Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Современные представления о развитии гипоксического синдрома 11
1.2. Роль свободнорадикальных процессов в организме при развитии гипоксического синдрома 18
1.3. Система антиоксидантной защиты клетки 24
1.4. Фармакологическая коррекция гипоксических состояний 33
1.5. Характеристика флавоноидных соединений 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Постановка эксперимента 50
2.2. Получение биологического материала 51
2.2.1. Получение плазмы крови 51
2.2.2. Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизатов 51
2.2.3. Приготовление гомогенатов тканей 52
2.3. Биохимические методы исследования 52
2.3.1. Определение коньюгированных диенов в плазме крови и гомогенатах тканей 52
2.3.2. Метод определения содержания малонового диальдегида 53
2.3.3. Определение содержания оснований Шиффа 54
2.3.4. Определение активности супероксиддисмутазы 54
2.3.5. Определение активности каталазы 56
2.3.6. Определение суммарной пероксидазной активности (СПА) 56
2.3.7. Метод определения активности глутатионпероксидазы 57
2.3.8. Метод определения активности глутатионредуктазы 58
2.3.9. Определение оксидазной активности церулоплазмина 58
2.3.10. Определение содержания сульфгидрильных групп 58
2.3.11. Определение содержания белка 59.
2.4. Морфологические исследования 59
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 60
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 62
3.1. Влияние кверцетина и дигидрокверцетина на свободнорадикальные процессы в головном мозге, печени, сердце и крови крыс при острой гипоксической гипоксии 62
3.1.1. Влияние гипоксической гипоксии на свободнорадикальные процессы в тканях крыс 62
3.1.2. Антиоксидантное действие кверцетина при острой гипоксической гипоксии 66
3.1.3. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина при острой гипоксической гипоксии 73
3.2. Влияние флавоноидов на морфологическую структуру органов и тканей и индекс деформируемости эритроцитов при острой гипоксической гипоксии 81
Глава 4. Заключение 91
Выводы 109
Список литературы 119
Приложение 147
- Роль свободнорадикальных процессов в организме при развитии гипоксического синдрома
- Характеристика флавоноидных соединений
- Антиоксидантное действие кверцетина при острой гипоксической гипоксии
- Влияние флавоноидов на морфологическую структуру органов и тканей и индекс деформируемости эритроцитов при острой гипоксической гипоксии
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время доказана ведущая роль интенсификации свободнорадикальных процессов (СРП) в патогенезе гипоксических состояний (Меньшикова и др., 2008). Одним из способов предотвращения окислительного стресса является активирование антиоксидантных систем, компоненты которых способны в малых концентрациях тормозить чрезмерное образование свободных радикалов (Владимиров и др., 1972; Меерсон, 1984).
Состояние системы свободнорадикального окисления (СРО) является универсальным неспецифическим критерием, по которому можно судить о степени развивающихся в организме патологических процессов, а также эффективности проводимой терапии. Свободнорадикальное окисление представляет собой процесс непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, кетонов, альдегидов, причем характерной чертой является его цепной самоиндуцирующийся характер (Mehta и др., 1998; Khodr и др., 2001; Рavlick и др., 2002).
Как известно, избыточное накопление активных форм кислорода (АФК) контролируется деятельностью антиоксидантных ферментов (Felton и др., 1995; Wang и др., 2001; Barbehenn и др., 2002). К этим ферментам относятся супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза и церулоплазмин. Ферменты–антиоксиданты обеспечивают прямое обезвреживание кислорода, сводят к минимуму концентрацию перекиси водорода, супероксидного радикала и резко уменьшают образование токсичного радикала ОН (Владимиров и др., 1972; Соколовский и др., 1988), составляют важное звено антиоксидантной системы (АОС). Коррекция патологических изменений, развивающихся в результате активации СРП, требует поиска эффективных природных и синтетических антиоксидантов.
В последнее время большой интерес вызывают антиоксиданты кверцетин (КВ) и дигидрокверцетин (ДГК, таксифолин). Это природные флавоноиды, выделенные из древесины лиственницы. Более широким спектром биологической активности обладает ДГК. Он способствует уменьшению проницаемости и ломкости капилляров, снимает спазм гладкой мускулатуры, обладает выраженной антиоксидантной активностью (Тюкавкина и др., 1995; Тюкавкина и др, 1997). Однако, работ, посвященных защитному действию флавоноидов в условиях гипоксии, немного (Тюкавкина и др., 1995; Хачатурян и др., 1996; Шортанова и др., 1998). К тому же изучение морфологических изменений, возникающих в органах и тканях организма при острой гипоксии на фоне применения флавоноидов, до сих пор не проведено.
Поэтому изучение биохимических и морфологических показателей действия данных антиоксидантов при острой гипоксии и других патологических процессах, сопровождающихся гипоксией, в целях предупреждения активации СРП представляется актуальным.
Биологическую модель гипоксической формы гипоксии относят к категории хорошо управляемых состояний. Изменяя высоту подъема животного в барокамере или содержание кислорода во вдыхаемом воздухе, можно воспроизводить заданные гипоксические условия и вызывать кислородную недостаточность определенной тяжести.
