Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Характеристика активных форм кислорода и ферментов системы антиоксидантной защиты 12
2.1.1. Активные формы кислорода 12
2.1.2. Супероксиддисмутаза 15
2.1.3. Глутатионпероксидаза 24
2.1.4. Краткая характеристика других ферментных антиоксидантов 34
2.2. Влияние алиментарных факторов на развитие окислительного стресса 37
2.2.1 Влияние дефицита белка в рационе на развитие окислительного стресса 38
2.2.2 Влияние жировой составляющей рациона на развитие окислительного стресса 41
2.3. Кинетика ферментативных реакций 44
3. Экспериментальная часть 48
3.1. Материалы и методы исследования 48
3.1.1. Экспериментальные животные и условия опытов 48
3.1.2. Схема проведения эксперимента 51
3.1.3. Приготовление тканевых гомогенатов 53
3.1.4. Специальные методы исследования 54
3.1.4.1. Определение активности глутатионпероксидазы 54
3.1.4.2. Определение активности супероксиддисмутазы 55
3.1.4.3. Определение содержания малонового диальдегида эритроцитах и в гомогенатах тканей 56
3.1.4.4. Определение содержания малонового диальдегида в плазме крови 57
3.1.4.5. Определение содержания диеновых конъюгатов в эритроцитах и в гомогенатах тканей 57
3.1.4.6. Определение содержания диеновых конъюгатов в плазме крови 58
3.1.4.7. Определение витамина Е в плазме крови 58
3.1.4.8. Определение селена 58
3.1.4.9. Определение меди, цинка, марганца 59
3.2 Результаты собственных исследований 60
3.2.1. Исследование кинетических характеристик супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы и концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени крыс при микроэлементозах Си, Zn, МПИЛИ Se 60
3.2.1.1. Исследование массы тела, биохимических показателей
плазмы крови и концентрации меди, цинка, марганца и селена в печени
и плазме крови крыс получавших рационы с обогащением Си, Zn, Мп
ИЛИ Se 60
3.2.1.2. Исследование содержания микроэлементов меди, цинка, марганца или селена у крыс получавших рационы с обогащением Си, Zn, Мп ИЛИ Se 62
3.2.1.3. Исследование содержания продуктов перекисного окисления липидов в печени, эритроцитах и плазме крови крыс, получавших рационы с обогащением Си, Zn, Мп ИЛИ Se 64
3.2.1.4. Исследование кинетических параметров глутатионпероксидазной реакции в печении и в эритроцитах крыс получавших рационы с обогащением Se 66
3.2.1.5. Исследование кинетических параметров супероксиддисмутазной реакции в печении и в эритроцитах крыс получавших рационы с обогащением Си, Zn, Мп 68
3.2.2 Исследование кинетических характеристик супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы и концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени крыс находившихся на низкобелковом рационе 70
3.2.2.1. Исследование массы тела и биохимических показателей в плазме крови крыс, получавших Си, Zn, Мп ИЛИ Se на фоне низкобелкового рациона 70
3.2.2.2. Исследование содержания микроэлементов в печени и плазме крови крыс, находившихся на низкобелковом рационе 74
3.2.2.3. Исследование концентрации продуктов перекисного окисления липидов в печени, эритроцитах и плазме крови крыс, находившихся на низкобелковом рационе 79
3.2.2.4. Исследование изменений Кти Vmax глутатионпероксидазной реакции в печении и в эритроцитах крыс, находившихся на низкобелковом рационе 83
3.2.2.5. Исследование изменений Кти Vmax супероксиддисмутазной реакции в печении и в эритроцитах крыс, находившихся на низкобелковом рационе 86
3.2.3. Исследование кинетических характеристик супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы и концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени крыс на фоне высокожирового рациона 90
3.2.3.1 Исследование биохимических показателей плазмы крови крыс, находившихся на высокожировом рационе 90
3.2.3.2. Исследование содержания микроэлементов в печени и плазме крови крыс, находившихся на высокожировом рационе 92
3.2.3.3. Исследование концентрации продуктов перекисного окисления липидов в печени, эритроцитах и плазме крыс, находившихся
на высокожировом рационе 96
3.2.3.4. Исследование кинетических характеристик Кт и Vmax глутатионпероксидазнои реакции в печении и в эритроцитах крыс, находившихся на высокожировом рационе 100
3.2.3.5. Исследование кинетических характеристик Кти Vmax супероксиддисмутазнои реакции в печении и в эритроцитах крыс, находившихся на высокожировом рационе 103
4. Заключение 106
5. Выводы 114
6. Список литературы 115
- Характеристика активных форм кислорода и ферментов системы антиоксидантной защиты
- Влияние алиментарных факторов на развитие окислительного стресса
- Исследование кинетических характеристик супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы и концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени крыс при микроэлементозах Си, Zn, МПИЛИ Se
