Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Характеристика энергетического метаболизма мозга при нарушении кислородного режима 18
1.1 Митохондриальная система - основной путь организации энергоаккумулирующего процесса в ткани мозга 18
1.2 Формирование адаптивного состояния организма под влиянием гипоксического прекондиционирования 27
Глава 2 Моделирование биологических явлений и роль математических методов в прогнозировании состояния биологических систем 31
2.1 Моделирование - один из методов научного познания 31
2.2. Математическое моделирование в биологии 33
2.3 Функциональная зависимость - средство математического моделирования 37
Глава 3 Материалы и методы исследования 40
3.1 Постановка эксперимента 40
3.2 Методы исследования
3.2.1 Выделение митохондриальной фракции головного мозга 43
3.2.2 Определение активности окислительно-восстановительных ферментов митохондриальной дыхательной цепи 44
3.2.3 Определение активности креатинкиназы в общей митохондриальной фракции 45
3.2.4 Определение концентрации адеиновых нуклеотидов 45
3.2.5 Определение фосфорилирующей активности митохондрий мозга полярографическим методом 46
3.2.6 Методы статистической обработки экспериментальных результатов 47
3.3 Выбор математических методов для исследования зависимости
между экспериментальными данными
3.3.1. Классы задач, используемые для изучения зависимости
между количественными показателями, характеризующими работу системы 49
3.3.2 Подбор кривой 51
3.3.3 Расчет параметров аппроксимирующих функций 54
3.3.4 Оценка значимости регрессионной модели 62
Глава 4 Результаты исследования 65
4.1 Прогнозирование энергетической активности мозга животных в
условиях гипоксии методами математического моделирования 65
4.1.1 Оценка и прогнозирование функционального состояния ферментных комплексов дыхательной цепи в условиях нарушения кислородного режима 65
4.1.2 Содержание аденозинтрифосфата в зависимости от активности окислитено-восстановительных ферментов ДЦ при недостатке кислорода 84
4.1.3 Активность митохондриальной креатинкиназы и концентрация АТФ в ткани мозга при ишемии разной продолжительности 95
4.1.4. Зависимость концентрации АТФ в ткани мозга от скорости фосфорилирования ADP под влиянием гипоксического воздействия ПО
4.1.5 Резюме по разделу 4.1 126
4.2 Прогнозирование пределов устойчивости организма к гипоксии по уровню адениновых нуклеотидов методами математического моделирования 132
4.2.1 Исходные характеристики содержания АТФ, АМФ и их отношений (АТР/АМР) в условиях острого кислородного голодания 132
4.2.2 Прогнозирование эффективных режимов гипоксического прекондиционирования по концентрации адениновых нуклеотидов 150
4.2.3 Резюме по разделу 4.2 164
Заключение 167
Список литературы
- Формирование адаптивного состояния организма под влиянием гипоксического прекондиционирования
- Математическое моделирование в биологии
- Определение активности креатинкиназы в общей митохондриальной фракции
- Зависимость концентрации АТФ в ткани мозга от скорости фосфорилирования ADP под влиянием гипоксического воздействия
Формирование адаптивного состояния организма под влиянием гипоксического прекондиционирования
Субкомпенсаторная стадия биоэнергетической гипоксии характеризуется стационарными значениями суммы аденилатов и значений энергетического заряда.
Она, связана с усилением гидролиза АТФ при сохранении в качестве регулятора синтеза энергии отношения АТФ/АДР.
Автор указывал, что концентрация 900-1 ООмкМоль СЬ была областью равновесности АТФ — синтезирующими и АТФ — утилизирующими реакциями в этом случае. Эта область характеризуется высокими стабильными значениями отношенийіАТФ/АДР и АТФ/АМФ.
Субкоменсаторная стадия биоэнергетической гипоксии также характеризуется стационарными значениями суммы аденилатов и значений энергетического заряда. Это связано с усилением регулирующего влияния отношения АТФ/АМФ. Показано, что 100-10 мкМоль 02 - область появления первых признаков ослабления энергетической регуляции, нарастающих по мере снижения концентрации СЬ
Стадия декомпенсации энергетического обмена по мнению А.М.Дудченко наступает при концентрации кислорода 10-2 мкМоль, что является областью дисбаланса в пуле адениновых нуклеотидов. Это выражается в резком падении внутриклеточного содержания АТФ (при 2 мкМолях Ог - на 70-80% от исходного) и АДР, уменьшении значений АН и ЭЗ и в де-компенсируемом гипернакоплении АМФ, что свидетельствует о низкоэнергетическом сдвиге.
