследуемые параметры к питьевой воде животных опытных групп добавляли сульфаты железа и меди для получения растворов соответствующих концентраций. Животные I и V групп получали чистую питьевую воду на фоне СД и ВЖД, являясь, таким образом, контрольными. Крысы II (Fe-СТД), III (Cu-СТД) и IV (Fe/Cu-СТД) групп получали на фоне СТД сульфат железа, сульфат меди, а также комбинацию сульфатов железа и меди соответственно. Животные VI (Fe-ВЖД), VII (Cu-ВЖД) и VIII (Fe/Cu-ВЖД) групп получали вышеуказанные металлы в соответствующих дозах и комбинациях на фоне ВЖД.
Содержание животных, находившихся в эксперименте по изучению влияния алиментарного поступления солей железа и меди на развитие ожирения, производилось совместно со студенткой VI курса лечебного факультета ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России Рогачевой М. Н.
Для исследования влияния перинатального воздействия железа на изучаемые параметры у потомства 10 крыс самок линии Wistar были скрещены с самцами крыс соответствующей линии и возраста. После выявления признаков беременности самки были распределены по индивидуальным клеткам и разделены на 2 группы (n=5). Первая группа (I), являющаяся контрольной, в течение всей беременности и лактации получала чистую питьевую воду, вторая группа (II) - получала с питьевой водой сульфат железа, начиная со 2 недели беременности вплоть до окончания лактации. По окончании лактации потомство было взвешено и распределено по полу. В исследовании использовались особи мужского пола одинакового веса. 50% приплода мужского пола от самок I и II группы содержались на СТД. Оставшиеся 50% приплода мужского пола содержались в постнатальном периоде на ВЖД. В качестве питьевой воды все 4 группы животных получали чистую питьевую воду.
Используемые концентрации сульфатов железа и меди были рассчитаны на основе предельно допустимых концентраций (ПДК), действующих на территории Российской Федерации (ГН 2.1.5.1315-03) и составляющих 0,3 мг/л и 1,0 мг/л для железа и меди соответственно. Пересчет производился на используемые соли: семиводный сульфат железа (FeSO47H2O) и безводный сульфат меди (CuSO4). Таким образом, 1 ПДК для железа и меди соответствовали концентрации FeSO47H2O и CuSO4 в воде, равные 1,5 мг/л и 2,44 мг/л соответственно. В исследовании использовалась доза солей металлов в питьевой воде с превышением ПДК в 2 раза с целью создания условий избыточного их поступления в организм (3 мг/л FeSO47H2O и 4,88 мг/л CuSO4). При исследовании влияния комбинированного поступления сульфатов железа и меди в организм животных на определяемые параметры рассчитывался суммарный ПДК, используемый при одновременном поступлении двух и более веществ. Суммарный ПДК также был равен 2, в связи с чем концентрация сульфатов железа и меди составляла по 1 ПДК. Данный подход позволяет выявить эффект потенцирования соединений, в то время как использование в комбинации исходных концентраций (2 ПДК) позволит установить лишь суммированный эффект.
Химические и биохимические методы анализа
Как видно из данных, представленных в таблице 3.4, употребление исследуемых солей железа и меди оказывало значительное влияние на размер адипоцитов. Так, в случае изолированного воздействия металлов (3 мг/л сульфата железа, 4.88 мг/л сульфата меди), а также их комбинации (1,5 и 2,44 мг/л соответственно) при стандартной диете наблюдалось увеличению средней площади поперечного сечения адипоцита на 76, 23 и 89%, соответственно, по сравнению с показателями СТД-контроля. Соответствующими изменениями характеризовались и другие цитометрические показатели адипоцитов параметрия. В частности, увеличение значений периметра адипоцитов в группах Fe-СТД, Cu-СТД и Fe/Cu-СТД составило 38, 22 и 53% соответственно относительно СТД-контроля. При этом изменение минимального диаметра Feret адипоцитов параметрия в соответствующих экспериментальных группах было менее выраженным и составило 35, 12 и 41% соответственно, по сравнению с показателями СТД-контрольной группы, однако также являлось статистически значимым.