- Исследование концентрации продуктов перекисного окисления липидов в печени, эритроцитах и плазме крови крыс, находившихся на низкобелковом рационе
Введение к работе
Дисбаланс рациона современного человека по макро- и микронутриентам является фактором, повышающим риск развития многих заболеваний. На фоне разбалансированного рациона часто наблюдается развитие окислительного стресса (ОС), который может служить причиной прогрессирования начинающихся патологических отклонений или являться первопричиной заболевания [35, 137]. Исследования фактического питания в регионах России выявили повсеместное распространение дисбаланса рациона по макронутриентам - белкам, жирам и углеводам. Чаще всего встречается или дефицит полноценного белка или избыток жиров [1, 4, 7, 10, 15, 20, 22, 23, 28, 29, 34, 37, 39, 42, 48-52]. Дисбаланс по микронутриентам представлен нехваткой одного или нескольких микроэлементов, например у детей преобладает дефицит цинка, йода, селена [43, 51]. Особенно важна полноценность рациона в так называемые критические периоды, когда полноценность питания отражается на продолжительности и качестве жизни взрослого - питание матери во время беременности и питание ребёнка - ранний постнатальный период [101, 158]. Обеспеченность микронутриентами антиоксидантного действия в данном случае играет важную роль в развитии организма и профилактике заболеваний [36, 40, 46, 71].
Развитие ОС при дефиците белка в рационе характеризуется, как снижением эффективности работы системы антиоксидантной защиты (АОЗ), так и увеличением активности прооксидантных систем. При недостатке белка отмечено значительное снижение активности ферментов системы АОЗ (супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы) [200], транскрипции и активности у-глутамилсинтетазы [239], концентрации восстановленного глутатиона [55, 56, 173, 199] и увеличение активности моноаминоксидазы, которая является источником свободных радикалов [2, 223]. Как следствие снижения активности ферментов системы АОЗ на фоне дефицита белка в рационе происходит накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [38, 200]. Так при содержании белка в рационе крыс 6% по калорийности и ниже наблюдается увеличение содержания малонового диальдегида (МДА) — в печени, легких, сердце и в кишечнике [99, 136, 223]. Таким образом, очевидна актуальность коррекции ОС на фоне дефицита белка. Исследования показали возможность такой коррекции: наблюдавшиеся снижение активности ферментов системы АОЗ и накопление продуктов ПОЛ на низкобелковом рационе было полностью компенсировано дополнительным введением в питьевую воду цинка [67, 200]; в другом исследовании введение N-ацетил цистеина в рацион приводило к увеличению концентрации глутатиона и снижению содержания МДА [56].
В питании современного человека, как известно, жиры животного и растительного происхождения составляют значительную часть рациона. Увеличение жировой составляющей рациона является предпосылкой для развития многих заболеваний, таких как гипертония, атеросклероз, ожирение [86]. Развитие ОС на высокожировом рационе [103, 166] предшествует и в дальнейшем ускоряет и сопровождает развитие этих заболеваний. Например, прогрессирование ОС, продемонстрированное в адипоцитах в ответ на повышенный уровень жирных кислот, вело к снижению регуляции продукции адипоцитокинов, включая адипонектин, ингибитора активатора плазминогена — 1, интерлейкина—6 и протеин хемотаксический моноцитов, что ассоциируется с развитием метаболического синдрома. [121] На высокожировом рационе отмечено снижение транскрипции генов Zn, Cu-СОД, Мп-СОД [79]. В работе Vijayakumar, 2004 отмечено значительное увеличение уровня МДА на высокожировой диете и диеновых конъюгатов (ДК) и значительное снижение активности СОД, каталазы, ГП и глутатионтрансферазы и снижение концентрации глутатиона в печени, сердце, почках, кишечнике и аорте по сравнению с контролем [224]. Изучено влияние жиров разного происхождения на развитие ОС. В нескольких работах подчеркнуто, что увеличение концентрации продуктов ПОЛ наиболее выражено у животных получавших больше ненасыщенных жиров [139, 163, 203], что, возможно, связанно с поступлением с пищей жиров с высоким перекисным числом [148]. Очевидно, что развитие ОС на фоне избытка жиров в рационе требует коррекции антиоксидантами. Проведенные исследования так же показали возможность такой коррекции. Так доказана эффективность некоторых препаратов (например, препараты, полученные из чеснока - привели к увеличению активности глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы и концентрации глутатиона).
