Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Эритроциты. Общие сведения 11
1.1.1. Структура эритроцитов 11
1.1.2. Метаболизм и ионный баланс 12
1.1.3. Структура и функции гемоглобина 13
1.2. Активные формы кислорода 15
1.3. Факторы, вызывающие окислительный стресс в эритроцитах 18
1.3.1. Аутоокисление гемоглобина 18
1.3.2. Фагоциты как источник активных форм кислорода 19
1.3.3. Реакции эритроцитов с ксенобиотиками 20
1.4. Биохимические основы защиты эритроцитов от окислительного стресса. Эндогенные антиоксиданты 21
1.5. Модификация эритроцитов под действием окислителей 24
1.5.1. Перекисное окисление липидов 24
1.5.2. Окисление тиоловых групп белков 25
1.5.3. Действие окислительного стресса на механизмы ионного транспорта 26
1.5.4. Образование гемихромов и высвобождение гемма. Повреждение мембран эритроцитов под действием свободного гемма 29
1.5.5. Изменение деформируемости 33
1.5.6. Экзогенные антиоксиданты и их применение в качестве
лечебных препаратов 33
1.7. Методы,применяемые для оценки активности антиоксидантов 35
2. Материалы и методы 38
2.1. Материалы 38
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Подготовка суспензии эритроцитов 38
2.2.2. Модификация эритроцитов с помощью окислительных воздействий 39
2.2.3. Определение распределения эритроцитов по плотности 39
2.2.4. Определение распределения эритроцитов по осмотической резистентности. Расчет изменения объема эритроцита 40
2.2.5. Измерение образования активных форм кислорода 42
2.2.6. Определение накопления метгемоглобина 43
2.2.7. Измерение преципитации гемоглобина 43
2.2.8. Определение содержания восстановленного глутатиона 43
2.2.9. Оценка перекисного окисления липидов 44
2.2.10. Измерение гемолиза 45
2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 45
3. Результаты исследований 46
3.1. Влияние окислительной системы феназинметосульфат — аскорбат на эритроциты человека 46
3.1.1. Окисление гемоглобина 46
3.1.2. Внутриклеточное образование активных форм кислорода 47
3.1.3. Влияние окислительной системы феназинметосульфат—аскорбат
на объемные параметры эритроцитов. Активация Гардос-каналов 49
3.1.4. Влияние антиоксидантов на продукцию активных форм кислорода
и на изменение осмотической резистентности эритроцитов 56
3.2. Влияние третбутиловой гидроперекиси на эритроциты человека 59
3.2.1. Внутриклеточное образование активных форм кислорода 59
3.2.2. Влияние третбутиловой гидроперекиси на объемные параметры эритроцитов. Активация Гардос-каналов 61
3.2.3. Влияние третбутиловой гидроперекиси на осмотическую резистентность эритроцитов. Эффект клотримазола в бескальциевой среде 66
3.2.4. Действие кальция и клотримазола на индуцированный третбутиловой гидроперекисью гемолиз эритроцитов 68
3.2.5. Действие клотримазола на окислительно-восстановительный статус эритроцитов, подвергнутых окислению в присутствии третбутиловой гидроперекиси 71
3.2.6. Влияние антиоксидантов на внутриклеточную продукцию актив
ных форм кислорода 76
3.2.7. Влияние антиоксидантов на гемолиз эритроцитов 77
3.3. Метод оценки антиоксидантной активности 78
4. Обсуждение полученных результатов 81
Выводы 90
Список цитируемой литературы
- Эритроциты. Общие сведения
- Факторы, вызывающие окислительный стресс в эритроцитах
- Модификация эритроцитов с помощью окислительных воздействий
- Влияние окислительной системы феназинметосульфат — аскорбат на эритроциты человека
Введение к работе
Кислород, необходимый для энергообеспечения клеток и тканей млекопитающих, служит одновременно источником так называемых активных форм кислорода (АФК), являющихся промежуточными продуктами окислительного метаболизма. Механизмы действия АФК сложны, разнообразны и до настоящего времени не вполне изучены. Не вызывает сомнения определяющая биологические эффекты роль клеточных мембран и изменение их структуры и функций под действием АФК.
