Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ II
ВВЕДЕНИЕ 14-24
Актуальность темы 14
Цель исследования 19
Задачи исследования 19
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной
работы 20
Практическая значимость данной работы 21
Положения, выносимые на защиту 22
Апробация диссертационной работы 22
*.
* Объём и структура диссертации 23
Часть I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 24 - 104
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПУТИ ТРАНСМЕМБРАННОЙ ТРАНСДУКЦИИ
СИГНАЛОВ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ 25-45
1.1. Основные общие рецептор-опосредованные пути трансмембран ной передачи внешнего сигнала в клетках эукариот .25 1.2. Фосфорилирование белков клеточной мембраны,
опосредованное лиганд-рецепторным взаимодействием 27
1.3. Изменения мембранных фосфолипидов в рецептор-зависимых
процессах 28
1.4. Инозитол-трисфосфат (his 1,4,5Рз) 29
*
1.5.Диацилглицерин (ДАТ) - активатор протеинкиназы С 30
1.6. G-белки плазматических мембран в передаче внешних
* сигналов 31
1.7. АТФ как трансмембранный посредник действия ростовых
факторов 32
1.8. Редокс-ферменты плазматических мембран, их связь
с клеточным ростом и транспортом 37
I.9. Трансплазмамембранная редокс-система в клеточном росте:
связь с синтезом АТФ 41
* ГЛАВА II. ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ФАКТОРЫ РОСТА 46-68
2.1. Введение 46
2.2. Мультифункциональная природа полипептидных
факторов роста 47
2.3. Пути действия ПФР на клетки-мишени 48
2.3.1. Типы регуляции роста опухолевых клеток 50
2.4. Роль ПФР в опухолевом ангиогенезе 52
2.5. ПФР и онкогены 58
% 2.6. Роль ПФР в гематопоэзе 64
2.6. 1 .Эритропоэтин (ЕРО) - как представитель гематопоэтических
факторов роста. Его структура и функция 66
ГЛАВАІІІ.РЕЦЕПТОРЫ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА 69
3.1. Структура и функции рецепторных тирозинкиназ 69
3.1. 1 .Внеклеточный домен 71
3.1.2. Трансмембранная область 72
3.1.3. Околомембранный домен 72
3.1.4. Протеин-тирозинкиназный домен .72
3.1.5.Карбокситерминальный (С- концевой) участок тирозинкназ.73
3.2. Классификация РТК 75
3.3. Рецепторы гематопоэтических факторов роста и цитокинов..81
* 3.4. Аутофосфорилирование тирозинкиназ факторов роста 86
* 3.5. Онкогенный потенциал рецепторных тирозиновых киназ 87
3.6. Активация рецептор-опосредуемого тирозинкиназного
сигналтрансдуцирующего пути ведёт к онкогенезу 89
3.7. Активация Ras с участием рецепторных тирозинкиназ 93
3.8. Ras-белок контролирует сигнальные пути, ведущие к раку... .96 3.9. Участие рецепторных тирозинкиназ факторов роста в
регуляции функции Src-семейства тирозинкиназ 98
3.10. Фосфорилирование белков: роль в трансмембранной передаче сигнала к пролиферации, дифференцировке и трансформации
клеток 100
3.11. АТФ - мембранный посредник и усилитель передачи
информации от факторов роста 102
ЧАСТЬ II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 104
ГЛАВА IV. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 104-124
4.1. Выделение обогащенных плазматическими мембранами частиц (ОПМЧ) из различных тканей-мишеней для действия
* факторов роста 104
4.1.1. Выделение плазматических мембран из эритроцитов
человека 105
4.1.2. Выделение ОПМЧ из эритроидных клеток селезенки
мышей линии С57 В1/6 109
4.1.2.1. Изоляция эритроидных клеток из селезенок мышей 109
4.1.2.2. Приготовление ОПМЧ из эритроидных клеток
селезенки мышей 110
4.1.3. Выделение ОПМЧ из ткани лёгкого и лейомиосаркомы.... 110 4.1.4. Выделение ОПМЧ из тканей молочной железы,
кишечника, желудка 111
4.1.5. Выделение ОПМЧ из невриномы человека 112
4.1.6. Выделение ОПМЧ из гепатоцитов крысы и человека: 4.1.6.1. по методу D. Neville (1976) с некоторыми модификация
ми 112
4.1.6.2. по методу A. Hubbard и соавт.(1983) с некоторыми
модификациям и 113
4.1.7. Выделение ОПМЧ из жировой ткани крыс и липосаркомы
человека 114
4.1.8. Выделение ОПМЧ из клеток эндотелия, полученного из
гемангиоматозной ткани человека 115
4.1.9. Выделение ОПМЧ из ткани поджелудочной железы 115