Таким образом, исследование состояния и адаптивных возможностей системы АОЗ при разбалансированном по макронутриентному составу рационе и коррекция ОС дополнительным введением микроэлементов (МЭ) является актуальной. Поскольку в формировании адаптационного ответа на любые виды внешнего воздействия значимую роль играют механизмы долговременной адаптации, в системе АОЗ представленные ферментным звеном, в частности металлопротеинами СОД и ГП, актуальным является исследование биологической активности меди, цинка, марганца и селена в качестве средства профилактики развития экспериментального ОС. Оценка кинетических параметров СОД и ГП, нутриопротеомных изменений данных ферментов и накопления продуктов ПОЛ при коррекции дополнительным введением МЭ, экспериментально смоделированным алиментарным дисбалансом, позволит установить молекулярные механизмы изменения функционирования данных ферментов параллельно с развитием ОС. При этом применение металлоорганических соединений, как низкотоксичных доноров микроэлементов, является наиболее целесообразным.
Цель и задачи исследования
Цель работы: исследование особенностей активности антиоксидантных ферментов и интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в условиях различной обеспеченности микроэлементами при белковой недостаточности и избыточном поступлении жиров с пищей.
Задачи исследования:
Изучить кинетические особенности антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы) в эритроцитах и печени, содержание продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид (МДА), диеновые конъюгаты (ДК)) в эритроцитах, плазме и печени при различных уровнях потребления микроэлементов (Си, Zn, Mn, Se) на фоне: стандартного полусинтетического рациона; дефицита белка в рационе; высокожирового рациона.
Научная новизна
Впервые в экспериментальных условиях дисбаланса рационов по белковому и жировому компонентам и их дополнительного обогащения медью, цинком, марганцем и селеном изучены кинетические параметры (максимальная скорость - Vmax и константа Михаэлиса - Кт) металл-зависимых ферментов первого и второго звена антиоксидантной защиты - глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы печени и эритроцитов, а также определено содержание продуктов ПОЛ в печени и крови.
Впервые выявлено что, потребление рациона с избыточным содержанием жира приводило в печени к увеличению Кт СОДР к супероксид -генерирующей системе в 5,7 раза. Одновременное повышение Кт СОДР и концентрации продуктов ПОЛ свидетельствует о ключевой роли СОД в ферментативном звене системы АОЗ. Продолжительное (28 дней) потребление рациона с низким содержанием белка приводило к снижению Кт ГПР к субстрату (третбутиловой перекиси) на 33% и сопровождалось достоверным снижением концентрации МДА в печени.
Впервые установлено, что при введении в рацион в органической форме селена (ОД мг на 1 кг рациона), цинка, меди и марганца в количествах в 2 раза превышающих адекватный уровень не зависимо от содержания белка и жира в рационе Кт ГПР снижалась на 60-70% по сравнению с контролем. Величина Кт ГПР печени отрицательно коррелировала с концентрацией селена в данном органе.
Увеличение содержания селена в рационе в 2 раза по сравнению с оптимальным уровнем не изменяло Кт и Vmax глутатионпероксидазной реакции (ГПР) эритроцитов, а недостаточное потребление селена (0,02 мг на 1 кг рациона) приводило к увеличению в 3,7 раз Кт ГПР эритроцитов к субстрату по сравнению с Кт, характерной для фермента эритроцитов крыс, получавших оптимальное количество селена.
Практическая значимость работы
Исследование кинетических свойств Кт и Vmax СОДР и ГПР в сочетании с оценкой процессов ПОЛ может быть использовано для детальной оценки функционального состояния системы АОЗ данных ферментов и нутриопротеомных изменений данных ферментов с целью оценки адекватности потребления микроэлементов (Си, Zn, Мп и Se) при различном характере питания.
