Содержание к диссертации
Список принятых сокращений 5
I. ВВЕДЕНИЕ 6
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1. Обмен гликозаминогликанов 12
2.1.1. Структурно-фунциональная характеристика гликозаминогликанов 12
2.1.2. Биохимические особенности функционирования глюкуронат-ксилулозного цикла 15
2.1.3. Роль гликозаминогликанов в функционировании органов и тканей 20
2.2. Общая характеристика основных теорий старения 22
2.2.1. Свободно-радикальная теория старения 22
2.2.2. Генетическая теория старения 23
2.2.3. Элевационная теория старения 25
2.2.4. Иммунологическая теория старения 30
2.3. Особенности нарушений биохимического гомеостаза при старении... 31
2.3.1. Возрастная динамика биохимических показателей печени 31
2.3.2. Возрастная динамика биохимических показателей головного мозга 36
2.3.3. Возрастная динамика биохимических показателей кожи 38
2.3.4. Возрастная динамика биохимических показателей сыворотки крови 42
2.4. Современные представления о биохимических механизмах фармакологической активности аскорбиновой кислоты 49
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 58
3.1. Определение фракционного состава гликозаминогликанов в органах 58
3.2. Определение аминосахаров 60
3.3. Определение нейтральных Сахаров 61
3.4. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
3.5. Определение белка по Лоури 61
3.6. Определение фракционного состава белков и липопротеинов сыворотки крови 63
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 64
4.1. Влияние возраста на содержание гликозаминогликанов и их фракций в органах животных 64
4.2. Влияние аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов и их фракций в органах 12-месячных животных... 73
4.3. Влияние аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов и их фракций в органах 18-месячных животных 80
4.4. Влияние возраста на содержание аминосахаров во фракциях гликозаминогликанов 87
4.5. Влияние возраста на содержание нейтральных Сахаров во фракциях гликозаминогликанов 92
4.6. Влияние аскорбиновой кислоты на содержание аминосахаров во фракциях гликозаминогликанов в органах 12-месячных крыс 96
4.7. Влияние аскорбиновой кислоты на содержание нейтральных Сахаров во фракциях гликозаминогликанов в органах 12-месячных крыс 100
4.8. Влияние аскорбиновой кислоты на содержание аминосахаров во фракциях гликозаминогликанов в органах 18-месячных крыс 103
4.9. Влияние аскорбиновой кислоты на содержание нейтральных Сахаров во фракциях гликозаминогликанов в органах 18-месячных крыс 107
4.10. Влияние возраста на содержание белков и липопрпотеинов в сыворотке крови 110
4.11. Влияние аскорбиновой кислоты содержание белков, липопротеинов в сыворотке крови крыс 12 и 18- месяцев 113
4.12. Влияние аскорбиновой кислоты на биосинтез нуклеиновых кислот в органах крыс 115
V. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 119
VI. ВЫВОДЫ 125
VII. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 126
VIII. ПРИЛОЖЕНИЕ 157
Введение к работе
Актуальность работы. На сегодняшний день не существует однозначного мнения о биохимических механизмах старения и их регуляции [5, 65, 157]. Многочисленные данные литературных источников констатируют наличие возрастных изменений концентраций низко- и высокомолекулярных эндогенных соединений в органах и тканях организма человека и животных, при этом наблюдения авторов фрагментарны и часто противоречат друг другу. Известно, что внешние и внутренние проявления старения, с позиций медицинской биохимии, обусловлены изменением количественного и качественного состава биополимеров межклеточного вещества (матрикса) соединительной ткани органов, основными из которых являются гликозаминогликаны (ГАГ) [57, 176]. С возрастом изменяется фракционный состав ГАГ, прежде всего, за счет уменьшения доли гиалуроновой кислоты (ГК), что, в частности, приводит к уменьшению влагоудерживающих возможностей тканей и внешне проявляется снижением их тургора и пастозностью.
