Введение к работе
. Актуальность темы.
Алкогольная интоксикация у животных и человека сопровождается морфологическим и функциональным повреждением гонад: угнетением сперматогенеза, атрофическими и дегенеративными нарушениями структуры герминативных и гормонпродуцирующих клеток. Следствием этого на организменном уровне является развитие импотенции, бесплодия, феминизации (Bannister, 1987). Злоупотребление алкоголем, принимающее в развитых странах все более широкомасштабный характер, обусловливает необходимость изучения механизмов гонадотоксичности этанола (Э) и поиска эффективных средств ее профилактики и коррекции.
Ключевым фактором, определяющим поддержание нормальной структуры и метаболизма клеток семенников, является внутриорганный уровень тестостерона (Т). Снижение последнего при остром и хроническом введении Э является главным патогенетическим механизмом развития алкогольного гипогонадизма (Van Thiel, 1982). Поэтому, выяснение биохимических путей угнетения гормонпродуцирующей функции семенников и поиск способов коррекции этого состояния представляется важной и актуальной задачей.
Большинство авторов главную роль в происхождении нарушений, обнаруженных в системе гипоталамус-гипофиз-гонады, отводят прямому повреждающему действию Э на семенники. Причем, считается, что гона-дотоксичностью обладает не сам спирт, а соединения, образующиеся в ходе его метаболизма - НАД-Н и (или) ацетальдегид (Cicero, 1982). Последний связывается с макромолекулами, в том числе с белками хроматина, приводя к изменению их физико-химических и иммунологических свойств, напрямую ингибирует ферменты стероидогенеза. Уксусный альдегид образуется преимущественно в печени и поступает в другие органы с кровью. Однако, если учесть, что в эндотелии семенников присутствуют мощные альдегиддегидрогеназные (АльДГ) системы, формирующие гема-тотестикулярный барьер (Anderson, 1985), то вопрос о скорости метаболизма Э внутри гонад приобретает большую актуальность.
Основная часть этилового спирта, поступающего в организм животных, окисляется алкогольдегидрогеназами (АДГ - алкоголь: NAD -оксидоредуктаза КФ 1.1.1.1.), которые делятся по физико-химическим, иммунологическим и кинетическим свойствам на шесть основных классов (Jornvall, 1995). По скорости каталитического превращения этилового спирта изоферменты сильно различаются. Например, АДГ III практически его не окисляет. Следовательно, выяснение кинетических параметров АДГ семенников является принципиально важным для оценки ее этанол-метаболизирующей активности. Изоферментный спектр АДГ видоспеци-фичен и наиболее сложно организован у человека. Это обусловило выбор объекта исследования.
Помимо АДГ, утилизация Э осуществляется комплексом микросо-мальных ферментов, получивших название - МЭОС (микросомальная эта-нолокисляющая система), и каталазой (перекись водорода: перекись водорода оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6.). Вклад каждого из этих метаболических путей в настоящее время известен только для печени и зависит от концентрации этилового спирта и метаболического состояния ткани. Особенности обмена Э в семенниках отражены в немногочисленных и фрагментарных исследованиях и практически отсутствуют для человека (Dafeldecker, 1986; Murono, 1986).
Известно, что введение Э усиливает процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени и ряде других органов (Nordmann, 1992). Считается, что этот эффект обусловлен не Э, который в некоторых системах проявляет даже антиоксидангные свойства, а образующимися в ходе его метаболизма свободнорадикальными продуктами. Одним из наиболее мощных источников их наработки является семейство цитохромов Р-450, в частности, изофермент - НЕЇ, участвующий в окислении Э в составе МЭОС (Albano, 1996). Это означает, что образование свободно-радикальных продуктов в семенниках может интенсифицироваться в клеточном компартменте, где осуществляются конечные этапы биосинтеза Т. Известно, что эти соединения могут угнетать биосинтез гормона. В то же время, свободно-радикальные продукты вовлечены в нормальный каталитический акт и регуляцию активности ряда ферментов стероидогенеза. Поэтому логично допустить, что всякое изменение скорости этих процессов может приводить к нарушению образования стероидов. Следовательно, изучение взаимоотношений процессов биосинтеза Т и ПОЛ при алкогольной интоксикации актуально и перспективно в плане поиска механизма повреждения Э гормонообразующей функции семенников.
При изучении механизма угнетения гормонопоэза в семенниках следует учитывать нейрохимические и нейроэндокринные эффекты Э, приводящие к снижению тропной стимуляции клеток Лейдига (Van Thiel, 1982). Непонятным, однако, остается как способ действия Э, так и удельный вес центрального компонента в общей массе патогенетических факторов. Принципиально новым и актуальным подходом к выяснению этого вопроса, позволяющим объяснить наличие в литературе гетерогенных и разнонаправленных данных, является изучение закономерностей взаимодействия при алкогольной интоксикации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гонадной систем.