Апробация работы Апробация работы проведена на конференции отдела фундаментальных исследований ГУ НИИ питания РАМН "25" июня 2008г. Материалы диссертационной работы доложены на Конгрессе Всероссийской ассоциации диетологов и нутрициологов "Диетология: проблемы и горизонты" (Москва, 2006), V Всероссийском Конгрессе «Профессия И Здоровье» (Москва, 2006), Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От Экспериментальной Биологии к Превентивной и Интегративной Медицине» (Судак, 2006), XVI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» IT+M&Ec (Гурзуф, 2008), 10 European Nutrition Conference "Annals of Nutrition and Metabolism" (Paris, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 42 таблицы и иллюстрирована 6 рисунками. Указатель литературы включает 53 отечественных и 193 зарубежных источника.
Характеристика активных форм кислорода и ферментов системы антиоксидантной защиты
Восстановление мало реакционно-способного (в обычных условиях) кислорода, как известно, используется организмом в основном для синтеза АТФ в митохондриях с помощью цепи переноса электронов. Однако параллельно происходит генерация активных форм кислорода (АФК) которые одновременно, как физиологически необходимы, так и опасны для жизнедеятельности клетки [79]. Первым шагом образования АФК считается одноэлектронное восстановление кислорода до супероксид аниона [11, 116, 165]. Супероксид анион является молекулой более реакционно-способной, чем кислород, и способен оказывать токсическое воздействие на организм. Повреждающее действие супероксид аниона объясняют взаимодействием с глутатионом и снижением концентрации последнего, взаимодействием с оксидом азота с образованием высокотоксичного пероксинитрита и влиянием на активность некоторых ферментов. Присоединяя еще один электрон супероксид 0{ превращается в двухзарядный анион Ог2". В свободном состоянии такой анион не существует и после присоединения протонов, он переходит в гидроперекисный радикал НОг" или перекись водорода Н202 стабильную молекулу способную диффундировать через мембраны, влиять на активность ферментов и образовывать высоко токсичный гидроксильный радикал ОН , который является наиболее реакционно-способным среди АФК, образующихся в биологических системах: он может разрывать любую С-Н или С-С связь. Радиус миграции радикала ОН меньше ЮОА, что сравнимо с размерами органических молекул. Фактически гидроксильный радикал будет взаимодействовать с первой попавшейся молекулой.
Помимо вышеперечисленных соединений АФК являются синглентный кислород, гипогалоиды, органические радикалы и перекиси [35].
Состояние, при котором наблюдается повышенное образование свободных радикалов и продуктов их взаимодействия с молекулами клетки в результате увеличения образования АФК системами, генерирующими эти соединения, или в результате снижения эффективности работы системы АОЗ, называется окислительным стрессом (ОС). При развитии ОС происходит сдвиг тканевого баланса антиоксидантов и прооксидантов в сторону последних, результатом чего является срыв функционирования защитных систем и развитие окислительного повреждения ткани. Вследствие высокой реакционной способности АФК в условиях ОС модификации подвергаются белки, пептиды, свободные аминокислоты, углеводы, полиненасыщенные жирные кислоты и нуклеиновые кислоты [16, 81, 88, 137, 138]. Результатом модификации белков является снижение или увеличение активности ферментов, последствием взаимодействие АФК с ДНК может быть развитие онкологических заболеваний, ПОЛ приводит к нарушению целостности мембран и образованию альдегидов. Возникающие в процессе ПОЛ органические перекиси могут также включаться в процесс генерации радикалов, так как в присутствии металлов переменной валентности наблюдается их разложение с образованием алкоксильного радикала. Однако, наряду с токсическими проявлениями АФК, уже второе десятилетие интенсивно обсуждается их роль в физиологических процессах: в микробиоцидном действии, как вторичных мессенджеров, регуляция Red-ox состояния клетки и др. [14, 18, 240].
Основными производителями эндогенных АФК являются митохондрии. АФК образуются как непосредственно в дыхательной цепи, так и ферментами цитратного цикла (аконитазой) и моноаминоксидазой [2, 222]. Генерация АФК так же происходит и в цитозоле клетки: ксантиноксидазой, гемоглобином, рибофлавином, катехоламинами; в органеллах цитозоля: пероксисомах, лизосомах, эндоплазматическом ретикулуме; в клеточной мембране: липооксигеназой, ферментами синтеза простагландинов, NADPH оксидазой. Таким образом, всевозможное расположение АФК — генерирующих систем в клетке делает вероятным взаимодействие любой молекулы клетки с АФК.