Подобное модулирующее влияние солей железа и меди на размер адипоцитов отмечалось и при содержании животных на высоко-жировой диете. В частности, поступление в организм животных, получающих ВЖД, 3 мг/л сульфата железа и комбинации сульфатов железа и меди в исследуемых концентрациях, приводило к увеличению, как средней площади поперечного сечения адипоцитов параметрия на 22 и 108% соответственно, так и периметра адипоцитов на 24 и 69% соответственно по сравнению с ВЖД-контролем. Таблица 3.4 - Влияние сульфатов железа и меди на цитометрические и гистологические показатели жировой ткани при стандартной и высоко-жировой диетах № III III IV V VI VII VIII Группа Площадь, мкм2 Периметр, мкм Мин. диаметр Feret, мкм МЦР, уд. плотность. СТД 1035,74 ±687,02 139,24 ±50,16 28,61 ±10,29 4,0±0,5 Fe-СТД 1823,87 ±1218,46 193,61±7,13 38,69 ±1,36 3,0 ±0,4 Си-СТД 1276,91 ±871,80 170,25 ±71,68 32,08 ±13,64 4,5±0,2 Fe/Cu-СТД 1957,92 ±1129,75 214,23±65,75 40,41 ±12,91 3,2 ±0,1 ВЖД 2771,59 ±1872,26 225,32 ±90,40 43,40 ±18,76 3,5 ±0,7 Fe-ВЖД 3379,89 ±2263,16 f 280,33 ±102,20 f 53,27 ±19,77 f 2,0 ±0,l f Си-ВЖД 2700,05 ±1923,81 237,34 ±81,16 47,76 ±17,44 4,2 ±0,7 Fe/Cu-ВЖД 5783,36 ±2805,24 f 381,91 ±101,80 f 68,17 ±20,64 f 1,9 ±0,l f До t До :товерность ОТЛИЧИЙ относительно СТД-контроля (р 0.05) :товерность отличий относительно ВЖД-контроля (р 0.05)
При этом значения минимального диаметра Feret адипоцитов у животных Fe-ВЖД и Fe/Cu-ВЖД групп превышали ВЖД-контрольные показатели на 23 и 57% соответственно. Стоит отметить, что изолированное воздействие сульфата меди в исследуемой концентрации фоне высоко-жирового рациона не приводило к достоверному изменению значений площади поперечного сечения, периметра и минимального диаметра Feret адипоцитов по сравнению с ВЖД-контролем.
В таблице 3.4 также приведены данные об изменении удельной плотности сосудов микроциркуляторного русла под влиянием исследуемых металлов. Как видно из представленных данных, употребление с питьевой водой железа, меди и их комбинации животными, содержащимися на стандартной диете, не приводило к статистически значимому изменению удельной плотности сосудов микроциркуляторного русла. При этом в случае ВЖД, как сульфат железа, так и комбинация сульфатов железа и меди в исследуемых концентрациях, индуцировали уменьшение удельной плотности сосудов МЦР на 42 и 45% соответственно. Следует отметить, что, несмотря на некоторое увеличение количества сосудов МЦР в жировой ткани у животных как Cu-СТД, так и Cu-ВЖД групп, оно, тем не менее, не являлось достоверным.