4.1.10. Культивирование клеток человека и мыши 116
4.1.1 1.Вы деление ОПМЧ из культивируемых клеток
линийА431,НеЬаи NIH-3T3 116
4.2. Определение плазмамембранного биосинтеза АТФ 117
4. 3. Количественное определение АТФ биолюминесцентным
методом 118
4. 4. Полярографический метод определения кислорода 118
4. 5. Определение супероксид-аниона, производимого
плазматическими мембранами животных клеток 119
4.6. Определение экспрессии ядерного онкогена с-тус 119
4. 7.Связывание 1Ь1-инсулина с рецепторами плазматических
мембран эритроцитов человека 120
4.8. Статистическая обработка результатов 121
4.9.Используемое оборудование 121
4.10. Список использованных реактивов 122
ГЛАВА V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ
ПЛАЗМАМЕМБРАННОГО СИНТЕЗА АТФ 125-157
5.1. Определение количества специфических рецепторов инсулина
на ПМ эритроцитов 125
5.2. Схема проведения эксперимента по биосинтезу АТФ 127
5. 3. Состав инкубационной среды 128
5.3. 1. Описание предназначения основных веществ, входящих
в состав инкубационной среды 128
5.3.2. Доказательство участия неорганического фосфата в процессе
плазмамембранного синтеза АТФ 135
5.3.3. Исследование влияния кислорода на плазмамембранный
*
синтез АТФ 137
5.4. Определение оптимальной температуры и продолжительности инкубации для протекания процесса плазмамембранного
синтеза АТФ 139
5.5. Выявление оптимальных концентраций факторов роста, в которых они проявляют максимальный стимулирующий эффект на плазмамембранный синтез АТФ при взаимодействии с
клетками-мишенями 146
*
5.5.1. Исследование концентрационной зависимости стимуляции плазмамембранного синтеза АТФ различными концентрациями инсулина на плазмамембранного синтеза АТФ в эритроцитах и в
культивируемых in vitro опухолевых клетках линии HeLa 146
5.5.2. Исследование концентрационной зависимости стимуляции плазмамембранного синтеза АТФ различными концентрациями EGF в культивируемых in vitro опухолевых клетках линии А431
и HeLa 148
5.5.3. Исследование концентрационной зависимости стимуляции плазмамембранного синтеза АТФ различными концентрациями PDGFbb в культивируемых in vitro опухолевых клетках линии
NIH-3T3 150
5.5.4. Исследование концентрационной зависимости стимуляции
плазмамембранного синтеза АТФ различными концентрациями
Ф. эритропоэтина в эритроидных клетках из селезенки мышей
* литтС57В1/б 152
5. 6. Значение целостности плазматической мембраны для
плазмамембранного синтеза АТФ 154
ГЛАВА VI. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ПЛАЗМАМЕМБРАН-НОГО СИНТЕЗА АТФ, СТИМУЛИРУЕМОГО ПОЛИПЕПТИДНЫМИ ФАКТОРАМИ РОСТА, В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТКАХ 158-248
6.1. Влияние ингибиторов трансмембранной NADH-дегидрогеназы
на плазмамембранный синтез АТФ, стимулируемый ПФР в клетках-
мишенях 159
6Л. 1. Исследование влияния адриамицина на плазмамембранный
синтез АТФ 159
6Л.2. Исследование влияния мерсалиловой кислоты на плазмамембранный синтез АТФ, стимулируемый полипептидными
факторами роста в клетках-мишенях 162
6.2. Исследование участия протона (Н+) в плазмамембранном
синтезе АТФ 164
6.3. Исследование механизма сопряжения плазмамембранного синтеза АТФ и передачи электронов в редокс-цепи плазматических
мембран клеток-мишеней для ПФР 170
6.3.1.Измерение потребления кислорода в процессе
плазмамембранного синтеза АТФ ИМ эритроцитов человека 171
6.3.2. Участие супероксид-анион радикала в процессе
плазмамембранного синтеза АТФ 173
6.3.3. Исследование возможного участия переносчика электронов -кофермента Qui в процессе плазмамембранного синтеза АТФ,
стимулированного факторами роста 179
6.3.4. Использование различных акцепторов электронов в процессе плазмамембранного синтеза АТФ для доказательства вовлечения в этот процесс цианиднечувствительной NADH-специфичной
электрон-транспортной цепи плазматических мембран 182
6.3.5. Влияние бензоилгидроксамовой кислоты на плазмамембран
ный синтез АТФ 190
6.4. Изучение роли ионов Na и Na /К - АТФазы в
плазмамем бранном синтезе АТФ, стимулируемом полипептидными
факторами роста 194