Регуляция физиологических концентраций АФК в организме человека и животных осуществляется за счет функционирования двух систем: системы их генерации и системы АОЗ.
Система АОЗ представлена ферментным и неферментным звеном. К первому относят ферменты: специфически взаимодействующие с АФК (СОД, ГП, глутатионтрансферазу, каталазу); восстанавливающие окисленный глутатион (глутатионредуктазу); удаляющие последствия перекисного окисления липидов; белки, предотвращающие образование свободных радикалов за счет связывания железа (трансферин, ферритин, гемосидерин), меди (церуллоплазмин). К неферментным антиоксидантам относят низкомолекулярные соединения: некоторые витамины способные образовывать стабильные радикалы (аскорбиновая кислота, токоферолы, каротиноиды), SH-содержащие молекулы (глутатион, цистеин, тиоредоксин), а так же коэнзим Q, мочевину, мочевую кислоту, билирубин, мелатонин, эстрогены [35].
Одним из факторов определяющих эффективность функционирования ферментативного звена системы АОЗ является обеспеченность организма микроэлементами, входящими в состав ферментов СОД и ГП. Данные ферменты содержат в своем составе цинк, медь, марганец, селен, и играют ключевую роль в защите организма человека и высших животных от избыточного образования и токсического действия свободных радикалов и перекисей.
Влияние алиментарных факторов на развитие окислительного стресса
Дисбаланс рациона современного человека по микро и макронутриентам является фактором, повышающим риск развития многих заболеваний. Развитие ОС на фоне не сбалансированного питания может служить причиной прогрессирования начинающихся патологических отклонений или являться причиной заболевания. Известно, что ОС сопровождает ряд физиологических и патофизиологических феноменов и процессов, таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхо-легочные заболевания, старение, канцерогенез и многие другие. Пища, поступающая в желудочно-кишечный тракт млекопитающих является одновременно источником как ингибиторов образования АФК, так и прооксидантов. Наиболее часто в рационе наблюдается или дефицит полноценного белка [204] или избыток жиров. В этой связи существенный интерес представляют, вопросы, связанные с возможным влиянием жировой и белковой составляющих рациона на АОЗ и развитие ОС, а так же возможные пути коррекции системы АОЗ.
Содержание белка в диете, а так же его качественный состав влияет на развитие ОС. Накопление продуктов взаимодействия АФК с биологическими молекулами организма на фоне дефицита белка в рационе было продемонстрировано в целом ряде работ [38, 92, 200]. Выявлено влияние на развитие ОС как содержания белка в диете, так и его происхождения (растительного или животного).
Развитие ОС при дефиците белка в организме является суммарным следствием действия различных факторов, вклад которых в развитие ОС может быть разным по значимости. Так короткий период полужизни основных ферментов системы АОЗ (Си, Zn-СОД - 24 - 30 часов, ГП цитозольная — 2,8 суток период полужизни активности фермента, 5,8 дней период полужизни белка [76, 184, 152, 209]) является одной из предпосылок для объяснения падения активности СОД и ГП при дефиците белка, которое является косвенным показателем снижения содержания ферментов в клетке. Отмеченное увеличение активности моноаминоксидазы показанное в слизистой полости рта крыс при недостатке белка в рационе [223], так же так же способствует увеличению генерации АФК [2].
Одна из основных причин развития ОС при белковой недостаточности — снижение концентрации восстановленного глутатиона [157, 55], что, по-видимому, является следствием не только дефицита аминокислоты цистеина, но и снижением активности ферментов синтезирующих глутатион. Исследования ферментов, участвующих в синтезе глутатиона, показали, что при дефиците белка в рационе снижена транскрипция и активность у-глутамилсинтетазы [239].
Известно, что антиоксидантные свойства свободных аминокислот не столь выражены, как у витамина Е или фенолов, однако предполагается что, благодаря высокой концентрации аминокислот в клетке их вклад в АОЗ значителен. Таким образом, снижение при белковой недостаточности, концентрации аминокислот в клетке [226] является ещё одной предпосылкой для развития ОС. Альбумин способен связывать металлы, это позволяет предположить его опосредованный вклад в общую АОЗ, и соответственно возможное участие гипоальбуминемии при дефиците белка в рационе в развитии ОС [55].