Результаты многофакторного дисперсионного анализа показали, что, как и в случае морфометрических показателей животных, наибольшим статистическим влиянием на цитометрические показатели адипоцитов обладал тип диеты (Таблица 3.5). При этом поступление в организм сульфата железа также оказывало достоверное влияние на площадь поперечного сечения, периметр и минимальный диаметр Feret адипоцита. В то же время, сульфат меди обладал достоверным воздействием на периметр и минимальный диаметр Feret адипоцитов параметрия, в то время как площадь поперечного сечения клеток слабо зависела от поступления данного металла. Взаимодействие между металлами во время их комбинированного поступления также характеризовалось достоверным влиянием на цитометрические показатели адипоцитов. Подобный статистический эффект был характерен и для взаимодействия между факторами Fe-Диета, а также Fe/Cu-Диета. При этом взаимодействие между факторами Cu Диета оказывало достоверное влияние на периметр и диаметр Feret, не влияя на площадь поперечного сечения адипоцитов. Следует отметить, что многофакторный дисперсионный анализ показал отсутствие достоверного влияния отдельных факторов (диета, металлы) на удельную плотность сосудов МЦР в жировой ткани. Тем не менее, влияние типа диеты, железа, а также комбинации изучаемых металлов на данный показатель было МЦР в параметрии находились под достоверным влиянием факториального взаимодействия (Fe-диета, Fe/Cu-диета). В свою очередь, взаимодействие между поступлением меди и типом диеты не оказывало статистически значимого влияния на данный параметр.близко к статистически значимому. При этом значения удельной площади сосудов
Влияние солей железа и меди на показатели метаболической дисфункции жировой ткани при стандартной и высоко-жировой диетах
Как видно из данных, представленных в таблице 3.4, употребление исследуемых солей железа и меди оказывало значительное влияние на размер адипоцитов. Так, в случае изолированного воздействия металлов (3 мг/л сульфата железа, 4.88 мг/л сульфата меди), а также их комбинации (1,5 и 2,44 мг/л соответственно) при стандартной диете наблюдалось увеличению средней площади поперечного сечения адипоцита на 76, 23 и 89%, соответственно, по сравнению с показателями СТД-контроля. Соответствующими изменениями характеризовались и другие цитометрические показатели адипоцитов параметрия. В частности, увеличение значений периметра адипоцитов в группах Fe-СТД, Cu-СТД и Fe/Cu-СТД составило 38, 22 и 53% соответственно относительно СТД-контроля. При этом изменение минимального диаметра Feret адипоцитов параметрия в соответствующих экспериментальных группах было менее выраженным и составило 35, 12 и 41% соответственно, по сравнению с показателями СТД-контрольной группы, однако также являлось статистически значимым.
Подобное модулирующее влияние солей железа и меди на размер адипоцитов отмечалось и при содержании животных на высоко-жировой диете. В частности, поступление в организм животных, получающих ВЖД, 3 мг/л сульфата железа и комбинации сульфатов железа и меди в исследуемых концентрациях, приводило к увеличению, как средней площади поперечного сечения адипоцитов параметрия на 22 и 108% соответственно, так и периметра адипоцитов на 24 и 69% соответственно по сравнению с ВЖД-контролем. Таблица 3.4 - Влияние сульфатов железа и меди на цитометрические и гистологические показатели жировой ткани при стандартной и высоко-жировой диетах
При этом значения минимального диаметра Feret адипоцитов у животных Fe-ВЖД и Fe/Cu-ВЖД групп превышали ВЖД-контрольные показатели на 23 и 57% соответственно. Стоит отметить, что изолированное воздействие сульфата меди в исследуемой концентрации фоне высоко-жирового рациона не приводило к достоверному изменению значений площади поперечного сечения, периметра и минимального диаметра Feret адипоцитов по сравнению с ВЖД-контролем.
В таблице 3.4 также приведены данные об изменении удельной плотности сосудов микроциркуляторного русла под влиянием исследуемых металлов. Как видно из представленных данных, употребление с питьевой водой железа, меди и их комбинации животными, содержащимися на стандартной диете, не приводило к статистически значимому изменению удельной плотности сосудов микроциркуляторного русла. При этом в случае ВЖД, как сульфат железа, так и комбинация сульфатов железа и меди в исследуемых концентрациях, индуцировали уменьшение удельной плотности сосудов МЦР на 42 и 45% соответственно. Следует отметить, что, несмотря на некоторое увеличение количества сосудов МЦР в жировой ткани у животных как Cu-СТД, так и Cu-ВЖД групп, оно, тем не менее, не являлось достоверным.