6.4.1 .Влияние различных концентраций ионов натрия на инсулинстимулируемый плазмамембранный синтез АТФ в
эритроцитах человека 194
6.4.2. Влияние амилорида на плазмамембранный синтез АТФ,
стимулируемый факторами роста, в различных клетках-
мишенях 197
6.4.3. Влияние оуабаина и моненсина на плазмамембранный синтез АТФ, стимулируемый факторами роста, в различных
клетках-мишенях 203
6.5. Изучение биологической роли плазмамембранного синтеза
АТФ, стимулируемого ПФР в клетках-мишенях 208
6.5. 1. Исследование возможных мест потребления АТФ, синтезированного в процессе взаимодействия факторов роста со своими специфическими рецепторами плазматических
мембран клеток-мишеней 208
6.5. 1.1. Использование структурных АТФ-аналогов для
ингибирования потребителей АТФ 209
6.5. 1.2. Использование генистеина и кверцетина для ингибирования тирозиновых киназ, как возможных
потребителей сигнального АТФ 215
6.5.1.3.Использование тирфостинов для селективного игибирова ния рецепторных тирозиновых киназ - как возможных потребителей
сигнального АТФ 229
6.5. 2. Исследование роли стимулируемого факторами роста
плазмамембранного синтеза АТФ в процессах регуляции клеточного
цикла 240
6.5. 2. 1. Исследование возможной взаимосвязи между аэробным синтезом АТФ на плазматической мембране и экспрессией ядерного
онкогена с-тус в ответ на действие факторов роста 240
6.5. 2. 2. Влияние циклогексимида и пуромицина на плазмамембран
ный синтез АТФ, стимулированный факторами роста, в клетках
печени крысы 243
ГЛАВА УП.ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА НА ПЛАЗМАМЕМБРАННЫЙ СИНТЕЗ АТФ В КЛЕТКАХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА РАЗЛИЧНОЙ
ЛОКАЛИЗАЦИИ 249-339
7.1. Введение 249
7.2. Влияние инсулина на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 252
7.3. Влияние EGF на плазмамембранный синтез АТФ в гистологи
чески различных тканях-мишенях 265
7.4. Влияние TGFa на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 275
7. 5. Влияние bFGF на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 283
Влияние PDGFbb на плазмамембранный синтез АТФ в гистологически различных тканях-мишенях 293
Влияние VEGF на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 303
7.8. Влияние TNFa на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 312
7.9. Влияние IL-2 на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 323
7.10. Влияние GHL на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 332
7.11. Влияние NGF на плазмамембранный синтез АТФ в
гистологически различных тканях-мишенях 336
ГЛАВА VIII. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 340
ГЛАВА IX. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 371
ВЫВОДЫ 378
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 383
Список работ, опубликованных по теме диссертации 465 - 471
Благодарности 472 - 473
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АК - аскорбиновая кислота;
АДФ - аденозин-5'-дифосфат;
АМФ - аденозин-5'-монофосфат;
АТФ - аденозин-5'-трифосфат;
цАМФ - циклический аденозин-5'-монофосфат;
ГДФ - гуанозин-5'-дифосфат;
ГМФ - гуанозин-5'-монофосфат;
ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат;
ДАГ - диацилглицерин;
ДГАК - дегидроаскорбиновая кислота;
кДНК - комплиментарная ДНК, используемая для клонирования гена;
цГМФ - циклический гуанозин-5'-монофосфат;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ОПМЧ - обогащенные плазматическими мембранами частицы;
ПКС - протеинкиназа С;
ПМ - плазматическая мембрана; внешняя мембрана животной клетки;
ПФР - полипептидные факторы роста;
РНК-рибонуклеиновая кислота;
РТК - рецепторные тирозинкиназы;
СОД - супероксиддисмутаза;
Трис- трис-(оксиметил)-аминометан;
Фи - фосфат неорганический;
»
ф, CSFs - колониестимулирующие факторы;
^ Con А - конканавалин А;
EDTA - этилендиаминтетрацетат;
EGTA-этиленгликольтетраацетат;
EEF - фактор, повышающий жизнеспособность эритробластов;
EGF - фактор роста эпидермиса; ЕРО - эритропоэтин; EPOR - рецептор для эритропоэтина;