Управляемые модели гипоксии позволяют получить динамическую характеристику нарастающего процесса, а также определить в развитии гипоксии периоды, существенные для понимания ее механизмов, что, в свою очередь, позволяет направленно выбирать сроки для углубленного исследования энергетического режима. В этих условиях можно выявить регуляторную направленность в изменении метаболической адаптации в общем комплексе гипоксических сдвигов. Управляемая модель позволяет выявить интеграцию между кислородным режимом системы и ее метаболическим ответом.
Остро наступающая дезоксигенация организма при снижении атмосферного давления в барокамере до 198 мм.рт.ст. (10 000 м над уровнем моря) детерминирует тяжелые сдвиги энергетического режима всех органов и этим исключает возможность мобилизации адаптационных механизмов. Кроме этого, по данным А.З. Колчинской (1991) на высоте 8000-9000 м над уровнем моря проявляются не только функциональные, но и структурные повреждения. Повреждающее действие гипоксии характеризуется лавинообразным накоплением недоокисленных продуктов с появлением высокотоксичных свободных радикалов, что, в свою очередь, приводит к дезорганизации дыхательной цепи и энергетическому дефициту в клетках.
В связи с вышесказанным, целью данного исследования явилось изучение особенностей действия кверцетина и дигидрокверцетина на свободнорадикальные процессы и морфологические показатели в разных тканях крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии.
В соответствии с целью были реализованы следующие задачи исследования:
-
Исследовать состояние свободнорадикальных процессов в мозге, сердце, печени и крови крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии;
-
Установить особенности реагирования различных тканей на гипоксическую гипоксию по морфологическим показателям;
-
Дать сравнительную характеристику эффектов двух антиоксидантов (кверцетина и дегидрокверцетина) на биохимические показатели в мозге, сердце, печени и крови крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии;
-
Сравнить действие кверцетина и дигидрокверцетина на морфологические показатели в мозге, сердце, печени и крови крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии.
Положения, выносимые на защиту.
-
При острой гипоксии наиболее значимое накопление продуктов свободнорадикального окисления происходит в сердце и мозге. Это сопровождается снижением активности антиоксидантных ферментов, а также развитием прицелюлярных и периваскулярных отеков в исследованных тканях. В просветах кровеносных сосудов наблюдается гемолиз эритроцитов. Гепатоциты подвергаются зернистой и гидропической дистрофии.
-
В условиях введения флавоноидов интактным крысам происходит значительное повышение индекса деформируемости эритроцитов, снижение содержания продуктов перекисного окисления липидов во всех исследованных тканях, а также возрастание функциональной активности антиоксидантных систем защиты относительно крыс контрольной группы. Наиболее выраженые изменения происходят в сердце животных, которым вводили дигидрокверцетин.
-
Предварительное введение флавоноидов перед гипоксической гипоксией снижает морфологические изменения в тканях, нормализует показатель деформируемости эритроцитов за счет снижения накопления продуктов свободнорадикального окисления и увеличения антиоксидантной системы защиты тканей.
Научная новизна результатов исследования.
Впервые показано, что флавоноиды, введенные интактным животным, оказывают прекондиционирующий эффект, снижая уровень продуктов переокисления липидов и увеличивая активность антиоксидантных ферментов преимущественно в тканях, которые наиболее чувствительны к действию гипоксии (сердце и мозге). Повышение активности глутатионпероксидазы в условиях введения флавоноидов интакнтным животным сопровождается возрастанием активности глутатионредуктазы, причем, при введении кверцетина эти изменения носят более выраженный характер в сердце, а в условиях применения дигидрокверцетина – в мозге животных.
Впервые показано, что предварительное введение дигидрокверцетина перед гипоксической гипоксией сопровождается возрастанием супероксидустраняющей и каталазной активности в исследованных тканях, что происходит на фоне повышения индекса деформируемости эритроцитов. При введении кверцетина перед острой гипоксией происходит менее значимое истощение антиоксидантного звена защиты и снижение индекса деформируемости эритроцитов относительно крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии без предварительного введения препарата. Большая антиоксидантная активность дигидрокверцетина по сравнению с кверцетином отражается и в его более выраженном протекторном эффекте на морфологическую структуру тканей крыс, подвергнутых гипоксии.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Получены результаты расширяют существующие представления об эффектах гипоксической гипоксии на биохимическом и морфологическом уровнях, а также особенностях действия антиоксидантов (кверцетина и дигидрокверцетина).
Даны научные рекомендации по применению антиоксидантов в клинике для предупреждения патологических процессов, возникающих при острой гипоксии. Предложенный метод определения индекса деформируемости эритроцитов может быть использован для прогностической оценки реологических свойств крови при острой гипоксии и на фоне использования антиоксидантов.
Внедрение результатов исследования в практику.
Материалы исследования легли в основу мероприятий, проводимых в клинике при Кабардино-Балкарском медицинском университете для профилактики окислительного стресса при острой гипоксии с помощью антиоксидантов.
Результаты исследования влияния антиоксидантов на течение свободнорадикальных процессов в разных тканях организма при гипоксической гипоксии используются в лекционных курсах по дисциплинам «Биоорганическая химия», «Биохимия», «Клиническая фармакология», «Патологическая физиология» на медицинском факультете.
Апробация результатов исследования.