Итак, согласно современным исследованиям энергетического обмена параметры аденилатного пула являются предикторами как ранних, так и поздних нарушений энергетического обмена при гипоксии.
При их комплексном анализе и при анализе их отношений, возможно выявление различных стадий и регуляторных механизмов процесса энерги-зации.
Одним из главных механизмов регуляции энергетического обмена в клетке является контроль скорости митохондриального дыхания за счет аде-ниновых нуклеотидов. Изменения соотношения концентраций АТФ и ADP регулирует скорость дыхания и сопряженного с ним фосфорилирования (Kuster U., 1981; Shoenfeld Р., 1984), поэтому комплексное исследование энергетического обмена мозга предусматривает оценку функциональной активности митохондрий мозга и содержания адениновых нуклеотидов. Концентрация! АТФ- в ткани мозга" зависит от соотношения скорости процесса синтеза, и распада данного нуклеотида; а в условиях гипоксии существенно меняетсяскорость обоих процессов. В связи с этим возникает необходимость разработать комплексные методы исследования, позволяющие прогнозировать изменения конечной концентрации АТФ в ткани мозга в зависимости от функциональных показателей митохондриального дыхания в условиях гипоксии. Зная концентрацию одного нуклеотида, определить содержание другого и спрогнозировать степень тяжести гипоксического воздействия, ведущего к патологическим изменениям жизнедеятельности организма.
Основой функциональной и структурной полноценности любой клетки и органа является сохранность систем синтеза богатых энергией соединений, систем их переноса к месту потреблениям и систем, обеспечивающих потребление энергий (Дудченко, 1996; Зарубина, 1999; Федорова, 2004). Огромное значение для- жизнедеятельности клетки имеет креатинкиназная система (Wallimann, 1992; Kay, 2000; Липская, 2001; Dzeja, 2003; Strejger, 2005).
За счет осуществления креатинкиназной реакции в клетке жестко поддерживается постоянный уровень АТФ (Brdiczhka, 1998). Креатинкиназа ре-фосфорилирует АТФ из АДР и КФ со скоростью в 15-20 раз превышающей скорость синтеза АТФ в процессе окислительного фосфорилирования и почти в 100 раз - синтез АТФ de novo (Saks, 1996; Vendelin, 2002; Askenasy, 2002).
Помимо поддержки постоянного уровня АТФ креатинкиназа в клетке выполняет функцию сенсора, определяющего и регулирующего количество
АДР на микромолярном уровне (Kanemitsu, 2000; Abraham, 2002; Askenasy, 2002; Dos Santons, 2004).
Таким образом, креатинкиназная система является мощной системой стабилизации уровня макроэргических соединений аденилового пула и играет важную роль в поддержании жизнедеятельности организма в экстремальных условиях.
Из приведенных материалов, вытекает, что биоэнергетический механизм лежит в основе разных форм гипоксии и соответствует почти любой патологии. Нарушение электротранспортной и сопрягающей функции митохондрий при гипоксии, приводящее к снижению внутриклеточного пула макроэргов и, в силу, этого к подавлению широкого спектра энергозависимых функционально-метаболических систем, приобретает особое значение.
Несмотря на то, что функциональные последствия нарушений в мозге, связанных с дефицитом кислорода, достаточно хорошо изучены, многие биоэнергетические аспекты этого явления продолжают требовать своего решения.
Так, например, не существует четких и объективных критериев, позволяющих дифференцировать степень тяжести кислородного голодания, прогнозировать изменение энергетического потенциала мозга при дисфункции МФК ДЦ, проводить оценку направленности обменных процессов под влиянием гипоксических воздействий, прогнозировать энергетическое состояние мозга по характеристике креатинкиназной системы в экстремальных условиях организма.
Математическое моделирование в биологии
Сложность явлений жизни отражается в переплетении различных уровней организации живых объектов, что приводит к определенной специфичности при моделировании биологических явлений. В биологии, как и в других отраслях естествознания, в основе моделирования лежит представление о замещении какой-либо сложной системы более простой и доступной для изучения.