FCCP - п-трифтор метоксикарбонилцианидфенил гидразон; bFGF - фактор роста фибробластов основный;
Fp(fp5)mui bs-NADH-uHTOxpoM Ъз -редуктаза - флавопротеин, восстанавливающий цитохром Ьз;
FSBA - 5'-п-фторсульфонилбензоиладенозин; G-CSF - колониестимулирующий фактор гранулоцитов; GH- гормон роста (соматотропин); GHL -глицил-гистидил-лизин;
GM-CSF - колониестимулирующий фактор гранулоцитов-моноцитов;
* HGF - фактор роста гепатоцитов;
IGF1 - инсулиноподобный ростовой фактор 1; IGF2 - инсулиноподобный ростовой фактор 2; IL-2,3,4,6,7 - интерлейкины 2,3,4,6,7;
Ins - инозитол;
Insl,4,5P} - инозитол 1,4,5-трисфосфат;
#
InsP4 (Insl,3,4,5P4) - инозитол 1,3,4,5-тетракисфосфат
M-CSF - колониестимулирующий фактор макрофагов;
NAD+ - окисленный никотинамидаденин-динуклеотид;
MAD Н - восстановленный никотинамидаденин-динуклеотид;
NADP+ - окисленный никотинамидаденин-динуклеотид фосфат;
NADP'H - восстановленный никотинамидаденин-динуклеотид фосфат;
^ NGF - фактор роста нервов;
PDGF - фактор роста, выделяемый тромбоцитами;
PLA2 - фосфолипаза А2;
PLC - фосфолипаза С;
Ptdlns - фосфатидилинозитол;
Pt.dIns4P - фосфатидилинозитол 4-монофосфат;
PtdIns4?5P2 - фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат;
TGFa -трансформирующий фактор роста альфа
TGF3 - трансформирующий фактор роста бета;
TNFa - фактор некроза опухолей альфа;
VEGF (VECGF) - фактор роста клеток эндотелия (васкулярный эндотели-
альный ростовой фактор);
AjuH+ - разность электрохимических потенциалов ионов водорода;
ApNa+ - разность электрохимических потенциалов ионов натрия между
водными фазами, разделенными мембраной;
АЧ*- разность электрических потенциалов.
АрН - разность концентраций ионов водорода;
ApNa - разность концентраций ионов натрия;
AS - натрийдвижущая сила.
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Актуальность изучения механизмов, лежащих в основе онкологических заболеваний, бесспорна. Ежегодно множество людей во всем мире умирает от них, или надолго теряет трудоспособность в результате тяжелых хирургических операций [Букин Ю. В., Драудин-Крыленко В. А., 2000; Трапезников Н.Н., Аксель Е.М., 2001; Фёдоров В.Д., 2002; Чехун В. Ф., Кулик Г. П., 2002; Чиссов В.И. и др., 1999; Parkin D. М. et al., 1992]. Поэтому во многих странах ведутся исследования, направленные на разработку новых эффективных средств диагностики и лечения рака. Успехи молекулярной биологии, генетики, иммунологии и медицины обусловили смещение приоритетов в онкологических исследованиях на выявление факторов, детерминирующих злокачественную трансформацию клетки, или отличающих ее от нормальной. Основой для глубокого изучения опухолевого роста стало открытие ростовых факторов, онкогенов, онкобелков [Bishop J. М., 1983; Golde D. W. et al., 1980; James R., Bradshaw R.A., 1984; Heldin C.H., Westermark В., 1984; Schlessinger J., 1993; 1994]. В этой связи имеет особо важное значение исследование механизмов действия факторов роста в норме и при злокачественной трансформации клеток, т.к. молекулярные механизмы их действия еще не до конца понятны.
Полипептидные факторы роста (ПФР) - это белковые гормонопо-добные вещества, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку и трансформацию многих типов клеток-мишеней [Кусень С. И. и др., 1985; Суханов В. А.,1995; Aaronson S.A.,1991; Bradshaw R. A. et al., 1980; Fedi P. et al., 1997; Golde D. W. et al.,1980; James R. et al., 1984]. ПФР взаимодействуют с клетками-мишенями через специфические рецепторы, расположенные на плазматической мембране (ПМ). Установлено, что мембранные рецепторы для полипептидных факторов роста и транс-
формированные белки многих ретровирусных онкогенов представляют собой тирозиновые киназы, которые осуществляют тирозин-специфическое фосфорилирование, в том числе и аутофосфорилирование рецепторов [Bishop J. М., 1983; Cantley L. С. et al., 1991; Chantry A. , 1995; Hunter Т., 2000; Hunter Т., Cooper J. A., 1985; Nishizuka Y., 1984a; Yarden Y., Ullrich A., 1988; Ullrich A., Schlessinger J., 1990; Burgess A. W„ Thumwood С. M, 1994; Roussel M.F., 1998; McCormick F., 2000].