Материалы диссертации были представлены и доложены на пленарной сессии Адыгской Международной Академии наук (Нальчик, 1998); 12 Международной конференции по нейрохимии (СПб, 1998); межвузовской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Нальчик, 2000); научной конференции г. Санкт-Петербурга (2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах ВАК РФ, личный вклад 52 %, 0,5 п.л.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 351 источников, из них 201 работа отечественных авторов и 150 работ зарубежных авторов. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 27 рисунков.
Роль свободнорадикальных процессов в организме при развитии гипоксического синдрома
Появление в атмосфере Земли свободного кислорода стало одним из важных и определяющих факторов эволюции живых организмов, которые в свою очередь в ходе развития отработали соответствующие биологические механизмы по лимитированному потреблению кислорода. Известно, что значительное повышение или понижение содержания кислорода в окружающей среде создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности организмов. Об этом свидетельствуют исследования, проведенные рядом авторов (Жиронкин А.Г., 1955, 1972; Гершенович З.С., 1950, 1960; Кричевская А.А. с соавт., 1960, 1980; Шортанова Т.Х., 1975; Хочачка П.; Сомеро Дж., 1988).
Кислород используется клетками главным образом в процессе дыхания. Полное восстановление молекулы кислорода до воды требует 4 электрона: во время переноса первого формируется супероксид-радикал, при переносе второго - перекись водорода, наиболее токсичный и реактивный гидроксил-радикал является результатом третьего переноса, а вследствие четвертого переноса образуется молекула воды. При гипоксии именно митохондриальная дыхательная цепь переноса электронов становится мощным источником активных форм кислорода - нестабильных и крайне реакционноспособных метаболитов (Владимиров Ю.А., 2000).
Активные формы кислорода инициируют реакции цепного перекисного. окисления липидов и оказывают прямое окислительное действие на нуклеиновые кислоты и белки (Фридович И., 1979; Барабой В.А. с соавт., 1992).
В условиях гипоксии снижение поступления в клетки молекулярного кислорода и повышение уровня восстановленности компонентов дыхательной цепи дают возможность кислороду взаимодействовать с промежуточными компонентами дыхательной цепи (убихином). Этот процесс протекает по пути одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода и приводит к образованию супероксид-аниона. Поэтому, несмотря на понижение парциального давления кислорода в тканях, возможно усиленное образование свободных радикалов (Ушкалова В.Н. с соавт., 1993; Бодыхов М.К. с соавт., 2004; Левченкова О.С. с соавт., 2004; Parks D.A. et al., 1983; Clark J.A.etal., 1985).
Исследования, проведенные в последнее десятилетие, показали, что свободные радикалы являются ключевыми элементами регуляции многих физиологических процессов на различных уровнях. Участие одних и тех же молекул в повреждении клеток и тканей, в их защите от внешней агрессии и в процессах внутри- и межклеточной регуляции позволяет считать, что образование АФК является характерным физиологическим процессом, результатом эволюционного отбора (Зенков Н.К. с соавт.,2001).
В настоящее время выделяют три категории свободных радикалов — первичные, вторичные и третичные (Владимиров Ю.А., 1998).
Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Обычно примерно 98% всего кислорода, поступающего в клетки, используется для окисления субстратов с образованием АТФ и выделением тепла, и лишь 2% используется в реакциях образования АФК, которое может значительно возрастать при усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы электронно-транспортной цепи митохондрий. Выделяют три категории АФК: первичные, вторичные и третичные. Первичные АФК образуются при окислении некоторых, молекул и обладают регуляторным или умеренным антимикробным действием. К ним относят оксид азота NO, и супероксиданион радикал, который при помощи супероксиддисмутазы превращается в перекись водорода, а затем — в гипохлорит. При недостаточной нейтрализации супероксида его избыток, взаимодействуя с N0, образует пероксинитрит или переводит трехвалентное железо Fe3+ в двухвалентное Fe2+, которое при взаимодействии с Н2О2, НСЮ" и липоперекисями образует гидроксильный радикал ОН или липоксильный радикал LO Эти радикалы, как и пероксинитрит, представляют категорию вторичных радикалов, обладающих сильным токсическим действием вследствие своей способности необратимо повреждать мембранные липиды, а также молекулы ДНК, углеводов и белков. При соединении вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других легко окисляющихся соединений образуются третичные радикалы.
Первичные радикалы образуются в результате последовательного одно-электронного восстановления молекулы кислорода. К ним относятся, прежде всего, супероксидный анион-радикал, перекись водорода, а также оксид азота.
Супероксидный анион-радикал (02") образуется в результате присоединения одного электрона к молекуле кислорода. Как анион On имеет заряд и плохо мигрирует через мембраны. Обладая способностью и отдавать, и принимать электроны, Ог" может выступать и как восстановитель, и как окислитель. Среди его мишеней небольшие органические молекулы -катехолами-ны, низкомолекулярные тиолы, аскорбат, тетрагидроптерины. В кислой среде он способен образовывать гидропероксильный радикал — Н202, являющийся гораздо более активным окислителем, чем супероксидный анион-радикал (Packer L., 1995; KaganV.E. et al., 1998).