В биологии все шире используются математические модели, базирующиеся на достижениях математики и кибернетики. При этом возникают новые направления научных исследований, такие как синергетика (Хакен, 1985), биологическая кинетика (Рубин, Пытьева, Ризниченко, 1987), матема тическая популяционная генетика (Свирежев, Пасеков, 1982), компьютерная биометрия (Барбашева и др., 1990) и др.
Разнообразие биологических объектов и явлений привело к тому, что для их количественного описания с самого начала привлекались различные математические дисциплины (Моровиц, 1968).
При этом в зависимости от характерами свойств изучаемых процессов для моделирования выбирается аппарат либо дискретной, либо непрерывной математики. Методы дискретной математики оказались наиболее удобным и естественным средством для моделирования свойств уникальных объектов, количественные характеристики которых меняются скачкообразно, без промежуточных стадий (Дромашко, Романовский, 1984).
Традиционными дисциплинами, используемыми в этом случае являются теория вероятностей и алгебра. Так, для описания возрастной структуры популяций применяется матричное исчисление (матрицы Лесли). Методы факторного и регрессионного анализа используются для аппроксимации экспериментальных результатов в различных областях биологии. На теоретико-вероятностном подходе покоится все здание классической генетики (Мендель, 1968; Рокицкий, 1978).
Для описания самых разнообразных классов биологических закономерностей все шире применяются также отрасли математики как теория конечных автоматов (Kauffman, 1969; Moulin, 1992; Huberman, Glance, 1993" и др.), теория фракталов (Borovk, Frankkamenetskii Grasberg, 1994; Nettleton, Gariglano, 1994; Ragazzi, 1995).
Когда поведение изучаемого объекта характеризуется непрерывным изменениями, адекватным средством моделирования являются методы непрерывной математики с их богатым аппаратом дифференциальных, интегральных и интегро-дифференциальных уравнений (Беллман, 1987).
Детерминированный подход к моделируемым объектам, основанный на применении дифференциальных и интегральных уравнений, охватывает многие области теоретической биологии. Созданная на базе этого математиче ского аппарата новая научная дисциплина — биологическая кинетика — наиболее успешно применяется в молекулярной биологии (Романовский, 2004; Рубин, Пытьева, Ризниченко, 1987). Здесь на основе идей физической и химической кинетики строятся математические модели протекающих в клетке химических реакций и описываются многие4 аспекты клеточного метаболизма, например, работа регуляторных систем. Методы биологической кинетики используются и в молекулярнойтенетики (Ратнер и др., 1985).
Дальнейшие исследования» функционального состояния организма, изучение его нейрогуморальных механизмов регуляторных процессов адаптации. расширяют арсенал используемых методов математического моделирования. В последнее время большое внимание уделяется изучению сущности процессовфегуляции, заключающихся-в непрерывном обмене информацией, заложенной в ритмической активности мозга и сердца, с использованием аппарата нелинейной динамики (Муха, 2004; Муха, Буров, 2006; Михайлов, 2000; Бибикова, 2000). Проводится исследование возможностей методов церебральной оксиметрии (ЦО) для оценки кислородного обеспечения головного мозга при патологиях, связанных с гипоксическими состояниями.и локальными циркулярными нарушениями (Сафонова, 2006; Wolf et al 2003; Стулин и др., 2006; Sabanova et al, 2004).
Уравнения механики деформируемого твердого тела используются для описания поведения биологических тканей как сплошной среды под воздействием ударных нагрузок, в частности, последствий механического воздействия на мозг человека при черепно-мозговой травме (Агапов и др., 2002, 2006).
Используется математическое моделирование функциональной зависимостью. Например, предлагается по модели П.В. Симонова ЭМ =ДПТ, Ин-Ис) — автора потребностно-информационной теории эмоций проводить оценку связи между силой переживаемой эмоции и величиной ее информационной и потребностной компоненте при мысленном воспроизведении эмоции и пере і живанием ее в реальном эксперименте (Сидорова и др., 2008; Фролов и др., 2000; Симонов, 2004) и многие другие методы.
Перенесение результатов моделирования на исследуемый объект должно сопровождаться тщательным сопоставлением с экспериментом.