Эритроциты млекопитающих являются удобной моделью для изучения механизмов окислительных повреждений, поскольку они доступны в больших количествах, не содержат ядер и митохондрий и не способны к синтезу белков. Они циркулируют в крови 120 дней и более других клеток контактируют с кислородом и его активными формами. Постоянное взаимодействие с кислородом вызывает аутоокисление содержащегося в эритроцитах гемоглобина с образованием супероксид-радикалов (02 ), а также других АФК, главным образом, перекиси водорода (Н2О2) и гидроксил-радикалов (ОН.). В организме источниками экзогенных для эритроцитов АФК являются другие клетки крови (тромбоциты, моноциты, нейтрофилы и макрофаги), а также эндотелий сосудов. Кроме того, появлению избыточных количеств АФК в эритроцитах могут способствовать действие радиации и некоторых ксенобиотиков.
Нарушение равновесия между количеством образующихся АФК и антиоксидантными защитными механизмами клетки приводит к избыточному образованию радикалов и создает условия, которые часто называют «окислительным стрессом»
В норме окислительный стресс индуцирует старение эритроцитов, которое, как известно, сопровождается уменьшением клеточного объема, потерей клеточной поверхности, снижением деформируемости и нарушением асимметричного распределения фосфолипидов мембраны. Как известно, постаревшие эритроциты выводятся из кровотока ретикуло-эндотелиалыюй системой, в частности, поглощаются макрофагами.
Хорошо известно, что образование АФК в различных тканях усиливается при воспалении, иммунологических нарушениях, гипоксии и гипероксии, при старении, действии ионизирующего облучения, шоке, ишемии-реперфузии, дефиците витаминов и во многих других патофизиологических ситуациях. Свободно- радикальные формы кислорода принимают участие в патогенезе многих наследственных заболеваний, таких как серповидно-клеточная анемия, талассемия и дефицит глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. Спровоцированное окислительным стрессом повреждение мембран эритроцитов приводит к ухудшению их реологических свойств: снижению деформируемости и повышению адгезивности, спосбствуя развитию ишемии, анемии и гиперкоагуляции, усугубляющих первичную патологию.
В некоторых случаях патологические проявления уменьшаются под действием препаратов, препятствующих развитию окислительных повреждений клеток и тканей - антиоксидантов. В последние годы в мире ведутся интенсивные исследования механизмов действия АФК, а также основанные на результатах этих исследований поиски веществ, обладающих антиоксидантной активностью и пригодных, в первую очередь, для терапии различных заболеваний, связанных со свободно-радикальными повреждениями клеток и клеточных структур.
Одним из необходимых условий для скрининга и количественной оценки эффективности таких препаратов является наличие адекватных экспериментальных моделей, позволяющих осуществлять сравнительное исследование.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было создание экспериментальной модели для оценки активности антиоксидантов с использованием эритроцитов, подвергнутых окислительным воздействиям.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Изучить влияние окислительной системы феназин метосульфат+аскорбат на эритроциты человека.
2. Изучить влияние третбутиловой гидроперекиси на эритроциты человека
3. Для каждой окислительной системы определить наиболее легко измеряемые и чувствительные к присутствию антиоксидантов параметры модифицированных эритроцитов.
4. Разработать метод оценки антиоксидантной активности на основе выбранной окислительной системы.
Научная новнзиа
Показано, что действие на эритроциты окислителей (феназин-метосульфат, третбутиловая гидроперекись) приводит к активации кальций-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект). Активация Гардос-каналов при действии феназин-метосульфата вызывает сжатие (дегидратацию) эритроцитов, а при действии третбутиловой гидроперекиси частично компенсирует увеличение объема клеток. Высказано предположение, что активация Гардос-каналов является общим свойством клеточного ответа при окислительных воздействиях.