Результаты многофакторного дисперсионного анализа показали, что, как и в случае морфометрических показателей животных, наибольшим статистическим влиянием на цитометрические показатели адипоцитов обладал тип диеты (Таблица 3.5). При этом поступление в организм сульфата железа также оказывало достоверное влияние на площадь поперечного сечения, периметр и минимальный диаметр Feret адипоцита. В то же время, сульфат меди обладал достоверным воздействием на периметр и минимальный диаметр Feret адипоцитов параметрия, в то время как площадь поперечного сечения клеток слабо зависела от поступления данного металла. Взаимодействие между металлами во время их комбинированного поступления также характеризовалось достоверным влиянием на цитометрические показатели адипоцитов. Подобный статистический эффект был характерен и для взаимодействия между факторами Fe-Диета, а также Fe/Cu-Диета. При этом взаимодействие между факторами Cu Диета оказывало достоверное влияние на периметр и диаметр Feret, не влияя на площадь поперечного сечения адипоцитов. Следует отметить, что многофакторный дисперсионный анализ показал отсутствие достоверного влияния отдельных факторов (диета, металлы) на удельную плотность сосудов МЦР в жировой ткани. Тем не менее, влияние типа диеты, железа, а также комбинации изучаемых металлов на данный показатель было близко к статистически значимому. При этом значения удельной площади сосудов МЦР в параметрии находились под достоверным влиянием факториального взаимодействия (Fe-диета, Fe/Cu-диета). В свою очередь, взаимодействие между поступлением меди и типом диеты не оказывало статистически значимого влияния на данный параметр.
Гистологическое исследование жировой ткани, полученной от животных, содержащихся на стандартном рационе, показало, что употребление сульфатов железа и меди оказывало влияние на клеточный состав исследуемой ткани. Так, в препаратах жировой ткани СТД-контрольных животных (Микрофотография 3.1a) отмечались лишь единичные лимфоциты и резидентные макрофаги без признаков инфильтрации. В то же время, в образцах жировой ткани крыс, получающих с питьевой водой 3 мг/л сульфата железа на фоне СТД, наблюдалась лимфогистиоцитарная инфильтрация. Микрофотография 3.1 – Снимки гистологических препаратов жировой ткани животных, получающих соли железа и меди при содержании на стандартной диете (увеличение х150, окраска гематоксилин-эозин). Примечание: a – Контрольные СТД-животные; b – Fe-СТД животные; c – Cu-СТД животные; d – Fe/Cu-СТД животные. Короноподобные структуры из макрофагов показаны стрелками; СС – синцитиальные структуры; ПВИ – периваскулярная инфильтрация.
Влияние перинатального воздействия железа на анатомо-физиологические показатели потомства
Таким образом, результаты исследования показали, что поступление в организм экспериментальных животных солей железа и меди сопровождается активацией адипогенеза, проявляющееся увеличением значений морфометрических показателей животных, а также гипертрофией адипоцитов вне зависимости от периода поступления металлов (перинатальный, постнатальный). Стоит отметить, что исследуемые металлы обладали потенцирующим влиянием на адипогенный эффект высоко-жировой диеты. Тем не менее, даже при содержании животных на стандартной диете, употребление сульфатов как железа, так и меди, сопровождалось увеличением размера адипоцитов, что свидетельствует о начале гипертрофических процессов в жировой ткани [52]. Более того, был выявлен факт стимулирующего влияния изучаемых ионов металлов на ремоделирование жировой ткани. В частности, наблюдаемое уменьшение удельной плотности сосудов микроциркуляторного русла свидетельствует о развитии гипоксии в образцах висцеральной жировой ткани, что является характерной чертой прогрессии ожирения [103]. Поступление в организм солей железа и меди также способствует развитию лимфогистиоцитарной инфильтрации жировой ткани. В частности, увеличение количества макрофагов свидетельствует о наличии воспалительных изменений в жировой ткани. Наблюдающиеся «короноподобные» и синцитиальные структуры макрофагального происхождения, располагающиеся вокруг адипоцитов, свидетельствуют в пользу апоптоза/некроза последних [53]. Зафиксировано увеличение содержания тучных клеток с признаками дегрануляции в препаратах жировой ткани животных, подвергшихся перинатальному воздействию железа с последующим содержанием на высоко-жировом рационе. Данное обстоятельство свидетельствует о развитии воспалительного процесса в жировой ткани, опосредованного тучными клетками [142]. Развитие гипертрофии и воспаления жировой ткани сопровождается характерными изменениями уровня адипокинов и провоспалительных цитокинов в сыворотке, свидетельствующими о развитии эндокринной дисфункции жировой ткани. Увеличение уровня глюкозы, инсулина и индекса инсулинорезистентности HOMA-IR под влиянием металлов, поступающих как в перинатальный, так и постнатальный период, и высоко-жировой диеты свидетельствует о развитии инсулинорезистентности, которая является сопутствующей патологией при ожирении [27]. При этом справедливо предположить, что одним из механизмов металл-индуцированной инсулинорезистентности является снижение содержания в жировой ткани хрома и ванадия, выполняющих инсулиносенсибилизирующие функции [48, 154].