Сложность математических моделей биологических явлений ведет к широкому использованию компьютерной техники как для обработки данных и уточнения параметров моделей, так и для постановки машинного эксперимента. Математическое моделирование в биологии тесно связано с созданием новых информационных технологий как инструмента построения содержательных моделей, а также накопления и хранения информации, полученной в результате исследования этих моделей (Benton, 1996).
Массовое применение персональных компьютеров позволяет решать разнообразные задачи научного, познавательного и образовательного характера и дает возможность привлечения методических подходов и разработки программных средств, чтобы максимально облегчить работу пользователю. С этой целью ставится задача объединения уже существующих программ в единый пакет, содержащий разные блоки анализа (Дромашко и др., 1994, 1996, 1999, 1998):
1. Элементарный статистический анализ — первичная обработка, вычисление критериев Стьюдента и Фишера, сравнение распределений, разбиение по классам;
2. Корреляционный анализ — выбор уравнения регрессии, определение множественной нелинейной регрессии, вычисление корреляционного отношения, нахождение линейных корреляций, вычисление корреляций по Спирмену и т.п.;
3. Дисперсионный анализ - однофакторный, двухфакторный и трехфак-торный (в том числе учет неполноблочных планов, расчет коэффициентов наследуемости);
4. Многомерный анализ - построение дендрограммы, компонентный анализ, разные виды кластерного анализа; 5. Генетический анализ - вычисление общей и специфической комбинационной способности, оценка комбинационной способности при скрещивании с тестерами, нахождение генетических параметров по методу Хеймана, определение экологической стабильности и пластичности по Пакудину, вычисление путевых коэффициентов Райта и целый ряд других методов.
Этот пакет должен соответствовать современному уровню требований по части удобства и легкости его использования.
Применение средств вычислительной техники облегчает громоздкие расчеты и позволяет моделировать такие биологические явления, которые в реальном масштабе времени трудно или невозможно наблюдать.
Таким образом, существующее многообразие методов математического моделирования широко проникает в .различные области естественных наук, и выбор конкретного из них зависит от характера задач, поставленных перед исследователем.
Определение активности креатинкиназы в общей митохондриальной фракции
При изучении работы некоторых систем или процессов нередко целью исследования является анализ зависимости между количественными показателями, характеризующими их действие в разных условиях внешней среды. В этом случае возникает необходимость восстановления значений «выходных» (результирующих) показателей объектов исследования, характеризующих поведение или результат их функционирования по, так называемым, «выходным» или объясняющим переменным. Для решения этой задачи в качестве исходных данных используют измеренные значения показателей системы или процесса, по которым производится предсказание их работы.
Существует два класса задач, изучающих эту зависимость.
Первый класс. Вид зависимости (функции), связывающей оба показателя, известен с точностью до параметров. Он определяется, например, физическими законами, связывающими эти показатели. В этом случае говорят о задаче подбора экспериментальной модели, в условиях которой работает исследуемый объект.
Второй класс. О виде функции, связывающей эти показатели, нет никаких априорных сведений, но известна экспериментальная модель, в условиях которой изучается работа данного процесса или явления. Этот случай имеет место в таких науках как медицина, биология, социология. Тогда говорят о подборе кривой, хорошо объединяющей в некотором смысле, показатели хиу.
Изучаемые переменные хиу могут отличаться друг от друга априорными сведениями и принятой моделью порождения данных. Рассмотрим некоторые из них. 1) Обе переменные - зависимая у и независимая х являются величинами не случайными и измеряются без ошибок (или ошибками измерения можно пренебречь), и учитываются все факторы, влияющие на их значения. Тогда функция, описывающая зависимость между х и у, будет иметь вид у = F(x), где F(x) f(x,a), где F - закон, по которому каждому значению х соответствует определенное значение у = f{x,a) — является аппроксимацией истинной функциональной зависимости Л». 2) Обе переменные являются случайными, но изменяются без ошибок (или ошибками измерения можно пренебречь). Случайность понимается в том смысле, что не учитываются факторы, влияющие на их значения. Тогда функция, описывающая зависимость между у и х, имеет вид у = /(х,а). 3) Обе переменные являются случайными, но независимая переменная х измеряется без ошибок (контролируется в эксперименте), а зависимая переменная у измеряется с ошибками. Тогда функция, описывающая зависимость между х и у, имеет вид Е(у) = f(x, а), где Е(у) - математическое ожидание случайной величины у. 4) Обе переменные случайные и измеряются с ошибками. В этом случае ряды наблюдения представляют собой истинные значения плюс ошиб ка. Х = и + г, Y = V + 5, а функция имеет вид V = f(U,av...,an). Для этой задачи оценка параметров ах,а2,...,ап сильно усложняется и может быть проведена при достаточно сильных ограничениях на распределения ошибок є и 8.