Впервые показано, что присутствие клотримазола приводит к существенному усилению гемолиза, индуцированного третбутиловой гидроперекисью. Преинкубация суспензии эритроцитов с антиоксидантами достоверно снижает степень гемолиза.
Предложен новый метод оценки активности антиоксидантных препаратов по степени ингибирования гемолиза, индуцированного третбутиловой гидроперекисью в присутствии клотримазола.
Практическая значимость
Предложенный нами метод внедрен в систему контроля качества на ОАО Завод экологической техники и экопитания «Диод» (г. Москва) как один из способов контроля биологической активности выпускаемой продукции. С помощью данного метода проводится оценка антиоксидантной активности веществ, используемых в производстве в настоящее время, а также скрининг потенциально обладающих антиоксидантной активностью соединений в процессе разработки новых препаратов.
Этот метод оценки антиоксидантной активности (АОА) может быть рекомендован для использования при разработке и производстве лекарственных препаратов. Для внедрения предложенного метода не требуется сложного и дорогостоящего оборудования. Для проведения анализа достаточно небольшого объема крови ( 100 лл). Метод является высоко чувствительным и хорошо воспроизводимым.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на: 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск), сентябрь 2005 г., объединенном симпозиуме «Oxidanis and antioxidants in biology» (Oxygen Club of California and University of Turin, Alba, Италия), сентябрь, 2006 г., 16-м конгрессе «European Association for Red Cell Research» (Oxford, Великобритания), март 2007 г., VII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2006 г.,
международной конференции «Oxidative stress in diseases», (Bratislava, Словакия), апрель 2008 г.
Диссертационная работа апробирована 3 октября 2008 г. на заседании проблемной комиссии № VI «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ ГНЦ РАМН.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 219 источника. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 30 рисунками и 1 таблицей.
Эритроциты. Общие сведения
Гемоглобин легко подвергается одноэлектронному окислению и восстановлению и может служить как источником, так и ловушкой свободных радикалов [113]. Аутоокисление оксигемоглобина может быть схематично представлено следующим образом: Hb(Fe 2+)02 metHb (Fe3+ ) + 02
В этой реакции образуется метгемоглобин, пе способный к переносу кислорода, а также супероксид-радикал О2"1, наличие которого приводит к дальнейшему образованию АФК. Поэтому важно, чтобы в физиологических условиях аутоокисление было минимальным, а образующийся метгемоглобин мог восстанавливаться до функционально активного оксигемоглобина [77], [158]. Скорость аутоокисления НЬ на несколько порядков ниже, чем скорость аутоокисления свободного гема. Это значит, что погруженность гема в глобин обеспечивает значительную защиту его от аутоокисления [202].
Как уже было отмечено, в присутствии супероксид- аниона и перекиси водорода переходные металлы, главным образом железо, катализируют образование высокореактивного биологически вредного гидроксил-радикала . О; + Fe3+ Fe2» + О, 20J + 2Н Н202 + 02 HjO, + FeJ ОН + ОН" + Fe+
Возникает вопрос, откуда берется то железо, которое обеспечивает образование гидроксил-радикалов в эритроцитах? Вначале Sadrzadeh SM и др. [182] предполагали, что образование гидроксил-радикала катализирует свободный гемоглобин, действуя по механизму, подобному механизму реакции Фентон, причем восстановленное железо оксигемоглобина разлагает Н2О2 с образованием метгемоглобина, гидроксила и гидроксил-радикала. В случае, когда 6-ая координационная связь занята СО, или если гемоглобин предварительно окислен до метгемоглобина, реакция заблокирована, что подтверждает необходимость присутствия реактивной гемовой группы с восстановленным железом [182].