Плазматическая мембрана клетки является важнейшим регулятор-ным и структурно функциональным элементом клетки, обеспечивающим её взаимодействие с окружающей средой. При взаимодействии фактора роста с рецептором наступает стадия трансдукции, то есть преобразования сигнала внутри клеточной мембраны. Трансмембранная передача сигнала осуществляется в результате протекания целого каскада биохимических реакций, которые обеспечивают преобразование этого сигнала в изменение метаболизма или функции клетки [Davis R. J., 1993; Ullrich A., Schlessinger J., 1990; Garrington Т. P., Johnson G. L., 1999; Yaffe M. В., Cantley L. C, 1999; Hunter Т., 2000]. До настоящего времени большинство этих механизмов до конца не расшифровано. Так же нет чёткой ясности в вопросе о том, каким образом информация от комплекса "лиганд-рецептор" преобразуется в плазматической мембране клетки и используется для реализации дальнейших внутриклеточных эффектов.
Исследование молекулярно-биохимических процессов, протекающих на стадии трансдукции в нормальных и опухолевых клетках, является чрезвычайно важной задачей, поскольку познание этих процессов даст возможность научиться управлять инициальной стадией злокачественного роста, а именно - блокировать каскад реакций, ведущий к стимуляции пролиферации клетки, на самой ранней стадии передачи сигнала от рецептора клеточной поверхности к ядру клетки.
Известно, что в процессе трансдукции рецептор-опосредуемых сигналов принимают участие G-белки, аденилатциклаза [Gilman A. G, 1987], фосфолипаза С [Berridge M.J., 1987], протеинкиназа С (Nishizuka Y., 1984а). Описан сигнальный путь, связанный с рецепторными тирозинки-назами и с целым каскадом протеинкиназ, передающих сигнал от плазматической мембраны к ядру клетки (Hunter Т., 2000).
Фаза трансдукции, т.е. переноса сигнала через плазматическую
мембрану, является АТФ-зависимой. Фосфорилирование - это основной
механизм, с помощью которого включается и выключается клеточная ак
тивность, и осуществляются основополагающие биологические процессы,
поэтому нарушение регуляции этого механизма является причиной многих
болезней [Северин Е. С, Кочеткова М. Н., 1985; Cohen Р., 1985; Krebs
> Е. С, 1985; 1994; 1998]. Как известно, материальным носителем и медиа-
тором реакций фосфорилирования белков и липидов в живой клетке является аденозин-5'-трифосфат (АТФ) [Nishizuka Y., 1984а; Wilson J.E., 1984].
Ковалентное присоединение фосфата от АТФ к остаткам серина,
треонина и тирозина в белках, катализируемое протеинкиназами, играет
выдающуюся роль в преобразовании сигналов. Фосфорилирование белков
ф. в эукариотической клетке является в высшей степени эффективным и бы-
стрым механизмом "включения " активности белков и ферментов, ответст
венных за передачу и усиление (амплификацию) митогенного сигнала, пе
редаваемого внутрь клетки [Северин Е. С, Кочеткова М. Н., 1985; Krebs Е.
Ф G., 1985; 1994; Nishizuka Y., 1984а; Hunter 1.,2000].
л Плазмамембранные рецепторы для полипептидных факторов роста
* обладают тирозин-протеинкиназной активностью, то есть, способны фос-
форилировать белки по остаткам тирозина [Bishop J. М., 1983; Bruno М. et al., 1992; Cantley L. C.et al.,1991; Dhanasekaran N., 1998; Hunter Т., 2000; Porter A. C, Vailloncourt R.R., 1998]. Показано, что начало влияния полипептидных факторов роста, связано с аутофосфорилированием
Р-субъединицы рецепторной тирозинкиназы [Van Obberhen Е. et al., 1982; Kalm С. R.et al., 1988; Rosen O.M., 1989). Однако из-за компартментализа-ции как цитоплазмы, так и плазматической мембраны, прямой доступ ци-тозольного АТФ к мембранным потребителям затруднён [Рязанов А. Г., Спирин АС, 1988; Friedrich Р., 1984; Srere Р.А., 1987; 1990; Kurganov B.I., 1985; Fanning A.S., Anderson J. M., 1999; Kurzchalia T.V., Parton R. G, 1999]. А.А. Карелин выдвинул и экспериментально подтвердил идею о том, что клетки отвечают на непосредственное взаимодействие полипептидных регуляторных молекул со своими специфическими рецепторами на плазматической мембране образованием АТФ, необходимым для развития дальнейших биохимических преобразований [Карелин А. А. 1979а; 1979; 1981].