Перекись водорода. В норме 02 под действием супероксиддисмутазы (СОД) превращается в Н2О2, которая используется, в частности для синтеза гипохлорита или разлагается нерадикальным путем под действием других защитных ферментов - пероксидаз, наибольшей-активностью среди которых обладают каталаза и глутатионпероксидаза.
Оксид азота. Оксид азота (NO) - высоколабильный, реактивный свободный радикал, который, как показано в последнее десятилетие, способен влиять на целый ряд физиологических и патологических процессов в организме животных и человека. Биологическая роль NO в большой степени определяется малой величиной молекулы, ее высокой реактивностью и способностью к диффузии в тканях (Moncada S. et al., 1991). Образование NO в организме человека и животных происходит при ферментативном окислении L-аргинина и обнаружено во многих клетках и тканях. Синтез N0 осуществляется семейством уникальных цитохром-Р-450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз. Для работы NO-синтаз необходим кислород, поскольку он служит источником 02", включающегося в гуанидиновую группу L-аргинина. В результате этой реакции происходит 5-электронное окисление L-аргинина с образованием L-цитруллина и NO (Marin J., Rodriguez-Martinez A., 1997). Синтез NO с участием различных NO-синтаз является доминирующим, но не единственным путем его генерации in vivo. Так, описаны катализируемое ксантиноксидазой восстановление нитрита в N0 в условиях тканевого ацидоза (Zweier J.L. et al., 1995) и при гипоксии (Zhang Z. et al., 1998), а также зарегистрирована реакция между аргинином и Н2Ог с образованием NO (Nagase S. et al., 1997).
Диапазон проявлений биологический активности NO огромен (Реутов В.П., 1995). Было показано, что этот радикал участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов как эндогенный вазодилататор и антагонист адренергической нервной системы (Волин М.С. с соавт., 1998), а также тормозит агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стенках сосудов (Струкова СМ. с соавт., 1999). NO проявляет и цитотоксическую активность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета (Маеда X., Акаике Т., 1998).
Повреждающее действие NO во многом опосредуется его способностью реагировать с 0{ с образованием чрезвычайно реакционного пероксинитрита. Пероксинитрит в свою очередь повреждает любые белковые молекулы, в том числе и ферменты антиоксидантной защиты. Так, обнаружено, что пероксинитрит может повреждать митохондриальную Мп-СОД (Mack А., 1996) и глутатионпероксидазу (Padmaja S. et al., 1998), что еще более увеличивает уровень 0{ и в дальнейшем - пероксинитрита.
Вторичные свободные радикалы образуются из Н202, липоперекисей и гипохлорита в присутствии ионов Fe(II). К ним относят гидроксильный радикал и липидные радикалы, участвующие в реакциях окисления ненасыщенных жирно-кислотных цепей липидов биологических мембран и липопротеинов плазмы крови (Владимиров Ю.А., 1998).
Гидроксильный радикал. Дальнейшее одноэлектронное восстановление перекиси водорода, происходящее в присутствии свободных ионов Fe и Си (реакция Фентона), приводит к образованию ОН, который является весьма сильным окислителем, способным атаковать нуклеиновые кислоты, белки и фосфолипиды.
Характеристика флавоноидных соединений
Положение о том, что ведущая роль в механизме развития гипоксических нарушений отводится активации СРП и образованию мембраноповреждающих свободных радикалов, нашло подтверждение в работах, показавших эффективное применение антиоксидантов с целью фармакологической коррекции гипоксии (Меерсон Ф.З., 1979; Сутковой Д.А. с соавт., 1985; ТимушеваЮ.Т. с соавт., 1998; Thomas G., 2003).
Кроме того, гипоксия сопровождается ослаблением естественной защиты тканей от свободнорадикальной атаки. Так, многочисленные экспериментальные и клинические наблюдения свидетельствуют о снижении активности основных ферментативных антиоксидантов (Коган А.Х. с соавт., 1992; Хмелевский Ю.В. с соавт., 1992; Ланкин В.З., 1981, 2000; Richard VJ. et al., 1990; Prasad К. et al., 1992;).
Среди антиоксидантов, т.е. веществ, способных тормозить свободнорадикальные процессы, большой интерес представляют флавоноидные соединения (Клышев Л.К. с соавт., 1978; Бриттон Г., 1986; Хорман И., 2003; Harborne J.B., 1967).
Флавоноидные соединения - постоянные и широко распространенные компоненты рациона питания человека, поступающие в организм преимущественно с растительной пищей, особенно с ягодами и плодами. Флавоноидные соединения содержатся также в овощах, зерновых, бобовых и злаковых культурах (Скорикова Ю.Г., 1973; Барабой В.А., 1984).
Из растений было выделено и охарактеризовано более 4000 флавоноидных соединений, их количество может быть значительно больше, так как многие виды растений не изучались на предмет их содержания. В растениях флавоноиды служат для защиты от грибковых паразитов, гербицидов и окислительных повреждений. Кроме того, флавоноиды способствуют опылению, придают розовый, красный, лиловый, фиолетовый, голубой цвет фруктам, овощам и цветам. Структурной основой всех флавоноидов является флавоновое ядро — 1, 3 - дифенилпропановый скелет Сб-Сз-Сб В зависимости от структуры ядра выделяют собственно флавонолы, флавоны, флавононы, катехины, антоцианидины, изофлавоны, дигидрофлавонолы, халконы. В каждую из этих групп входят соединения, содержащие разное число ОН-групп (рис. 1).