Дефицит белка снижает сопротивление организма к внешнему неблагоприятному воздействию: при облучении крыс, недостаточно обеспеченных белком, наблюдалось увеличение содержания продуктов ПОЛ и окисленных белков в печени и продуктов ПОЛ плазме крови, концентрации негемового железа в плазме и снижение способности связывать железо [199]. Значительное снижение активности ферментов системы АОЗ (СОД, каталазы, ГП, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы), концентрации глутатиона и цинка и увеличение содержания продуктов ПОЛ в печени показано при потреблении крысами корма с 8% содержанием белка [200]. Увеличение концентрации МДА в печени, легких, сердце при 6% содержании белка в диете крыс, в кишечнике при 4% содержании белка в диете крыс в печени [99, 136, 223]. При потреблении крысами корма с содержанием 2% и 25% белка по калорийности в течение 4 недель установлено увеличение концентрации МДА в тканях (головном мозге, печени, почках легких и сердце) в группе животных с белковой недостаточностью. Активность СОД и каталазы в головном мозге и печени у этих животных была значительно выше, а в почках и легких значительно ниже, чем у крыс, получавших корм, содержащий 25% белка [144].
Снижение концентрации глутатиона и увеличение концентрации МДА при белковой недостаточности показано в экспериментах [55] у мышей, [56, 57, 157] у крыс. Снижение содержания глутатиона было наиболее выражено в печени (на 75% при дефиците цистеина) меньше в головном мозге на 10% [173] и в работе не было отмечено отклонений в почках, головном мозге, крови и плазме крови мышей в работе [55]. Установлено влияние белковой недостаточности на ферменты метаболизма цистеина в печени крыс [70, 206].
Развитие ОС влияет на синтез белка. В работе Ayala, 1996 установлено снижение активности одного из ключевых ферментов синтеза белка фактора элонгации 2 в результате его окисления в печени у самок крыс [63].
Известно, что дефицит цинка способствует развитию ОС [132], при этом, в условиях белковой недостаточности (2% и 5% белка в диете) мобилизация цинка из костей полностью восполняет дефицит цинка в пище. В диетах крыс с высоким содержанием (20% и 25%) белка такая компенсация недостаточна и развивается дефицит цинка [188]. Наблюдавшееся снижение активности ферментов системы АОЗ и накопление продуктов ПОЛ при потреблении низкобелкового рациона крысами было полностью компенсировано дополнительным введением в питьевую воду цинка сульфата (227 mg/1) [200, 67]. Увеличение концентрации глутатиона и снижение ТБК-продуктов при белковой недостаточности было отмечено при введении N-ацетил цистеина в рацион старых крыс [56]
Таким образом, результаты многочисленных исследований доказывают эффективность антиоксидантов в снижении ОС, однако дальнейшее рассмотрение действия конкретных антиоксидантов требует дополнительного подтверждения и понимания патологии [115, 177]. Поэтому является актуальным исследование кинетических параметров СОД и ГП на фоне ОС при дополнительном введении меди, селена, цинка и марганца.
Исследование кинетических характеристик супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы и концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени крыс при микроэлементозах Си, Zn, МПИЛИ Se
Для изучения влияния дополнительного потребления с рационом МЭ на СОДР и ГПР крысы отъемыши (возраст 21 день) в течение 14 дней содержались на сбалансированном полусинтетическом рационе, обогащенном или Se или Си, Zn и Мп. БЫЛИ выбраны дозы селена 0,1 и 0,2 мг/кг корма (соответственно группы K+Se и K+2Se), так как известно, что дозы 0,1 мг/кг корма достаточно для достижения максимальной активности ГП, а влияние потребления высоких доз селена с рационом на константу Михаэлиса ГПР не изучено. Животные опытных групп К+2Ме и К+4Ме получали в составе рациона Си, Zn и Мп в двух и четырёх кратной дозировке по отношению к физиологической дозе, которую получала контрольная группа. Это позволило оценить влияние Си, Zn и Мп на кинетические параметры СОДР при превышении суточной нормы данных МЭ на 200 и 400%. Известно, что эссенциальные микроэлементы при поступлении в организм в больших количествах в течение определённого периода времени проявляют токсичность [43, 114, 123, 125, 126, 245]. Чтобы избежать явных проявлений токсичности вводимых металлов, экспериментальные дозы завышены только в 2 и 4 раза. В то же время это отвечает реальной ситуации, когда население потребляя обогащенные витаминами и микроэлементами продукты дополнительно принимает витаминно - минеральные комплексы, таким образом, получая эссенциальные нутриенты в количествах в 2-3 раза превышающие суточную потребность.