Синтез АТФ наблюдали, когда изолированные из клеток-мишеней обогащенные плазматическими мембранами частицы помещали в инкубационную среду, содержащую все компоненты аэробного фосфорилирова-ния, и обрабатывали соответствующими полипептидными факторами роста. Этот феномен наблюдался в целом ряде клеток-мишеней [Карелин А.А., 1983; Karelin А.А. et al., 1992]. Плазматические мембраны большинства клеток невозможно выделить без загрязнений другими внутриклеточными мембранами, поэтому трудно утверждать, что наблюдаемый синтез АТФ имеет только плазмамем бранную природу. Общеизвестно, что синтез АТФ присущ мембранам митохондрий, мембранам хлоропластов растений и фотосинтезирующих бактерий. В плазматических мембранах животной клетки аэробный синтез АТФ до этого времени не наблюдали. Поэтому оставались неясными природа, механизм стимулируемого факторами роста синтеза АТФ и его биологическая роль, а также возможное клинико-диагностическое значение. Также не были известны особенности АТФ-опосредуемой трансмембранной передачи ростовых сигналов в опухолевых клетках.
В опухолевых клетках наблюдаются нарушения протекающих в норме процессов регуляции роста. Они утрачивают некоторые сигнальные пути, например, цАМФ-зависимый сигнальный путь [Levitzki А., 1998], но в них существенно активируются другие пути, ведущие к безудержному
* росту [Porter А. С, Vaillancourt R. R., 1998; McCormick F., 2000]. При этом
для них наиболее характерным является аутокринный тип регуляции, когда клетки для поддержания своего роста фактически не нуждаются в экзогенных факторах роста [Дыхно А. Ю. и др., 1998; Кушлинский Н. Е. и др., 2000; Суханов В.А., 1995; Aaronson S.A., 1991; Heldin С.-Н., Westermark В., 1990]. Опухолевые клетки переходят как бы на самообеспечение, постоянно транслируя аутокринные ростовые факторы, которые, связываясь с рецепторами своей же клеточной поверхности, потенциально могли бы уси-
# ливать генерацию сигнального АТФ. Однако в мировой литературе не бы-
ло сведений о том, имеет ли место феномен локального аэробного синтеза АТФ в плазматических мембранах опухолевых клеток. Такая возможность являлась вероятной, но необязательной, т. к. в некоторых типах трансформированных клеток обнаружено снижение активности ряда плазмамем-бранных ферментов, участвующих в электроннотранспортных процессах, например, NADH-оксидазы [Bruno М. et al., 1992].
Изучение особенностей функционирования плазмамембранной АТФ-образующей системы в ответ на действие факторов роста при злокачественной трансформации клеток имеет важное значение в плане разра-
^ ботки новых подходов к противоопухолевой терапии. На сегодняшний
день одним из самых перспективных подходов в лечении злокачественных
ш новообразований является вмешательство в процессы восприятия и пере-
дачи сигналов туморогенных факторов роста внутрь клетки [Кушлинский Н. Е. и др., 2000; Чехун В. Ф., Кулик Г.И., 2002; Levitzki А., 1998]. Исследование механизмов действия препаратов, влияющих на функциональную активность компонентов плазматических мембран, участвующих в синтезе
и потреблении сигнального АТФ, в том числе и рецепторных тирозиновых киназ, а именно изофлавоноидов (генистеин, кверцетин и т. д.), тирфости-нов (производных малононитрила и тирозина), то есть высокоселективных и нетоксичных ингибиторов этой активности, представляется практически значимым, т. к. они могут быть перспективны в качестве лекарств, воздействующих на процессы регуляции пролиферации при передаче митоген-ных сигналов в опухолевых клетках.
Цель исследования.
*
*
Изучить сопряженные с аэробным синтезом АТФ процессы, происходящие в плазматических мембранах животных клеток при специфическом взаимодействии полипептидных факторов роста со своими рецепторами, обладающими тирозинкиназной активностью, и выяснить возможную роль плазмамембранного сигнального АТФ в проведении митогенных сигналов в нормальных и опухолевых клетках-мишенях.
Задачи исследования.
Выбрать ткань-мишень и экспериментально подтвердить адекватность модельного объекта исследования - ОПМЧ (обогащенных плазматическими мембранами частиц) для изучения плазмамембранного синтеза АТФ в нормальных и опухолевых клетках.
Определить условия, необходимые для синтеза АТФ плазматическими мембранами нормальных и опухолевых клеток: подобрать оптимальные значения температуры, длительности инкубации и концентраций факторов роста при которых они, взаимодействуя с клетками-мишенями, проявляют максимальный стимулирующий эффект на плазмамембранный синтез
* АТФ.