Отметим, что ГАГ метаболизируются в глюкуронат-ксилулозном метаболическом цикле (ГКЦ) [39], и для замедления процессов старения представляется обоснованным в разумных пределах замедлить (оптимизировать) процесс биосинтеза гликозаминогликанов. Представляется весьма вероятным, что этого эффекта можно добиться за счет нагрузки ГКЦ продуктами метаболизма гликозаминогликанов, что по механизму обратной связи обеспечит замедление биосинтеза этих полисахаридов и, как следствие, протеогликанов. Наиболее перспективным кандидатом на роль такого метаболита выступает аскорбиновая кислота. Применяя аскорбиновую кислоту в больших дозах, можно замедлить процессы старения [278].
В организме крыс аскорбиновая кислота (АК) синтезируется в глюкуронат-ксилулозном цикле в количестве примерно 50 мг/кг в сутки и является одним из метаболитов биосинтеза гликозаминогликанов (ГАГ). У приматов (в том числе человека) и морских свинок аскорбиновая кислота не синтезируется из-за отсутствия двух специфических ферментов ГКЦ (L-гулонат: гулоно-у-лактонгидролазы (альдонолактоназы) 3.1.1.18 и гулоно-у-лактон: кислород-оксидоредуктазы (L-гулонолактоноксидазы) 1.1.3.8 [39]. Она относится к витаминам, однако, по механизму своего действия является типичным физиологическим метаболитом.
Катаболизм гликозаминогликанов с образованием аскорбиновой кислоты у крыс протекает таюке в глюкуронат-ксилулозном цикле, поэтому представляется вероятным, что нагрузка этого цикла большим количеством АК должна замедлить катаболизм ГАГ, замедляя процессы старения, и направить основной предшественник их синтеза - УДФ-глюкуроновую кислоту в реакции глюкуронидной конъюгации, обеспечивающие процессы детоксикации в организме и тем самым повышая его неспецифическую резистентность. В качестве уровней однократного воздействия аскорбиновой кислоты нами были выбраны дозы 100 и 500 мг/кг, превышающие нормальный биосинтез этого метаболита у крыс соответственно в 2 и 10 раз и не вызывающие летальных эффектов, что не противоречит основным фармакологическим принципам испытания биологической активности веществ. В указанной связи следует отметить, что в фармакологических исследованиях часто используются дозы 1/10 - 1/30 от уровня среднесмертельного воздействия, то есть ОТ DL5o.
К эмпирическим предпосылкам настоящей работы можно отнести экспериментальные данные о фармакологической эффективности больших дозировок аскорбиновой кислоты, полученные дважды лауреатом Нобелевской премии Лайнусом Полингом и опубликованные им в работах «Витамин С и простуда» («Vitamin С and the Common Cold») [278] и «Рак и витамин С» («Cancer and Vitamin С»). В этих книгах Л. Полинг отмечал, что систематическое применение больших доз аскорбиновой кислоты улучшает состояние больных. На наш взгляд, это заключение свидетельствует в пользу доводов о повышении аскорбиновой кислотой неспецифической резистентности организма.
Таким образом, выбирая аскорбиновую кислоту в качестве средства, модулирующего обмен веществ, можно решить следующие задачи, а именно: предложить новые подходы к геропротеїщии путем регуляции обмена веществ нормальными метаболитами на примере аскорбиновой кислоты для аскорбат-независимого вида (крыс) и сделать с учетом полученных результатов и сведений научной литературы теоретическую попытку экстраполировать полученные результаты на аскорбат-зависимые виды, в том числе человека.
По данным физиологических и биохимических исследований [103], скорость старения организма обратно пропорциональна эффективности функционирования его печени. В свою очередь, с состоянием печени напрямую связан обмен других биополимеров - липопротеинов [70, 71, 73, 75], нуклеиновых кислот (НК) [ПО], протеогликанов, гликопротеинов [58, 59].
Подводя итог вышеуказанному, отметим, что необходимым условием прогнозирования геропротекторного эффекта у аскорбиновой кислоты является доказательство ее способности проявлять антагонизм в отношении возраст-зависимых сдвигов биохимических показателей и, прежде всего, снижения содержания в органах и тканях гиалуроновой кислоты.