Содержание крыс в течение 2х недель на рационах включающих разное количество Си, Zn, Mn ИЛИ Se не оказывало, какого либо влияния на суточные привесы (табл. 9) и массу печени. На вскрытии, каких либо макроскопических изменений внутренних органов не выявлено. Что может свидетельствовать об отсутствии явных проявления токсичности микроэлементов в опытных группах по сравнению с контролем. Так же на фоне потребления микроэлементов не выявлено изменений показателей белкового обмена в плазме крови, что свидетельствует об отсутствии влияния вводимых микроэлементов на синтез белка, в том числе на исследуемые ферменты (табл. 10).
Оценка концентрации селена в печени на 14 день выявила, что у крыс группы K+2Se содержание селена было статистически достоверно выше, чем в печени животных контрольной группы и группы K+Se (на 488% и 278% соответственно) (табл. 11). В плазме крови крыс групп K+Se и K+2Se концентрация селена была выше, чем в контрольной группе (на 150% и 334% соответственно). Введение селена привело к значительному увеличению концентрации этого микроэлемента, как в печени, так и в плазме крови. Наиболее выражено увеличение содержания селена в печени и плазме крови, крыс группы потреблявшей наибольшее количество данного микроэлемента в составе рациона, что согласуется с литературными данными о дозозависимом повышении концентрации селена в органах [84].
Исследование концентрации меди, цинка и марганца в печени крыс групп К+2Ме и К+4Ме на 14 день выявило отсутствие достоверных различий по цинку и меди в данных образцах. Концентрация марганца была выше по сравнению с контрольной группой в печени крыс группы К+2Ме и К+4Ме (на 47% и 84% соответственно) (табл. 12).
Как известно цинк и медь являются функциональными антагонистами (конкуренция за транспортеры двухвалентных металлов) [44], что возможно и проявилось отсутствием изменений концентрации данных микроэлементов в печени. Марганец, так же как и цинк, при поступлении через эпителий кишечника является конкурентом меди за транспортеры двухвалентных металлов [44], но, по-видимому, выбранный срок являлся коротким для проявления таких антагонистичных отношений, несмотря на значительное дозозависимое увеличение концентрации марганца в печени.
Оценка содержания продуктов ПОЛ на 14 день не выявила никаких достоверных различий концентрации МДА и ДК в печени и плазме крови крыс между контрольной и опытными группами (табл. 13 и 14).
Изменения концентрации продуктов ПОЛ были отмечены в эритроцитах крыс групп К+2Ме, К+4Ме и K+Se: увеличилось содержание МДА, по сравнению с контрольной группой (на 134%, 127 и 123% соответственно). Так же было выявлено достоверное различие между опытными группами, получавшими дополнительно селен в составе рациона: концентрация МДА в группе K+2Se была на 29% достоверно ниже, чем в группе K+Se (табл. 15).
В эритроцитах крыс группы К+2Ме концентрация ДК была на 53% выше, а в группе К+4Ме ниже на 54% по сравнению с контрольной группой. При этом на 70% ниже содержание ДК в эритроцитах крыс группы К+4Ме, чем в группе К+2Ме. Концентрация ДК на 24% ниже в эритроцитах крыс группы K+2Se, чем K+Se.
Исследование концентрации продуктов перекисного окисления липидов в печени, эритроцитах и плазме крови крыс, находившихся на низкобелковом рационе
В печени крыс контрольной группы отмечено статистически достоверное снижение концентрации МДА на 14 день (на 49%) (табл.25). На 28 день содержание МДА в печени у контрольной группы на 25% ниже по сравнению с началом эксперимента, но на 48% выше, чем на 14 день (р 0,05). В печени животных группы НБ не отмечено статистически достоверных отклонений концентрации МДА на 28 день по сравнению с концентрацией МДА в печени крыс на 14 день. У крыс групп К+МЭ и НБ+МЭ на 28 день концентрация МДА в печени выше, чем на 14 день (на 127 и 55% соответственно). На 14 день содержание МДА в печени животных получавших рацион НБ на 73% выше, чем в контрольной группе, но на 28 день статистически достоверных отклонений от контроля не отмечено. В печени крыс группы, получавшей рацион К+МЭ, концентрация МДА выше контроля на 28 день на 51%. У крыс содержавшихся на НБ рационе и дополнительно получавших микроэлементы концентрация МДА как на 14, так и на 28 день выше контроля (на 72 и 80%) При этом соответственно концентрация МДА на 14 день выше в группе НБ+МЭ по сравнению с группой К+МЭ на 74%, а на 28 день на 87% по сравнению с группой НБ.