Флавоноидные соединения обладают широким спектром фармакологической активности (Барабой В.А., 1976; Тюкавкина Н.А., 1996; Чернов Ю.Н., 2004; Федоров B.C. с соавт., 2005).
Одно из наиболее общих и основных свойств всех флавоноидов — способность оказывать антиоксидантное действие (Рогинский В.А., 1988; Rice-Evans С.А. et al., 1996).
Первые сведения о способности флавоноидов препятствовать интенсификации свободнорадикального окисления появились в 30-40 годах XX века, а в 50-70 годах исследование антиокислительной активности (АОА) флавоноидов вырастает в крупное научное направление (Захарова Н.А. с соавт., 1972; Kurth E.F. et al., 1951). Интерес к этой проблеме не снижается и в настоящее время (Клебанов Г.И. с соавт., 1995; Руленко И.А. с соавт., 1995; Тюкавкина Н.А. с соавт., 1995, 2005; Кравченко Л.В. с соавт., 2003).
Важнейшие закономерности во взаимосвязи антиокислительной активности (АОА) со строением флавоноидных соединений (ФС) могут быть обобщены в виде следующих положений:
1. ФС флаваноновой природы проявляют сравнимую или более высокую АОА, чем их флавоновые аналоги. Так, фустин, эриодиктиол и дигидрокверцетин (ДГК) по АОА в 1,5-2 раза превосходят физетин, лютеолин и кверцетин (KB). Антирадикальная эффективность ДГК в 2,5 раза выше по сравнению с КВ.
2. Агликоны, как правило, активнее, чем их гликозиды. Кверцетин по АОА приблизительно в 2,5-3 раза превосходит свои гликозиды - рутин, кверцетин-3-гликозид и др.
3. С увеличением числа ОН-групп в кольце «В» при условии наличия пирокатехиновои и пирогаллольнои группировок происходит возрастание АОА. Так, АОА дигидрокемпферола, имеющего одну 4 -ОН группу, в 75 раз ниже таковой у ДГК, имеющего 3 ,4 - дигидроксигруппировку (Захарова Н.А. с соавт., 1972; Hudson В J.F., 1990).
4. Существенный вклад в АОА вносит фрагмент, включающий свободные гидроксильные группы в положениях 3 и 5 в сочетании с карбонильной группой в положении 4, которому приписывается способность к хелатированию ионов металлов. Так, ДГК по величине антиоксидантного индекса в 2,6 раза превосходит D-катехин, отличающийся от ДГК отсутствием карбонильной группы.
Проблема установления механизма антиоксидантного действия флавоноидных соединений чрезвычайно сложна. Отдельные аспекты этой проблемы отражены в ряде обзоров (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Бурлакова Е.Б. с соавт., 1985).
Флавоноиды способны, как непосредственно захватывать свободные радикалы, так и участвовать в восстановлении других антиоксидантов. Непосредственное антиоксидантное действие флавоноидов реализуется за счет наличия в их структуре слабых фенольных гидроксильных групп легко отдающих свой атом водорода при взаимодействии со свободными радикалами. Сами они превращаются в малоактивные феноксильные радикалы. В многочисленных работах показано, что флавоноиды активны в отношении различных активных форм кислорода: перекисей липидов, пероксидлипидов, гидроксил-радикалов, радикалов окиси азота, синглетного кислорода и супероксиданион-радикала (Haenen G. et al., 1997; Cos P. et al., 1998).
Флавоноиды ингибируют процессы ПОЛ как на стадии инициации, взаимодействуя с радикалами О"2 и ОН", так и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для перекисных радикалов (Torel J. et al., 1986). Образующиеся при этом радикалы флавоноидов активно вступают в реакции диспропорционирования с другими радикалами. Некоторые флавоноиды могут действовать как хелаторы ионов металлов переменной валентности и, тем самым, ингибировать процессы ПОЛ на стадии разветвления цепей, когда ионы металлов индуцируют разложение органических перекисей. Таюке отмечена их способность снижать активность индуцированной NO-синтетазы (кверцетин и силибинин), ингибировать ксантиноксидазу (кверцетин, силибинин и лютеонин), образовывать комплексы с убихиноном Qi0 и молекулами фосфолипидов (Насибуллин Р.С. с соавт., 2002; Дадали Ю.В. с соавт., 2004; Чернов Ю.Н. с соавт., 2004).
Антиоксидантные свойства флавоноидов вносят большой вклад в проявление их антигипоксической активности, так как в условиях недостатка кислорода в клетках резко ускоряется генерация активных форм кислорода, усугубляющих повреждение митохондриальных мембран. Препятствуя образованию и повреждающему действию активных форм кислорода, флавоноиды уменьшают рассеивание энергии на уровне I комплекса дыхательной цепи и тем самым увеличивают эффективность сопряжения тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования. Кроме того, некоторые флавоноиды (в частности, леспефлан) при гипоксии способны осуществлять присущую коэнзиму Qio в физиологических условиях функцию переносчика восстановительных эквивалентов между комплексами I, II и комплексом III дыхательной цепи — челночную роль, утрачиваемую в условиях гипоксии из-за возникновения термодинамического блока в области комплекса III и частичной утечки убихинона из поврежденных при гипоксии митохондриальных мембран (Лукьянова Л.Д. с соавт., 1992; Александрова А.Е., 2005).