3.Изучить участие ионов Н+ и Na + B механизме плазмамембранного синтеза АТФ, стимулируемого полипептидными факторами роста, в нормальных и опухолевых клетках-мишенях.
4.Исследовать возможность сопряжения плазмамембранного синтеза АТФ с функционированим редокс-цепи плазматических мембран и с экспрессией ядерного онкогена с-тус, транскрипция которого ассоциируется с кле-точной пролиферацией.
5. Для выяснения биологической роли стимулированного факторами роста
плазмамембранного синтеза АТФ в нормальных и опухолевых клетках
исследовать влияние на этот процесс различных по структуре и механизму
действия ингибиторов активности рецепторных тирозинкиназ, как возмож
ных потребителей АТФ.
6. Провести сравнительные исследования плазмамембранного синтеза
АТФ при действии специфических факторов роста и цитокинов в тканях-
мишенях из различных новообразований и в околоопухолевых гистологи-
It
Р- чески неизмененных тканях-мишенях человека и оценить этот синтез в за-
висимости от ткани, из которой развивается опухоль, и органа поражения с учетом гистологических исследований.
7. Оценить возможность использования определения уровня плазмамембранного синтеза АТФ в качестве критерия ростстимулирующей активности полипептидных факторов роста и цитокинов в отношении клеток-
мишеней.
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы
Впервые экспериментально доказано, что плазматические мембра
ны животных клеток в ответ на действие полипептидных факторов роста
- способны синтезировать АТФ, необходимый для активации рецепторных
~ тирозинкиназ. Данная реакция является важной составляющей частью фа-
лі зы сигнальной трансдукции. Впервые установлено, что в плазматических
мембранах клеток, изолированных из тканей злокачественных опухолей человека, уровень плазмамембранного синтеза АТФ значительно превышает таковой в нормальных тканях. Впервые на примере плазматических мембран эритроцитов человека, а также опухолевых клеток линий А431,
HeLa и эмбриональных фибробластов мышей линии NIH-3T3 исследован возможный молекулярный механизм локального плазмамембранного синтеза АТФ. Выяснена его роль в трансмембранной передаче митогенного сигнала как необходимого звена в активации рецепторных и нерецептор-ных тирозинкиназ. Понимание механизма плазмамембранного синтеза АТФ и его роли в онкогенезе клеток будет способствовать созданию новых высокоспецифичных лекарственных противоопухолевых препаратов. Практическая значимость данной работы. Результаты исследований позволяют более полно понять процессы восприятия и трансмембранной передачи сигналов полипептидных факторов роста и цитокинов внутрь клетки в норме и при злокачественной трансформации. Исследован возможный механизм плазмамебранного
* синтеза АТФ, обеспечивающий активацию тирозиновых киназ рецепторов
факторов роста. Изучен механизм действия ингибиторов плазмамембран
ного синтеза АТФ и ингибиторов тирозиновых киназ рецепторов факторов
роста, что позволяет провести отбор высокоселективных и нетоксичных
веществ, как перспективных фармпрепаратов для подавления пролифера-
ции опухолевых клеток. Разработана методика определения АТФ-
образующей активности плазматических мембран животных клеток. Эта
методика позволяет оценить функциональное состояние плазмамембран
ного звена передачи сигналов от ростовых факторов и цитокинов внутрь
клетки, что является новым методологическим подходом в области моле
кулярной диагностики. Количественное определение уровня плазмамем-
бранного аэробного синтеза АТФ в клетках удаленных оперативным путем
*
т тканей человека можно использовать в качестве критерия для оценки ро-
* стстимулирующей активности ПФР в отношении опухолевых клеток, что
может отражать способность опухоли к прогрессии.
Положения, выносимые на защиту
]. В первую минуту взаимодействия полипептидных факторов роста со своими специфическими рецепторами плазматических мембран нор-малъных и опухолевых клеток-мишеней в аэробных условиях синтезирует-ся короткоживущая молекула АТФ из неорганического фосфата и АДФ при участии NADH-связанной редокс-цепи и ионов Na+. Синтезированная молекула АТФ способна активировать тирозинкиназы рецепторов факторов роста.
2. Под влиянием полипептидных факторов роста плазматические
мембраны злокачественно трансформированных клеток-мишеней синтези
руют АТФ из неорганического фосфата и АДФ в аэробных условиях зна
чительно больше, чем плазматические мембраны гистологически неизме-
* ненных клеток-мишеней.
3. Ингибиторы стимулируемого факторами роста аэробного плазма-
мембранного синтеза АТФ, а также ингибиторы активности потребителей
сигналстимулируемого АТФ — тирозинкиназ рецепторов факторов роста
представляют собой перспективные противоопухолевые соединения, спо
собные прерывать передачу митогенного сигнала на стадии трансдукции.