Остальные различия между х и у, как-то: одна переменная не случайная, другая - случайная, но обе измеряются без ошибок, или обе - не случайные, но измеряются с ошибками, и т.д. сводятся к уже перечисленным случаям. 3.3.2 Подбор кривой
В работе решается задача прогнозирования состояния метаболических процессов мозга в условиях гипоксии на примере зависимости между активностью митохондриальных ферментных комплексов I, II, IV ДЦ, активностью митохондриальной креатинкиназы, конечной концентрацией АТФ, а также показателями нуклеотидного фонда мозга в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. Она относится к типу задач 2-го класса, когда отсутствует информация о виде функции, связывающей переменные х и у . В таких случаях рассматривают некоторый класс функций и из него выбирают функцию, наилучшим образом описывающую зависимость между экспериментальными данными х и у . Для таких процедур характерны две степени произвольности. Это проявляется в выборе класса функций и в критерии наилучшей подгонки, который не связан со статистическими соображениями.
При подборе кривой не делают предположений о распределении ошибок измерений переменных, и поэтому в случае использования полученной аппроксимирующей функции для прогнозирования зависимой переменной необходима дополнительная экспериментальная проверка, позволяющая оценить качество прогноза.
Следует отметить, что процедура оценки параметров аппроксимирующей функции и подгонки кривой по существу не различаются. Дадим математическую формулировку задачи в общем» виде. . Дано: а) хх,х2,...,хп и У\- Уг- —Уп - наблюдаемые значения неза висимой переменной х и зависимой переменной у; б) семейство некоторых функций. Требуется подобрать из этого семейства функцию у = /(х, ,... ) независимой переменной х и параметров а],а2,...ак, и определить ах,а2,...,ак так, чтобы выбранная функция хорошо аппроксимировала экспериментальную зависимость.
Зависимость концентрации АТФ в ткани мозга от скорости фосфорилирования ADP под влиянием гипоксического воздействия
Выданном:разделе проведена попытка показать, что?вид моделей, аппроксимирующих зависимость;между разными, показателями,энергоаккуму-лирующего процесса;мозга, интегрально отражает функциональное? состояние- биологической системы при воздействии/ внешней- среды. Эта задача- решается сравнением форм зависимостей конечной, концентрации; АШФ; от суммарной активности МФК .1; .11, IV ДЦ и уровня- АТФ от скорости фосфо-рилирования АДФ (показателя АДФ/t) при одинаковых условиях гипоксического воздействия (атм. давление 310, 270 мм рт.ст. с экспозицией 60 минут).
В наших исследованиях установлено (4.1.2), что линейная; функция y = aQx + ax адекватно отражает зависимость между суммарной активностью окислительных ферментов ДЦ (НАДН-дг+СДГ+ЦО)(д;) и концентрацией АТФ(у) в мозге интактных животных и не меняет своей формы, в условиях гипоксии разной степени тяжести (атм. давление 310, 270 мм ртхт.); Гипок 110 сическое воздействие оказывает влияние только на величину коэффициентов а ,ах (таблица 4.15), которые в дальнейшем принимались за функцию второй факторной переменной - величины атмосферного давления и рассматри вались как а, = ф,(Г) = (A2)j + (A0)j cos (/ = 0,1), коэффициенты (AQ)J,(A1)J,(A2)Jкоторых представлены в таблице 4.17. Для прогнозирова ния конечной концентрации АТФ в мозге животных при дисфункции МФК ДЦ при любой допустимой степени тяжести гипоксического воздействия ("/z") предлагалась модель множественной регрессии y(x,h) = фД/фс + ф /г).
Было показано, что эта функция удобна для прогнозирования расчетным способом энергетического потенциала мозга при нарушении активности МФК ДЦ в экстремальных условиях жизнедеятельности организма (таблица 4.19), т.к. расчетные концентрации АТФ при умеренной и острой гипоксии незначительно отличаются от экспериментальных, и относительная ошибка расчета соответствовала интервалу допустимых ошибок ( 20%)) математической модели.