У крыс получавших контрольный рацион на 14 день было отмечено снижение концентрации ДК в печени на 21% по сравнению с началом эксперимента (р 0,05). На 28 день содержание ДК на 21% выше, чем на 14день. Содержание ДК в печени крыс достоверно увеличилось во всех опытных группах с 14 по 28 день (на 13, 29, 27% соответственно НБ, К+МЭ, НБ+МЭ). У крыс получавших НБ рацион только на 14 день концентрация ДК выше, чем в контрольной группе (на 11%). В печени животных групп получавших дополнительно микроэлементы содержание ДК выше, чем в контрольной группе на -10% только на 28 день. Между опытными группами статистически достоверных отклонений концентрации ДК в печени не выявлено.
В контрольной группе крыс, получавших полноценный рацион, на 14 день наблюдается снижение концентрации МДА в плазме крови (на 50%) (р 0,05) (табл. 26). К 28 дню этот показатель снизился на 75%. При этом в плазме крови крыс контрольной группы содержание МДА снизилось статистически достоверно и с 14 дня по 28 день (на 50%). В плазме крови крыс всех опытных групп отмечено статистически достоверное снижение концентрации МДА на 28 день по сравнению с 14 днем (на 48%, 55%, 58% соответственно НБ, К+МЭ, НБ+МЭ). Не выявлено никаких достоверных отличий концентрации МДА в плазме крови между контрольной группой и опытными группами. В группе НБ+МЭ содержание МДА в плазме крови крыс выше, чем в группе НБ на 14 день (на 42%).
Оценка содержания ДК на 14 день не выявила никаких отклонений от контрольной группы во всех опытных группах по данному показателю. На 28 день в плазме крови животных группы НБ отмечено более низкое содержание ДК (на 46% ниже). И на этом же сроке в плазме крыс получавших рацион НБ+МЭ концентрация ДК на 32% выше, чем в плазме крови крыс так же получавших низкобелковый рацион, но без дополнительного введения микроэлементов.
В эритроцитах крови крыс контрольной группы на 14 день происходит статистически достоверное увеличение концентрации МДА (на 64%) (р 0,05) (табл. 27). Однако к 28 дню концентрации МДА снижается с 11,3 до 9,4 нмоль/мл (статистически недостоверно) по отношению к 14 дню эксперимента. Более никаких статистически достоверных отклонений не выявлено по данному параметру.
В эритроцитах крыс получавших рацион НБ и К+МЭ на 28 день отмечено снижение содержания ДК (на 19% и 29% соответственно) по сравнению с концентрацией ДК в эритроцитах крыс на 14 день. Не замечено никаких достоверных отличий концентрации ДК в эритроцитах между контрольной группой крыс и опытными группами животных. На 14 день концентрация ДК в эритроцитах крыс получавших рацион НБ+МЭ на 24% ниже, чем в группах НБ и К+МЭ.
Известно, что дефицит белка в рационе является фактором способствующим увеличению концентрации продуктов ПОЛ в различных органах [99, 144, 200, 223]. И как видно на низкобелковом рационе на 14 день происходит увеличение содержания продуктов ПОЛ в печени крыс. На 28 день отмечено увеличение концентрации МДА и ДК в печени крыс в групп получавших МЭ с рационом независимо от макронутриентного состава рациона. По видимому два фактора - НБ рацион и дополнительное потребление с рационом металлов с переходной валентностью способствуют развитию процессов ПОЛ.
Достоверное снижение концентрации ПОЛ в плазме группы НБ, вероятно, является следствием снижения синтеза аполипопротеинов, как было показано в печени и в кишечнике [141] и, как следствие, сниженное формирование липопротеинов основных источников продуктов ПОЛ плазмы крови [159].