Однако несколько позже на тот же вопрос, является ли гемоглобин Фентон- реагентом, был дан отрицательный ответ. Gutteridge [93] показал, что при инкубации коммерческого метгемоглобина с Н2О2, параллельно с образованием гидроксил- радикалов, из белка высвобождаются ионы железа [93]. Поскольку хелатор железа дефероксамин (ДФО) и трансферрин ингибировали реакцию образования гидроксил- радикала, был сделан вывод, что каталитическим действием обладает не молекула гемоглобина как таковая, а именно ионы железа, свободного или находящегося в составе гема. Позднейшие исследования подтвердили эту точку зрения [93], [175], [164]. Оксигемоглобин и метгемоглобин взаимодействуют с Н2О2 и гидроперекисями с образованием феррилгемоглобина [ferrylHb; HbFe(IV)=0] и оксоферрилгемоглобина (охоferrylHb; HbFe(IV)=0 , соответственно) [217]. При избытке Н2О2 происходит деградация гемовой группы гемовых белков (гемоглобина, метгемоглобина и цитохрома С) с высвобождением железа из гема [93].
Антибактериальная активность нейтрофилов, моноцитов и макрофагов определяется, главным образом, их способностью генерировать свободно- радикальные токсические оксиданты (АФК) в процессе «дыхательного взрыва» ("respiratory burst"), сопровождающего фагоцитоз. Этот процесс является результатом сборки на плазматической мембране ферментативной системы NADPH- оксидазы. «Дыхательный взрыв» сопровождается резким повышением скорости поглощения кислорода и усилением образования NADPH вследствие активации ГМШ. [26], [216]. Образующиеся АФК диффундируют как в клетку, так и из клетки в кровь, где они могут взаимодействовать с эритроцитами и эндотелием, вызывая окислительный стресс [82], [120]. Под действием АФК, образующихся в активированных фагоцитах, в эритроцитах наблюдаются перекисное окисление липидов, снижение деформируемости и, в некоторых случаях, гемолиз. Индуцированное этими изменениями нарушение микроциркуляции может способствовать развитию ишемии, усугубляя патологические сдвиги при воспалениях и сепсисе [14], [30].
В процессе циркуляции эритроциты могут накапливать окислительные повреждения, отражающие окислительный стресс в других тканях и органах. Поэтому некоторые авторы предлагают использовать эритроциты как биомаркеры для мониторинга не только патологий самих эритроцитов (например при талассемии, СА), по и других патологических условий, связанных с окислительным стрессом [145].
Гемоглобин может взаимодействовать с различными редокс-активпыми ксенобиотиками и их метаболитами, инициируя серию реакций, сопровождающихся образованием новых радикалов и окислителей.
Известно, что сильный окислитель феназин метосульфат (ФМС) может in vitro взаимодействовать с донорами водорода, такими как NADH, с образованием супероксидных анионов (Ог") и других радикалов кислорода [86]. При дезоксигенации эритроцитов ФМС оказывает на них аналогичное действие и без аскорбата [91]. Было обнаружено, что при инкубации эритроцитов в присутствии системы ФМС + аскорбат значительно возрастают потоки К+ через мембрану [150]. В более поздних работах такие же изменения проницаемости мембран для К+ были обнаружены при инкубации дезоксигенированных эритроцитов с ФМС без добавления аскорбата [90]. Авторами было отмечено сходство между наблюдаемыми эффектами и увеличением проницаемости мембран эритроцитов при повышении внутриклеточного Са2+ (Гардос-эффектом) и сделан вывод об активации под действием ФМС Гардос-каналов. Однако в этих экспериментах изменения объема эритроцитов не были зарегистрированы [90].
Другой ксенобиотик, часто применяемый при изучении механизмов окислительных процессов, — трет-бутиловая гидроперекись (t-BHP). Это вещество высокотоксично и, благодаря своей липофильной природе, способно легко проникать через мембрану эритроцита. Алкоксильные и пероксильные радикалы, образующиеся из перекиси, могут повреждать как липидные, так и белковые компоненты мембран [71]. В клетке перекись восстанавливается, взаимодействуя с различными формами гемоглобина и с глутатиоиероксидазой с поглощением G-SH [68], [209], [218].
Полученные данные показывают, что структура и метаболизм эритроцитов сильно изменяются под действием окислительного стресса, вызванного t-BHP, что связано, главным образом, с нарушением структуры цитоскелета [45].