Концентрация АТФ в ткани мозга зависит от соотношения скоростей его синтеза и распада. Это приобретает особое значение в условиях гипоксии, когда существенно меняется скорость обоих процессов.
Проведены исследования и опубликованы результаты работы по изучению формы количественной зависимости между уровнем АТФ и показателем АДФ// в условиях гипоксии разной степени тяжести (атм. давление 310, 270 мм рт.ст.) и продолжительности, анализа неблагоприятных воздействий на вид этой зависимости, а также возможности применения модели аппроксимации для прогнозирования энергетического потенциала мозга при нарушении способности митохондрий синтезировать АТФ (Мошкова, Хватова, 1997, 2006).
Значения скорости фосфорилирования АДФ и конечной концентрации АТФ в условиях гипоксии разной тяжести н продолжительности Атмосферное давление Экспозиция; в минутах Кол-во опытов; Эксперимент, значения АДФ// мкМоль/мг б/сек. КонцентрацияАТФмкМоль/г ткани; Интактные животные 22 . 3,0±0,2 1,7б±0,06 Атмосферноедавление 310мм рт.ст 30 мин.. : 10 3,56±0,17 1,71±0#56 мин. 9 2,94 0,17 1,85±0,08: 240 мин. 6 2,50±0,12 1,94±0,05 Атмосферное давление 270мм рт.ст 15 МИН; 8 3,02±0,18 1,45±0,08 : р 0,001: мин. 8 2,73±0Д8. 1,63±0;08 мин. 8 3,74±0,23 р 0,05 1,49±0,09 р 0,001 - статистически значимые изменения в сравнении с контролем
Анализ экспериментальных показателей окислительного фосфорилирования не установил определенной направленности их изменений относительно нормы в условиях гипоксии разной степени тяжести и продолжительности. Умеренная-форма гипоксического воздействия (атмосферноегдавление 310мм рт.ст., не вносит статистически значимых, изменений показателей АТФ и АДФ/t (таблица 4.27). При тяжелой форме нарушений кислородного режима наблюдается более выраженный характер изменения выбранных показателей. Так, 15-минутная экспозиция не меняет показатель АДФ/t, но достоверно уменьшает уровень АТФ по сравнению с контролем. 30-минутная гипоксия выравнивает оба показателя до контрольных цифр. 1-часовая экспозиция достоверно увеличивает скорость фосфорилирования АДФ; по сравнению с интактными животными и достоверно уменьшает содержание АТФ.
Аппроксимация зависимости концентрации АТФ, обозначенной как "У и показателя ADP/t, обозначенным за "х", рассматривалась в двух формах: простой - линейной у = а0х + ах и более сложной — дробно-линейной X у = . Оценивалось влияние гипоксического воздействия (атм. давле а0х + ах ние 310, 270 мм рт.ст.) на вид математической зависимости между характе t ристиками процесса окислительного фосфорилирования. Критерием соответствия линейной и дробно-линейной аппроксимации поставленной задаче п п ПИ(У-У,)2 _ ЛУ, служила величина 8 = ———= , где у - ——, коэффициент корреляции г У п и корреляционное соотношение R, равное корню квадратному из коэффици-ента детерминации R . Величина 8 ОД показывала, что коэффициенты линейной и дробно-линейной функций найдены с минимальной погрешностью, а близки к 1 значения г и R позволяли из двух функций выбрать ту, которая наилучшим образом объединяла экспериментальные показатели окислительного фосфорилирования.
В таблице 4.28 представлены коэффициенты а0,а{ и показатели значимости моделей аппроксимации зависимости АТФ(у) от АДФ/фс) в разных условиях гипоксии.
Из таблицы 4.28 видно, что в случае линейной аппроксимации
у = а0х + ах количественной зависимости между выбранными показателями связь слабая (г є (0,3 - 0,6)), а корреляционное отношение R « 0,3 свидетельствует о слабой прогностической способности анализируемой регрессионной модели. В чем мы и убедились при попытке использовать модель множественной регрессии у(х,і)-p0(t)x + p{(t), реконструированную из линейной функции введением второй факторной переменной t - времени пребывания животных в состоянии гипоксии.
