Введение к работе
Актуальность проблемы
Более 35 лет назад было показано, что эритроциты как носители могут успешно использоваться в клинической практике. Это возможно потому, что данные клетки отличаются некоторыми уникальными преимуществами по сравнению с другими системами доставки лекарств. Эритроциты являются не только натуральными, безопасными и доступными в препаративном количестве, но и способны к биодеградации, длительно циркулируют в крови (в среднем 120 дней [Гайтон А.К. и др. 2008]), снижают аллергические и иммунологические реакции на введение белковых препаратов в кровь. Существует ряд направлений в использовании эритроцитов-переносчиков, одно из которых состоит в том, что клетки рассматриваются не как пассивные переносчики, а как биореакторы. Это подразумевает под собой «включение» ферментов, которые в ряде случаев не содержатся в нативных эритроцитах, и благодаря тому, что субстраты и продукты реакций, катализируемых данными ферментами, достаточно хорошо проходят через мембрану эритроцита. Такие носители могли бы эффективно перерабатывать токсическое вещество непосредственно в кровотоке. Идея использовать эритроциты в качестве биореакторов была высказана около 30 лет назад [Adriaenssens К., et al. 1976; Updike S.J., et al. 1976; Ihler S.J., et al. 1976] и доведена до применения в клинической практике на примере ряда ферментов (L-аспарагиназа, аденозиндеаминаза) [Kravtzoff R., et al. 1996; Вах В.Е., et al. 2007]. В эритроциты был «включен» целый ряд ферментов, которые были предложены для терапии таких болезней и состояний как: острый лимфобластный лейкоз, лимфосаркома, подагра, болезнь Гоше, гипераммониемия, интоксикация метанолом и др. Результаты ряда работ подтверждают, что нагруженные ферментами эритроциты удаляют из кровеносного русла токсические и повышенные концентрации различных соединений, таких как метанол и формальдегид при отравлении метанолом [Magnani М., et al. 1993], глюкоза при диабете [Rossi L., et al. 1992].
Эритроциты-биореакторы для снижения в крови концентрации этанола и ацетальдегида - главного токсического продукта метаболизма спирта, были предложены около 10 лет назад. С этой целью в эритроциты были «включены» два фермента: алкогольдегидрогеназа и альдегиддегидрогеназа. К сожалению, данная разработка как и многие другие не используются в клинике в настоящее время. Мы полагаем, что проблема может заключаться в неэффективной скорости работы биореакторов. В данной работе были изучены возможные причины, ограничивающие высокую скорость биореактора на примере окисления этанола.
Цель работы.
Целью работы было выяснение причин ограничивающих скорость окисления этилового спирта эритроцитами-биореакторами в условиях in vitro и преодоление этих ограничений с целью увеличения скорости окисления спирта в ацетат.
Задачи исследования
Исследование зависимости эффективности работы ферментов (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) от их количества и от доступности субстратов (пирувата, НАД , НАДН).
Выбор оптимальных условий для «включения» максимального количества ферментов в эритроциты.
Изучение влияния процедуры «загрузки» ферментов на функциональную полноценность клеток.
Оценка стабильности «включенных» в эритроциты ферментов в процессе хранения.
Научная новизна
В результате работы были выяснены причины, ограничивающие высокую эффективность эритроцитов-биореакторов по окислению этанола, и найдены способы их преодоления. Были разработаны методы, позволяющие эффективно включать белки с достаточно большим молекулярным весом и получать «нагруженные» эритроциты близкие по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными эритроцитами. Был произведен сравнительный анализ биореакторов, полученных различными методами по следующим характеристикам: определение осмотической резистентности эритроцитов, распределение нагруженных эритроцитов по плотностям, измерение эритроцитарных индексов. Было показано, что метод одноступенчатого гипоосмотического диализа является предпочтительным по сравнению с двух- и трехступенчатым как по проценту «включения» ферментов, так и по жизнеспособности эритроцитов. Изучение эритроцитов во время хранения показало, что в течение 7 суток не происходит значительного снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов.
Практическая ценность работы
Полученные результаты важны для понимания причин, которые ограничивают скорость не только окисления этанола, но и иных субстратов в случае создания других эритроцитов-биореакторов, В данной работе было показано, что скорость работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола и ацетальдегида можно многократно
увеличить, в 45 и более раз. Такое увеличение эффективности может, например, улучшить терапию пациентов при отсутствии митохондриальной формы альдегиддегидрогеназы с низким значением константы Михаэлиса или при алкогольной интоксикации, зачастую сопровождающейся алкогольной болезнью печени.
Положения, выносимые на защиту:
Одним из ограничителей эффективной работы биореактора по окислению этанола является пируват, поступление которого только за счет гликолиза недостаточно. В его присутствии скорость увеличивается в 17 раз.
Вторым ограничителем служит пул НАД и НАДН, добавление которых при диализе позволяет восстановить их близкие к исходным концентрации в эритроцитах, увеличивая эффективность работы эритроцитов-биореакторов в 3 раза.
Разработаны методы «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека позволяющие получать высокий процент «включения» белков и клетки сходные по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными. Оптимальным методом «включения» ферментов является одноступенчатый метод диализа.
При хранении эритроцитов-биореакторов в течение 7 суток происходит снижение активности альдегиддегидрогеназы в 2 раза, тогда как активность алкогольдегидрогеназы снижается незначительно.
Апробация работы состоялась 09.11.2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 «Биохимия, биофизика и реология крови» в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом Научном Центре РАМН.
Материалы диссертации были представлены на ряде российских и международных научных конференций: IV Московский международный конгресс «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия; VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», 23-24 ноября 2006, Москва, Россия; 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия; Gordon Research Conferences «Drug Carriers in Medicine and Biology», 24-29 Aug., 2008, B.S., Montana, USA; Международный форум по нанотехнологиям, 03-05 декабря 2008, Москва, Россия; Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», 06 декабря 2008, Москва, Россия; 14 Европейский
конгресс по биотехнологии «Симбиозис», 13-16 Sep., 2009, Barcelona, Spain.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ из которых, 2 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов в сборниках трудов отечественных и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из следующих основных разделов: введение; литературный обзор (содержит 4 рисунка); постановка задачи (содержит 1 рисунок); материалы и методы; результаты (содержит 20 рисунков и 5 таблиц); обсуждение; выводы и список цитированной литературы - 223 источников из них 6 русскоязычных.
Диссертационная работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН (лаборатория физической биохимии системы крови; заведующий лабораторией д.б.н., профессор Ф.И. Атауллаханов).