Незначительное нарушение липопротеинового профиля, а также более выраженное изменение апопротеинового профиля сыворотки крови лабораторных животных под влиянием исследуемых металлов могут свидетельствовать о начальных этапах атерогенеза. Стоит отметить, что склонность к атерогенезу часто сопровождает развитие клинического ожирения [179]. Несмотря на отсутствие выраженных изменений в липопротеиновом профиле сыворотки крови животных, как перинатальное, так и постнатальное воздействие железа, способствовало развитию гипертриацилглицеридемии у животных, содержащихся на ВЖД. Данное обстоятельство имеет важное значение в прогрессии метаболического синдрома, поскольку повышение концентрации ТАГ в сыворотке крови нарушает транспорт лептина через гематоэнцефалический барьер, способствуя развитию лептинорезистентности [33].
Увеличение концентрации продуктов свободнорадикального окисления в сыворотке крови животных, употребляющих с питьевой водой соли исследуемых металлов, свидетельствует о развитии системного окислительного стресса, характерного для ожирения [77, 126]. Увеличение содержания ТБК-РС в гомогенатах жировой ткани животных, содержащихся на СТД и получающих с питьевой водой соли металлов, свидетельствует о развитии локального окислительного стресса, предположительно, являющегося одним из пусковых механизмов эндокринной дисфункции жировой ткани [155]. Наблюдаемое отсутствие выраженной активации свободнорадикального окисления в жировой ткани крыс получающих с питьевой водой соли металлов на фоне ВЖД, по всей видимости, является следствием высокого содержания насыщенных жирных кислот в данной диете. Так, насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты в значительно меньшей степени подвержены свободнорадикальному окислению, чем полиненасыщенные жирные кислоты [60]. Насыщенные жирные кислоты также обладают более выраженной способностью ингибировать образование ТБК-РС в среде [187]. В то же время, имеются данные, указывающие на возможность связывания ионов железа насыщенными жирными кислотами, что снижает их каталитическую активность [30]. Данное обстоятельство объясняет достоверно меньшее прооксидантное действие ионов железа в группе крыс, получающих сульфат железа на фоне высоко-жировой диеты, по сравнению с животными, получающими те же концентрации солей железа на фоне стандартной диеты.
В то же время, наблюдаемая активация процессов свободнорадикального окисления в жировой ткани под влиянием перинатального поступления в организм железа, а также высоко-жировой диеты, свидетельствует в пользу значимой роли локального окислительного стресса в развитии эндокринной дисфункции.
Наблюдаемые изменения содержания железа и меди в шерсти животных свидетельствуют об их дозозависимой кумуляции в организме. При этом значительное увеличение содержания железа в жировой ткани свидетельствует, что данная ткань является мишенью для ионов железа. Тем более что результаты гистохимического анализа позволяют сделать вывод, что непосредственно в жировой ткани железо локализуется в цитоплазме адипоцитов, где, предположительно и реализует свои свойства [171], приводящие, в конечном счете, к развитию эндокринной дисфункции жировой ткани. В свою очередь, относительное постоянство уровня меди в жировой ткани указывает на то, что проадипогенное действие меди реализуется, по всей видимости, на более высоких уровнях регуляции энергетического гомеостаза. В качестве возможной мишени для ионов меди выступает центр регуляции аппетита в гипоталамусе [140]. Данный факт позволяет, по крайней мере частично, объяснить более выраженный эффект комбинации сульфатов железа и меди в потенцировании адипогенного эффекта высоко-жировой диеты.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что как железо, так и медь потенцируют адипогенный эффект высоко-жировой диеты при их поступлении в организм. Также отмечено, что употребление солей железа и меди на фоне стандартного рациона, хотя и не приводило к развитию ожирения, сопровождалось инициацией ряда процессов, имеющих принципиальное значение для патогенеза ожирения.