Соединение, вызывающее гемолитическую анемию, фенилгидразин (PHZ) при инкубации с Э индуцирует образование супероксид-аниона и перекиси водорода [111]. Фенилгидразин высвобождает железо из окисленного гемоглобина, поэтому может инициировать ПОЛ, благодаря образованию гидроксил-радикалов [92]. Оп вызывает окислительное повреждение белков цитоскелета, инициируя образование S-S связей с денатурированным гемоглобином или его фрагментами. Позднее McMillan и др. исследовали действие разных гемолитических агентов — оксидангов: фенилгидразина, дапсон-гидроксиламина и дивицина на перекисное окисление липидов и окисление белков цитоскелета эритроцитов человека и крысы, чтобы перепроверить постулат, согласно которому ПОЛ играет ключевую роль в инициации гемолитической реакции. Полученные результаты показали, что удаление поврежденных окислением эритроцитов из кровотока является результатом окислительной атаки на белки цитоскелета, и не связано ни с ПОЛ, ни с потерей асимметрии фосфолпидного слоя [155]. К такому же выводу эти авторы пришли в результате исследования действия на эритроциты еще одного ксенобиотика — примахииа [40].
Факторы, вызывающие окислительный стресс в эритроцитах
Взаимодействие АФК с клеточными белками изменяет редокс-статус клетки и определяет АФК-индуцированные нарушения клеточных функций. АФК могут взаимодействовать с SH-группами белков, погруженных в мембрану [209].
Например, Н2О2 может легко пересекать мембрану и превращаться в гидроксил- радикалы с последующим окислением SH-групп. Окисление SH-групп приводит к образованию межмолекулярных связей с образованием белковых олигомеров.
Тетрамер гемоглобина содержит 6 цистеиновых остатков, причем 4 из них спрятаны и мало доступны для окислителей. Под действием окислителей пул восстановленного глутатиона резко уменьшается в результате окисления, катализируемого глутатион-пероксидазой, с образованием окисленного глутатиона. Показано, что обработка эритроцитов окислителем t-BHP увеличивает активность глутатион-пероксидазы. При концентрации t-BHP 2 мМ скорость глугатион- пероксидазной реакции возрастает на 80% [219], увеличивая антиоксидантную защиту. Вслед за окислением G-SH до GSSG происходит окисление оксигемоглобина. Под действием редокс-активных соединений [176] или в процессе преципитации окисленного гемоглобина окисление SH-групп приводит к образованию дисульфидных связей между цепями или смешанных дисульфидов с участием тиоловых групп глутатиона.
Исследование окислительного повреждения эритроцитов с помощью трех разных окислительных систем, генерирующих супероксид-радикалы, показало, что окислительные воздействия сильно влияют на механические свойства клеточных мембран. При этом заметно снижалось содержание тиоловых групп мембранных белков. С помощью гель-электрофореза SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis) было показано, что мембранные белки образуют высокомолекулярные комплексы путем образования межбелковых S-S связей (cross- linking) с гемоглобином. Это может быть причиной увеличения модуля упругости и коэффициента вязкости мембраны эритроцитов при их обработке оксидантами. Обнаружена достоверная корреляция между ужесточением мембраны и снижением содержания тиоловых групп белков. Полученные результаты показывают, что окисление белковых SH-групп супероксид-анионами является механизмом, изменяющим свойства мембран эритроцитов под действием оксидантов при физиологических и патологических условиях [213].
Установлено, что проницаемость мембран эритроцитов для ионов существенно повышается при гемолитических анемиях, связанных с дефицитом некоторых ферментов, а также под действием ряда окислителей (фенилгидразина, Н2О2, третбутил-гидропероксида, феназинметосульфата, NEM, диамида) [86], [103], [123], [150], [194].
Одним из основных последствий окислительного повреждения клеточных мембран является потеря внутриклеточного калия. Вопрос о механизмах изменения проницаемости мембран остается противоречивым и не до конца выясненным.