Одновременно выраженные антигипоксические и антиоксидантные свойства обусловили широкий спектр фармакологической активности флавоноидов, связанной с коррекцией энергозависимых процессов: флавоноидные соединения проявляют противовоспалительное, гепатопротекторное, антимикробное, антивирусное, капилляропротекторное, радиозащитное, антиканцерогенное, иммунотропное действие (Ильюченок Т.Ю. с соавт., 1975; Барабой В.А., 1984; Pignol В. et al., 1988; Cholbi M.R. et al., 1991).
Подавляющее большинство флавоноидов способны образовывать комплексы с ионами металлов, а также с молекулами белков и полисахаридов, что является одним из механизмов неспецифического антитоксического действия (Жоробекова Ш.Ж., 1987).
Антиоксидантное действие кверцетина при острой гипоксической гипоксии
В настоящее время установлено, что флавоноиды обладают протективными свойствами при различных патологических состояниях благодаря тому, что обладают антиоксидантной активностью. В данном разделе представлены результаты исследования эффектов кверцетина на свободнорадикальные процессы в тканях крыс. В том числе, было установлено, что в ответ на введение кверцетина в тканях крыс происходило понижение уровня ДК и ТБК-реактивных продуктов по сравнению с контролем (рис. 5).
Интересно, что в крови и печени изменения уровней ДК и ТБК-РП были равнозначны: снижение содержания ДК составило 14% (р 0,05), а ТБК-РП - 17% (р 0,05). Одновременно, изменение уровня ШО в печени и крови составило, соответственно, -18% (р 0,05) и -12% (р 0,05). В миокарде также уменьшились уровни ДК (-19%; р 0,05), ШО (-21%; р 0,05) и ТБК-РП (-14%; р 0,05). Наиболее выраженные изменения обнаружены в мозговой ткани: снижение содержания ДК составило 27% (р 0,05), ШО - 30% (р 0,05) и ТБК-РП - 22% (р 0,05) относительно контроля.
Понижение накопления продуктов ПОЛ в тканях животных при введении кверцетина происходило на фоне возрастания активности антиоксидантных ферментов (рис. 6).
В том числе, обнаружено повышение активности СОД в мозге на 25% (р 0,05), печени на 18% (р 0,05), миокарде на 26% (р 0,05) и гемолизате крови на 15% (р 0,05) по сравнению с контролем.
Активность каталазы достоверно увеличивалась только в миокарде (+18%; р 0,05), хотя и в других тканях выявлено некоторое ее повышение: в мозге на +11%, печени на +17% и гемолизате крови на +18% по сравнению с контрольными значениями.
Введение кверцетина также приводило к достоверному повышению СПА во всех исследуемых тканях: в мозге на 17% (р 0,05), в печени на 17% (р 0,05), в миокарде на 32% (р 0,05) и плазме крови на 16% (р 0,05) по сравнению с контрольным уровнем.
При изучении изменения активности ГПО в тканях при введении KB были получены сходные результаты. Активность глутатионпероксидазы повысилась в мозге на 16% (р 0,05), в печени на 18% (р 0,05), в миокарде на 34% (р 0,05) и гемолизате крови на 16% (р 0,05) относительно контрольных значений.
Можно также предположить и то, что при введении кверцетина содержание глутатиона также увеличивалось в исследованных тканях, поскольку как активность глутатионредуктазы, так и содержание SH-содержащих соединений увеличивалось у животных 3-й группы по сравнению с контролем. Активность ГР повысилась в мозге на 16% (р 0,05), печени на 22% (р 0,05), миокарде на 28% (р 0,05) и гемолизате крови на 16% (р 0,05). Одновременно происходило накопление SH-групп в мозге (+14%; р 0,05), печени (+16%; р 0,05), миокарде (+18%; р 0,05) и плазме крови (+12%; р 0,05) относительно крыс 1-й группы.
Обсуждая результаты исследования эффектов кверцетина можно предположить, что, по-видимому, его действие определяется способностью нейтрализовывать свободные радикалы, разрушать перекисные соединения, а также проявлять хелатные свойства, связывая железо. Это подтверждается и данными литературы (Костюк В.А. с соавт., 1988, Kitura С. et al., 1981).
Кроме того, имеются данные, указывающие на способность кверцетина образовывая комплексы с убихином Q10, тем самым способствует более эффективной работе последнего, а взаимодействуя с молекулами фосфолипидов, в частности лецитином, кверцетин препятствует взаимодействию чужеродных субстанций (например, аллергенов) с клеточными мембранами (Насибулин Р.С. с соавт. 2002; Дадали Ю.В. с соавт. 2004).
Далее было проведено исследование влияния предварительного введения кверцетина перед острой гипоксическои гипоксией (4 группа животных) на свободнорадикальные процессы в разных тканях (рис. 7, 8).
Установлено, что введение антиоксиданта перед гипоксическои гипоксией сопровождалось снижением содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ, а также возрастанием активности антиоксидантных ферментов во всех исследованных тканях относительно второй группы животных.
