Введение к работе
Актуальность проблемы. Репарация ДНК относится к числу важнейших клеточных процессов. Большинство повреждений в ДНК исправляются с помощью системы эксцизионной репарации оснований (ЭРО). В этой системе поврежденные основания узнаются и выщепляются из ДНК специфичными ферментами ДНК-гликозилазами, а затем с участием ферментов апурин-апиримидиновых (АП-) эндонуклеаз, дезоксирибо-5'-фосфатлиаз (dRP-лиаз), ДНК-полимераз и ДНК-лигаз спираль ДНК восстанавливается. Несколько лет назад были открыты ДНК-гликозилазы млекопитающих NEIL1, NEIL2 и NEIL3, гомологичные бактериальным белкам формамидопиримидин-ДНК-гликозилазе (Fpg) и эндонуклеазе VIII (Nei). Для белков NEIL 1 и NEIL2 было показано, что они способны удалять из ДНК некоторые окисленные основания. Однако все эти основания также могут подвергаться репарации с участием других ДНК-гликозилаз. Таким образом, вопрос о функциях белков NEIL в клетках млекопитающих пока остается открытым. Кроме того, для многих поврежденных оснований ДНК до сих пор не известны гликозилазы, инициирующие их репарацию, и вполне можно предположить, что какие-то из этих оснований удаляются ферментами NEIL. Особый интерес представляют разные способы модуляции функций ДНК-гликозилаз. Показано ингибирование ряда ДНК-гликозилаз ионами тяжелых металлов и описаны случаи синергичного воздействия активных форм кислорода и ионов тяжелых металлов на процессы мутагенеза. Однако взаимодействие ионов металлов с другими белками суперсемейства Fpg/Nei практически не изучалось, а для белков NEIL такие исследования не проводились вообще. Кроме того, активность ДНК-гликозилаз, их стабильность и внутриклеточная локализация может активно регулироваться различными видами пострансляционной модификации. Таким образом, изучение регуляции активности ДНК-гликозилаз NEIL позволило бы выявить модификацию значимых аминокислотных остатков семейства Fpg/Nei.
Цель данной работы заключалась в установлении новых функций и способов модуляции активности ДНК-гликозилаз NEIL1 и NEIL2. Для этого в процессе работы было необходимо решить следующие задачи:
исследовать возможность и условия проявления ферментами NEIL дезоксирибофосфат-5'-лиазной активности;
изучить способность ферментов NEIL удалять из ДНК поврежденные основания 8-oxoAde;
исследовать влияние ионов металлов на активность ферментов суперсемейства Fpg/Nei;
определить нуклеофильные остатки - потенциальные сайты ковалентной модификации в составе ферментов суперсемейства Fpg/Nei.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой разностороннее исследование субстратной специфичности и различных
факторов, влияющих на активность ДНК-гликозилаз NEIL. Впервые показано, что ДНК-гликозилазы NEIL1 и NEIL2 человека катализируют реакцию Р-элиминирования дезоксирибонуклеозид-5'-фосфата, определены значения кинетических параметров этой реакции, охарактеризованы предпочтительные субстраты, проведена реконструкция полной системы репарации с участием ферментов NEIL1 и NEIL2. Установлено, что NEIL1 удаляет 8-оксоаденин из пар с цитозином, но не из других пар, причем для эффективной репарации в этом случае требуется участие полинуклеотидкиназы-З'-фосфатазы. Установлено, что активность ДНК-гликозилазы NEIL1 и гомологичных ей бактериальных ферментов из структурного суперсемейства Fpg/Nei ингибируется ионами Cd2+, Zn2+ и Cu2+, что частично обусловлено связыванием металлов с ДНК. Установлено, что фермент NEIL2 инактивируется пиридоксаль-5'-фосфатом за счет образования с ним ковалентного аддукта - основания Шиффа с остатком Lys50, что приводит к потере способности фермента связывать ДНК. Результаты работы позволяют глубже понять механизмы удаления повреждений из ДНК и возможность регуляции активности ферментов репарации в протекании этих процессов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «International Conference on Chemical Biology» (Новосибирск, 2005), «IXth International Workshop on Radiation Damage to DNA» (Текирова, Турция, 2006), «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006), «International Free Radical Summer School 2006: Biomarkers of oxidative stress and responses» (Спеце, Греция, 2006), «3rd International Conference Basic Science for Medicine» (Новосибирск, 2007), «10th International Conference on Environmental Mutagens (ICEM) and 39th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS)» (Флоренция, Италия, 2009) и на конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 281 литературный источник.
Похожие диссертации на Функции и механизм действия эукариотических ферментов NEIL1 и NEIL2