Модификация механизмов ионного транспорта может осуществляться также через индуцированные АФК изменения свойств фосфолипидов в процессе перекисного окисления липидов. Важно различать два возможных последствия индуцированного АФК ПОЛ. Первое заключается в том, что модификацию ионного гомеостаза вызывает неспецифическое изменение проницаемости в самих липидах [205], [65]. Второе предполагает, что перекисное окисление модифицирует физические свойства фосфолипидов таким образом, что изменяется конформация встроенных в мембрану белков, участвующих в процессах транспорта [123].
При изучении сравнительной эффективности гидрофильных и гидрофобных антиоксидантов в защите эритроцита от действия t-BHP было показано, что ПОЛ не является основной причиной индуцированного окислением изменения проницаемости эритроцитов. Дополнительными факторами, изменяющими ионный баланс под действием окислителей, являются снижение активности Ыа,К-АТФ-азы и Na,K,2Cl котранспорта [71]. Кроме того, было показано, что инкубация нормальных эритроцитов человека с третбутил-гидропероксидом приводит к ингибированию кальциевого насоса [179]. Этот эффект, приводящий к увеличению концентрации внутриклеточного кальция, определяется взаимодействием t-BHP с гемоглобином, поскольку он наблюдается только в цельных клетках или розовых тенях, но отсутствует в белых тенях [160].
Итак, АФК модифицируют механизмы ионного транспорта как непосредственно, действуя на транспортные и регуляторные белки, так и косвенно — через перекисное окисление мембранных фосфолипидов. Индуцированная АФК модификация SH-групп белков ионного транспорта может приводить к изменению кальциевого гомеостаза. Используя метод локальной фиксации потенциала (пэтч- клэмп), в мембране эритроцитов исследовали разные типы ионных каналов, в том числе Гардос-каналы и неселективные ионные каналы, физиологическая роль которых не вполне ясна [115].
Зависящий от внутриклеточной концентрации кальция выход калия из эритроцитов был впервые обнаружен в 50-х годах венгерским исследователем Г. Гардосом [87]. В дальнейшем было показано, что отвечает за это явление (Гардос- эффект) К+-специфичный мембранный белок (Гардос-канал) [136], [149]. В последнее время было обнаружено несколько типов Са-зависимых К каналов и показано их наличие в самых разнообразных клетках.
Модификация эритроцитов с помощью окислительных воздействий
В работе использовали кровь здоровых проинформированных доноров, полученную на Станции переливания крови Гематологического научного центра РАМН
В работе использовали следующие реактивы: клотримазол, трет-бутиловая гидроперекись, ионофор кальция А 23187, диметил-фталат, дибутил-фталат, аскорбиновая кислота, глюкоза, диметилсульфоксид, 2 , Т — дихлорфлуоресцеин- диацетат, тиобарбитуровая кислота, трихлоруксусная кислота, арсенит натрия, восстановленный глутатион ("Sigma Chemical", St Louis, США), 1 M HEPES буфер («Flow Laboratories», Шотландия), феназинметосульфат, кверцетин, рутин, тролокс, нарингенин («Fluka», Швейцария), дигидрокверцетин (3, 3 , 4 , 5, 7 - пентагидроксифлавон) был любезно предоставлен аналитической лабораторией ОАО «Диод». Остальные реактивы были отечественного производства квалификации не ниже «х.ч.»
Для работы использовали кровь проинформированных здоровых доноров, взятую на цитрате натрия. Эритроциты осаждали путем центрифугирования на лабораторной центрифуге (ОПН-3, РФ) и дважды отмывали физиологическим раствором или HEPES-буфером содержащим (гаМ): (10 HEPES, 5 KCl, 0.8 MgS04, 1.5 СаСЬ, 5 глюкозы, U=300 мОсм.кг, pH 7.4), каждый раз центрифугируя и удаляя надосадочную жидкость и верхний слой осажденных клеток, обогащенный тромбоцитами и лейкоцитами. Третий раз эритроциты отмывали HEPES-буфером и ресуспендировали их в том же буфере, получая исходную суспензию с гематокритом 40-60%. Гематокрит определяли с помощью микрогематокритного метода. Содержание лейкоцитов составляло не более 0.5 на 1000 эритроцитов. Время от приготовления суспензии до начала измерений не превышало 2 часов.