При сравнении с контрольной группой крыс было обнаружено, что у крыс 4-й группы происходило накопление ДК в мозге на 21% (р 0,05)? печени на 22% (р 0,05), сердце на 15% (р 0,05) и плазме крови на 14% (р 0,05). Изменилось и содержание ШО в мозге (+18%; р 0,05), миокарде (+20%; р 0,05), печени (+18%; р 0,05) и плазме крови (+16%; р 0,05). Повышение уровня ТБК-реактивных продуктов составило в мозге +28% (р 0,05), печени +23% (р 0,05), сердце +59% (р 0,05), а в плазме крови +17% (Р 0,05).
Таким образом, в условиях введения кверцетина перед гипоксическои гипоксией также отмечалось накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ, однако, эти изменения не носили столь выраженный характер, как у животных второй группы.
Относительно 2-й группы животных предварительное введение KB перед гипоксическои гипоксией способствовало понижению уровня ДК в миокарде (-18%; р 0,05) и плазме крови (-12%; р 0,05), а также ТБК-реактивных продуктов в миокарде (-19%; р 0,05) и плазме крови (-11%; р 0,05). В тканях мозга и печени также отмечали некоторое понижение уровня продуктов ПОЛ, но эти изменения были недостоверны.
Причиной не столь значимого накопления ДК и ТБК-РП у животных 4-й группы являлось менее выраженное понижения активности ферментов относительно контрольной группы животных.
В том числе, понижение активности СОД у крыс 3-й группы обнаружено только в миокарде (-20%; р 0,05) по сравнению с контролем. Во всех остальных тканях эти изменения носили тенденцию к достоверности (0,05 р 0,05). Оксидазная активность церулоплазмина также была незначительно ниже (-13%; 0,05 р 0,1) относительно 1-й группы крыс.
Тогда как по отношению ко 2-ой группе у животных, подвергнутых предварительному введению кверцетина перед гипоксической гипоксией, активность СОД возрастала в мозге на 29% (р 0,05), в печени на 35% (р 0,05), и в миокарде на 24% (р 0,05), в гемолизатате крови на 12% (0,05 р 0,1). Одновременно, по сравнению со 2-ой группой происходило повышение оксидазной активности церулоплазмина в плазме крови (+ 11%; р 0,05).
В исследуемых тканях 4-й группы животных каталазная активность была значительно ниже контрольного уровня. Наиболее значимое понижение активности каталазы выявлено в мозге (-39%; р 0,05) и миокарде (-35%; р 0,05). В печени и гемолизате крови снижение активности фермента составило, соответственно, 21% (р 0,05) и 16% (р 0,05) (рис. 8).
При этом по сравнению со второй группой животных у крыс, находящихся в условиях предварительного введения кверцетина перед гипоксической гипоксией, достоверное возрастание активности каталазы отмечалось лишь в миокарде (+17%; р 0,05). Можно предположить, что кверцетин не играет значимой роли в регуляции активности данного фермента.
Суммарная пероксидазная активность также оставалась ниже контрольного уровня во всех тканях. В том числе, понижение СПА в мозге, сердце, печени и плазме крови составило, соответственно, 26% (р 0,05), 24% (р 0,05), 16% (р 0,05) и 24% (р 0,05).
В то же время, необходимо отметить тот факт, что по сравнению со 2-й группой крыс суммарная пероксидазная активность значительно возросла в миокарде (+24%; р 0,05) и плазме крови (+13%; р 0,05). В мозге и печени достоверных изменений СПА не обнаружено.
При этом активность глутатионпероксидазы в тканях крыс 4-й группы была ниже контроля: в мозге на 18% (р 0,05), миокарде на 26% (р 0,05), в печени на 18% (р 0,05) и гемолизате крови на 22% (р 0,05). Однако, при сравнении с результатами исследования активности ГПО крыс 2-й группы у животных, подвергнутых предварительному введению кверцетина перед гипоксической гипоксией, наблюдали выраженное повышение активности данного фермента в мозге (+14%; р 0,05), миокарде (+18%; р 0,05) и, особенно, печени (+25%; р 0,05). В то же время, в гемолизате крови крыс 4-й группы активность ГПО соответствовала уровню животных 2-й группы.
Влияние флавоноидов на морфологическую структуру органов и тканей и индекс деформируемости эритроцитов при острой гипоксической гипоксии
Известно, что ряд физиологических и биохимических показателей отражает общий «итог реакций» многих клеток и не дает представлений о сложности клеточных превращений. В связи с этим, морфологическая оценка клеточных изменений приобретает важное значение в том смысле, что позволяет разграничить патологические и приспособительные реакции, протекающие одновременно.
Для выявления структурных изменений в тканях мозга, печени, миокарда и крови при острой гипоксии и после предварительного введения ДГК были проведены морфологические исследования, а также определена степень деформируемости эритроцитов.
В результате проведенного исследования установлено, что действие острой гипоксии способствовало развитию в головном мозге экспериментальных животных приваскулярного и перицеллюлярного отека. В том числе, на рисунках 13-14 представлены результаты морфологического исследования влияния гипоксической гипоксии, свидетельствующие о том, что в данных условиях мягкая мозговая оболочка становится фрагментированной, разволокненной, отечной. При этом наблюдаются периваскулярно обширные кровоизлияния состоящие из гемолизированных эритроцитов. Одновременно, в нейроцитах и клетках глии отмечается зернистая дистрофия.