Апробация диссертационной работы
Основные положения и результаты диссертации были представлены на Всесоюзном симпозиуме "Энергетические аспекты клеточной физиологии", Пущино, 1988; VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нук-
леотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реак-
*
я ций", Петрозаводск, 1988; на Всесоюзном совещании "Молекулярные ме-
ханизмы энергетического обмена", Пущино, 1990; 19th Meeting FEBS,
Rome, Italy, 1989; на симпозиуме стран СНГ "Клинические и эксперимен
тальные аспекты клеточной сигнализации", Москва, 1993; на симпозиуме
"Пути передачи внеклеточного сигнала", Звенигород, 1993; Международ-
ной конференции "Новые направления в ангиологии и сосудистой хирур
гии", Москва, 1995; 2-м съезде биохимического общества РАН, Москва,
1997; An ASBM Satellite of the International Congress of Biochemistry
"Cellular Regulation by Protein Phosphorylation: Forty Years of Progress",
Seattle, Washington, 1997; 17th International Congress of Biochemistry and
Molecular Biology, San Francisco, California, 1997; на 1-й и 2-й Междуна
родной конференции по ингибиторам тирозиновых киназ, Польша, Варша
ва, 1998; 2001 (ЇРК-2001, Poland, Warsaw, 2001); 11-м Национальном кон
грессе по болезням органов дыхания, Москва, 2001; на научно-
практическом симпозиуме "Принципы и способы лабораторного обеспече
ния внебольничной помощи и актуальные проблемы лабораторной меди
цины" в рамках Национальных дней лабораторной медицины России, Мо-
* сква, 2001; на научно-практическом симпозиуме "Рациональное примене-
ние лабораторных тестов в диагностике и мониторинге наиболее распространенных форм патологии" в рамках Национальных дней лабораторной медицины России, Москва, 2002; на Российском научном форуме "Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия", Москва 2002; на 3-м съезде биохимического общества РАН, СПб, 2002.
Структура и объём диссертации.
Диссертация изложена на 473 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, общих выводов и указателя литературы, включающего 757 источников, из них 76 отечественных и 681 зарубежных.
+ Текст диссертации иллюстрирован 60 таблицами и 77 рисунками.
24 Часть I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
Представление о том, что клетка окружена непроницаемой оболочкой, ушло в далекое прошлое, а ему на смену пришло четкое понимание активно-
* го участия плазматической мембраны (ПМ) во внутриклеточных процессах.
В липидном бислое клеточной мембраны размещены периферические
белки, расположенные на внешней и внутренней поверхности ПМ, и инте
гральные, пронизывающие липидный бислой. Именно белковые молекулы
клеточной мембраны контактируют с внешней средой и ответственны за реа
лизацию большинства функций ПМ. Состав и взаимная пространственная
ориентация белковых и липидных молекул в мембранах является основой их
функциональной активности [Болдырев А.А., 1985; 1986; Скулачёв В.П.,
1989; Fanning AS., Anderson J. M., 1999; Kurzchalia T.V., Parton R. G., 1999].
щ Клеточный рост (пролиферация) регулируется полипептидными факто-
^ рами роста (ПФР), которые взаимодействуют с клеткой через специфические
рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью. Молекулярные ме
ханизмы, протекающие на ПМ клетки при взаимодействии ПФР с рецепто
ром, и дальнейшая передача сигнальной информации в ядро клетки в на-
^ стоящее время изучены недостаточно и привлекают внимание многих иссле-
ш дователей по той причине, что многие ПФР оказались непосредственно при-
#- частны к канцерогенезу и опухолевому неоангиогенезу. По современным
представлениям рак рассматривается как заболевание, связанное с нарушением регуляции трансмембранных и внутриклеточных сигнальных систем, контролирующих пролиферацию [Киселёв СМ. и др., 2002; Коган Е.А., 2002;
* Копнин Б.П., 2000; Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., 2002; Суханов В. А.,
» 1995; Тюляндин С. А., 2000; Aaronson S.A., 1991; de Laat S.W. et al., 1999;
* Dhanasekaran N., 1998; Garrington T.P., Jonson G.L., 1999; Fambrough D. et al.,
1999; Follkman J., 1995; Larrivee В., Karsan A., 2000; Kmger E. A. et al., 1998/1999; Kurz H., 2000; Leof E.B., 2000; Levitzki A., 1998; McCormick F., 2000; Hunter Т., 2000; Roussel M. F., 1998; Porter A. C, Vailloncourt R.R., 1998; Moghan N., Steinberg P.W., 1999; Shawver L.K., 1999].