Все измерения проводили в течение суток после взятия крови и в течение трех часов после отмывания эритроцитов. В ходе эксперимента исходная суспензия находилась при температуре +5С. Непосредственно перед измерением суспензию разбавляли и инкубировали при температуре измерения.
Исходную 40-60 % суспензию отмытых эритроцитов разбавляли HEPES- буфером до Hct =5%. В тех опытах, где изучали роль ионов кальция, часть проб готовили, ресуспендируя эритроциты в HEPES буфере, не содержащем кальция, с добавлением 1 мМ ЭГТА. Готовили исходный раствор аскорбиновой кислоты в HEPES-буфере (100 мМ, рН = 7.4). Суспензию эритроцитов инкубировали при температуре 37С в течение 20 мин при постоянном медленном перемешивании с аскорбиновой кислотой и ФМС в интервале конечных концентраций 25-1500 jaM или без ФМС (контроль). В опытах по оценке антиоксидантной активности до начала окисления клетки инкубировали в течение 20 мин. в присутствии изучаемых антиоксидантов.
Модификация эритроцитов третбутиловой гидроперекисью
Исходную 40-60 % суспензию отмытых эритроцитов разбавляли HEPES- буфером до Hct = 5%. Исходный раствор t-BHP в HEPES буфере (100 шМ) готовили в день опыта из 70% раствора. Суспензию эритроцитов (Hct=5%) инкубировали при 37С при постоянном медленном перемешивании с t-BHP. В качестве контроля использовали 5% суспензию интактных эритроцитов с добавлением соответствующих объемов HEPES-буфера.
2.2.2. Распределение эритроцитов по плотности измеряли с помощью фталатного метода Danon & Marikovsky [61]. Готовили смеси диметил- и дибутил-фталата, имеющие значения удельной плотности в интервале от 1.066 до 1.144 г/мл. В микрогематокритные капилляры набирали по капле (5-7 мм) каждой смеси, после чего заполняли эти капилляры исследуемой суспензией эритроцитов, запаивали и центрифугировали в микрогематокритной центрифуге при 12000 g в течение 6 минут. Измеряя отношение длины верхней части столбика эритроцитов, разделенного фталатной смесью, к общей длине столбика (%) для смесей разной плотности, получали распределения эритроцитов по плотности.
Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с помощью разработанной нами модификации метода Lew [132], [133]. Для определения светопропускания в работе использовали планшетный спектрофотометр "Thermomax" (Molecular devices) Для измерений готовили 7 буферных растворов различной осмотичности (25, 50, 75, 100, 125, 150, 300 мОсм/кг), смешивая в определенных пропорциях изотонический HEPES-буфер и гипотонический HEPES- буфер, не содержащий NaCl (осмотичность 25 мОсм/кг). Первый горизонтальный ряд плоскодонных лунок планшета содержал по 300 мкл дистиллированной воды, а последующие ряды - по 300 мкл буфера в порядке возрастания осмотичности. Затем с помощью многоканальной пипетки в лунки добавляли по 6 jn.1 5% суспензии Э (конечное значение Hct=0.1%), таким образом, чтобы каждому вертикальному ряду лунок планшета соответствовал один исследуемый образец эритроцитов. Планшет помещали на минишейкер (MSI, IKA) и инкубировали пробы 30 минут при комнатной температуре и постоянном интенсивном встряхивании. После окончания инкубации непосредственно перед измерением светопропускания в каждую лунку добавляли по 20 мкл 20% раствора NaCl. В результате интервал значений осмотичности содержимого лунок составлял 425 - 565 мОсм/кг, вместо 0-150 мОсм/кг.