В условиях же предварительного введения флавоноидов и, особенно, дигидрокверцетина перед острой гипоксией признаки периваскулярного и перицеллюлярного отеков в мозге менее выражены. При этом наблюдали, что эритроциты в данных условиях были округлой формы, дистрофические изменения в них менее выражены; структура нейроцитов четкая, относительно гиперхромные. Мозговая оболочка также более четкая (рис. 15-16).
В миокарде в условиях острой гипоксии отмечается значительный интерстициальный отек. В просветах интрамуральных сосудов наблюдается гемолиз эритроцитов. Значительная часть кардиомиоцитов некротизирована (рис. 17), зерна гликогена не обнаружены (рис. 18).
Применение флавоноидов и, в первую очередь, дигидрокверцетина в условиях острой гипоксии обеспечивает более высокую сохранность эритроцитов, подавляет их гемолиз. Некротические изменения встречаются в миокарде значительно реже по сравнению со 2-й группы животных.
При острой гипоксии в печени отмечается гемолиз эритроцитов. Печеночные балки не имеют четких границ, а образуют как бы сплошное розовое поле. При этом пространства Диссе, синусоидные капилляры не определяются из-за резкого набухания гепатоцитов, зернистой и гидропической дистрофии, также определяется дискомплексация печеночных балок. Особое внимание обращают на себя обширные кровоизлияния в ткани печени, преимущественно состоящие из гемолизированных эритроцитов с некрозом самих гепатоцитов (рис. 21). Гранулы гликогена не выявлены (рис. 22).
В условиях введения флавоноидов эти изменения в печени снижены. Однако, необходимо указать на то, что при применении дигидрокверцетина сохранение ткани печени более выражено. Об этом свидетельствуют определенные морфологические признаки: в условиях введения дигидрокверцетина эритроциты имеют округлую форму, а печеночные балки и пространства Диссе - более четкие очертания. Менее выражены некрозы гепатоцитов, кровоизлияния в печени животных, которым вводили ДГК, относительно крыс, которым перед острой гипоксией вводили кверцетин. Гранулы гликогена также в большей степени сохранены у крыс 6-й группы относительно животных 4-й группы (рис. 23-24).
Кроме того, поскольку функционально эритроциты обеспечивают тканевое дыхание, поэтому сохранившие свою форму эритроциты в условиях введения флавоноидов перед гипоксической гипоксией способны более эффективно выполнять свои физиологические функции. В этих условиях меньше развивается тканевая гипоксия, которая и является основополагающей причиной гибели клеток различных тканей.
Обсуждая данные морфологических исследований следует подчеркнуть, что ключевым моментом в развитии и поддержании гипоксических повреждении тканей является повреждение мембраны митохондрий, лизосом и клеток. Оно в значительной степени обусловлено переокислением ненасыщенных жирных клеток их липидных компонентов (Владимиров Ю.А. с соавт., 1972).
Как было ранее показано, равновесие между окислением жирных кислот и их восстановлением определяется соотношением образования активных форм кислорода и функциональным состоянием антиоксидантных систем, включающих супероксиддисмутазу, пероксидазу, каталазу и биоантиокислители - доноры сульфгидрильных групп, токоферолы, катехины, аскорбиновую кислоту и др. При гипоксии имеет место резкое снижение антиоксидантной активности тканей и сдвиг равновесии в сторону окисления липидов. Кроме того, перекисное окисление липидом может протекать при не ничтожной концентрации О2 (10"6 м) и при тяжелой гипоксии может составить прямую конкуренцию использованию 02 в энергозависимых процессах (Васильев В.Ф. с соавт., 1962).
Флавоноиды, обладая способностью тормозить перекисное окисление липидов, входящих в состав мембран клеток и органелл обеспечивают тем самым стабилизацию мембран, что считают ведущим механизмом защиты организма антиоксидантами от различных повреждающих воздействий. В том числе от гипоксии.
Приведенные морфологические данные позитивного действия флавоноидов в условиях острой гипоксии подтверждаются результатами исследования степени деформируемости эритроцитов (ИДЭ) (табл. 1, рис. 25).
В условиях острой гипоксии происходило снижение деформируемости эритроцитов, что проявилось в уменьшении ИДЭ на 43% (р 0,001) по сравнению с контролем.
Введение кверцетина не приводило к значимым изменениям индекса, а применение дигидрокверцетина способствовало повышению ИДЭ на 10% (Р 0,05).
В условиях введения кверцетина перед гипоксическим воздействием индекс деформируемости эритроцитов оставался ниже контрольного уровня на 31% (р 0,01), но относительно 2-й группы животных увеличился на 20% (р 0,05), что свидетельствует о положительном влиянии кверцетина на структуру мембран эритроцитов при гипоксической гипоксии.
На фоне предварительного введения ДГК перед гипоксической гипоксией отмечены позитивные изменения в структурно-функциональном состоянии клеточных мембран эритроцитов: индекс деформируемости эритроцитов увеличился на 32% (р 0,01) по сравнению со второй группой животных, хотя относительно контрольного уровня оставался ниже на 25% (Р О,01).