Цель исследования: оценить влияние возраста и аскорбиновой кислоты на содержание нуклеиновых кислот, белково-липопротеиновый состав крови, содержание гликозаминогликанов и их фракционный и состав в органах и тканях крыс различного возраста.
Задачи исследования:
1. Определить содержание гликозаминогликанов и их фракций (гиалуроновой кислоты, хондроитин- и гепарансульфатов) в печени, головном мозге и коже крыс различного возраста.
2. Изучить возрастные особенности содержания нуклеиновых кислот в органах и белково-липопротеиновый состав крови крыс различного возраста.
3. Изучить влияние больших доз аскорбиновой кислоты на спектр гликозаминогликанов и их фракций (гиалуроновой кислоты, хондр оитин- и гепарансульфатов) в печени, головном мозге и коже крыс различного возраста.
4. Оценить влияние больших доз аскорбиновой кислоты4 на содержание нуклеиновых кислот в органах и белково-липопротеиновый состав крови крыс различного возраста.
5. Оценить возможность использования показателей гликозаминогликанов в качестве биохимических маркеров возрастных изменений организма.
Научная новизна Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о патохимических процессах старения организма и биохимических механизмах, лежащих в основе фармакологических эффектов аскорбиновой кислоты. Показано, что с возрастом в органах и тканях подопытных крыс уменьшается уровень гиалуроновой кислоты и возрастает содержание сульфатированных гликозаминогликанов - хондроитин- и гепарансульфатов, а в сыворотке крови крыс - повышается содержание общего белка, р-липопротеинов и снижается уровень альбумина и а-липопротеинов. Впервые установлено, что в организме стареющих белых неинбредных крыс аскорбиновая кислота в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг способствует уменьшению содержания гликозаминогликанов в органах и тканях крыс, также способствует повышению содержания нуклеиновых кислот в печени. В этих же дозах аскорбиновая кислота проявляет антагонизм в отношении возраст-зависимого снижения концентрации гиалуроновой кислоты, способствуя повышению ее содержания в органах и тканях крыс, и уменьшению концентрации сульфатированных ГАГ -хондроитин- и гепарансульфатов.
Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что гиалуроновая кислота, но не суммарные гликозаминогликаны, может выступать в качестве биохимического маркера интенсивности процессов ртарения организма. Практически продемонстрировано, что физиологический метаболит (в нашем случае аскорбиновая кислота) может быть использован для биохимического регулирования обмена биополимеров в организме. Представляются перспективными дальнейшие исследования аскорбиновой кислоты в качестве средства, влияющего на количественный и качественный состав гликозаминогликанов в органах и тканях.
На защиту выносятся следующие научные положения:
1. С возрастом наблюдается уменьшение соотношений несульфатированные : сульфатированные гликозаминогликаны; альбумин : общий белок; а-липопротеины : Р-липопротеины.
2. Аскорбиновая кислота в дозах 100 и 500 мг/кг проявляет антагонизм в отношении возраст-зависимого снижения концентрации гиалуроновой кислоты в органах и тканях крыс, а также содержания альбуминовой и а-липопротеиновой фракций сыворотки крови.
3. Применение аскорбиновой кислоты в дозах 100 и 500 мг/кг способствует повышению содержания нуклеиновых кислот в печени.
4. Представляется перспективным изучение аскорбиновой кислоты в качестве потенциального геропротектора.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийских научно-практических конференциях «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Уфа, 2006, 2007); на V Международной научно-практической конференции «Новые медицинские технологии в охране здоровья здоровых, в диагностике, лечении и реабилитации больных» (Пенза, 2007); на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007);
на научной конференции аспирантов и молодых ученых «Молодежь, образование, наука» (Уфа, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 страницах, содержит 80 таблиц, 39 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 335 источников, из которых 137 отечественных и 198 иностранных авторов, приложения.