Влияние окислительной системы феназинметосульфат — аскорбат на эритроциты человека
Для изучения действия окислителей на клетки и ткани млекопитающих in vitro используют различные системы, индуцирующие образование АФК. В их числе сильный окислитель феназин метосульфат (ФМС). Известно, что в присутствии миллимолярных концентраций аскорбата ФМС ингибирует активность кальциевого насоса эритроцитов, повышает внутриклеточную концентрацию Са2+ и резко стимулирует проницаемость мембран эритроцитов для К+. При дезоксигенации эритроцитов ФМС оказывает на них аналогичное действие и без аскорбата [90]. Хотя перечисленные эффекты свидетельствуют об активации под действием ФМС Са2+- зависимых калиевых каналов (Гардос-каналов) [90], в литературе, насколько нам известно, отсутствуют данные о характере изменения объемов нормальных эритроцитов под действием этого окислителя.
Окисление гемоглобина
На Рис. 5 представлена зависимость накопления MetHb от концентрации ФМС в присутствии аскорбата и без него. Можно видеть, что присутствие миллимолярных концентраций аскорбата в среде достоверно повышает накопление метгемоглобина в клетках. Все последующие эксперименты проводили в присутствии ЮмМ аскорбата. Для оценки образования внутриклеточных АФК под действием окислительной системы ФМС-аскорбат эритроциты преинкубировали с DCFH-DA в течение 30 минут перед добавлением окислительной системы. Измерения распределения эритроцитов по интенсивности флуоресценции производили с интервалом 3 минуты в течение 20 минут после добавления окислителя.
На Рис. 6 представлены типичные диаграммы интенсивности флуоресценции клеток: перед добавлением системы ФМС-аскорбат (Control), через 3 минуты и через 9 минут после добавления 25 мкМ ФМС+ 10 мМ аскорбата. Таким образом, наглядно показано, что инкубация эритроцитов с окислительной системой 25 мкМ ФМС+ 10 мМ аскорбата уже через 3 минуты приводит к образованию близкого к насыщению количества АФК. Представлены диаграммы интенсивности флуоресценции до и через различные интервалы времени после добавления к суспензии эритроцитов окислительной системы ФМС (25 мкМ) + аскорбат (10мМ).
Известно, что ФМС может взаимодействовать в клетке с донорами водорода, такими как ЫАОН, с образованием супероксидных анионов (О2 ) и других радикалов [168]. Было обнаружено, что при инкубации эритроцитов в присутствии системы аскорбат + ФМС потоки К+ через мембрану значительно возрастают [91]. В более поздних работах такие же изменения проницаемости мембран для К+ были обнаружены при инкубации дезоксигенированных эритроцитов с ФМС без добавления аскорбата. Авторами было отмечено сходство между наблюдаемыми эффектами и увеличением проницаемости мембран эритроцитов при повышении внутриклеточного Са2+ (Гардос-эффектом) [90]. Несмотря на то, что в этих экспериментах не были непосредственно зарегистрированы изменения объема эритроцитов, авторами было сделано предположение об активации под действием ФМС Гардос-каналов.
Для проверки этого предположения мы изучали изменение объемных параметров (плотности и осмотической резистентности) эритроцитов, подвергнутых окислительному воздействию системы ФМС-аскорбат. На Рис. 7 представлены результаты экспериментов, в которых оценивали изменение распределения клеток по плотности под действием системы ФМС- аскорбат и зависимость наблюдаемых эффектов от присутствия Са2+ в суспендирующей среде.
На Рис. 7А представлены результаты типичного эксперимента. Приведены кривые распределения по плотности ингактных эритроцитов (кривая 1), Э, проинкубированных с 50 мМ ФМС + 10 мМ аскорбата в НЕРЕБ буфере, содержащем 1.5 мМ Са2+ (кривая 2) или в НЕРЕБ буфере, содержащем 1 мМ ЕвТА (кривая 3). Молено видеть, что распределение эритроцитов, обработанных системой ФМС- аскорбат в Са-содержащей среде, существенно сдвинуто в сторону больших значений плотности по сравнению с контролем, что свидетельствует о дегидратации (сжатии) этих клеток. Видно, что в бескальциевой среде эффект сжатия отсутствует (кривая 3). На Рис. 7В представлены усредненные значения сдвига эритроцитов по плотности по данным 6 параллельных экспериментов.