Таким образом, проведение данного исследования существенно расширит существующие представления о регуляции биосинтеза Т в животном организме в норме и при патологии, позволит выяснить механизмы его угнетения при алкогольной интоксикации и целенаправленно подойти к поиску способов коррекции алкогольного гипогонадизма.
5 Цель и задачм исследования.
Цель настоящего исследования заключалась в выяснении биохимических механизмов угнетения биосинтеза Т при алкогольной интоксикации, разработке патогенетически обоснованного направления поиска и конкретных способов коррекции данного процесса с помощью природных биологически активных соединений.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Изучить влияние острой и хронической алкогольной интоксикации на уровень Т и кортикостерона в крови, семенниках и надпочечниках, активность ферментов стероидогенеза в гонадах животных и человека. Исследовать влияние Э на биосинтез Т in vitro - в микросомах и изолированных клетках Лейдига.
-
Охарактеризовать этанолметаболизирующие системы семенников и их вклад в нарушение гормонопоэза. Для этого - выделить алкогольде-гидрогеназу из яичек человека до электрофоретически гомогенного состояния, изучить ее каталитические и физико-химические свойства, отнести к одному из известных изоферментных классов. Получить моноспецифическую антисыворотку к АДГ из семенников человека, с помощью которой методами иммуноферментного и иммуногистохимического анализа определить содержание и исследовать характер межклеточного распределения изучаемого фермента. Выяснить наличие и определить активность микросомальной этанолокисляющей системы и каталазы в семенниках человека. По состоянию системы НАД/НАДН, сдвигам в аминокислотном спектре оценить значение метаболического дисбаланса, развивающегося при окислении Э, в угнетении биосинтеза Т.
-
Исследовать влияние острой и хронической алкогольной интоксикации на процессы ПОЛ в семенниках крыс. Изучить значение индукции ПОЛ в угнетении биосинтеза стероидных гормонов. Охарактеризовать взаимоотношения процессов биосинтеза Т и ПОЛ в модельных системах in vitro. Выяснить возможность использования витаминов А и Е в качестве протекторов гормонпродуцирующей активности семенников при действии Э.
-
Изучить особенности биосинтеза Т при алкогольной интоксикации при различной функциональной активности надпочечников - на фоне иммобилизационного стресса, адреналэктомии, введении кортикостерои-дов.
Научная новизна.
В работе впервые проведено комплексное изучение особенностей биосинтеза Т при алкогольной интоксикации на организменном, клеточном и субклеточном уровне. Продемонстрировано, что острое и хроническое введение Э приводит к угнетению биосинтеза Т в семенниках, снижению его концентрации в плазме крови. Аналогичное действие этиловый спирт оказывает на изолированные клетки Лейдига. Установлено, что
наиболее чувствительным к действию Э этапом является превращение ЗР-ОН-5-ен-стероидов в ДЗ-оксо-4-ен-стероиды, катализируемое ЗР-ОН-стероиддегидрогеназой/изомеразой (СДГ) (К.Ф.5.3.3.1.). Показано, что этот феномен обусловлен изменением структуры фермента или его ли-пидного окружения, так как воспроизводится in vitro - в культуре клеток Лейдига и микросомах.
В представленной работе впервые охарактеризован спектр и активность этанолметаболизирующих ферментов семенников человека и оценен их вклад в развитие биохимических нарушений, приводящих к угнетению биосинтеза Т. В частности, выделен до электрофоретически гомогенного состояния основной изофермент АДГ. Исследованы его физико-химические и каталитические свойства. Показано, что он является диме-ром, состоящим из двух идентичных субъединиц массой по 37 кд каждая. АДГ семенников обладает отрицательным зарядом при рН 8,3 - 8,6, что обусловливает ее поведение при электрофорезе и анионорбменной хроматографии, нечувстительна к пиразолу, не насыщается Э, не окисляет метанол. Это позволило отнести ее к III классу изоферментного спектра. Каталитическая константа при рН 7,5 и концентрации Э 0,5 М составила всего 2 мин"1, что свидетельствует о незначительном ее вкладе в окисление Э в семенниках. Получена моноспецифическая антисыворотка к АДГ III и на ее основе сконструированы иммуноферментная и иммуногистохи-мическая тест-системы. С их помощью впервые определено содержание этого фермента в семенниках человека и изучено его межклеточное распределение. Наибольшая концентрация АДГ III зафиксирована в сперма-тоцитах и сперматогониях. Достаточно униформное распределение фермента противоречит представлениям о наличии у АДГ III специфических функций в обмене стероидов.
Показано, что активность МЭОС в семенниках не определяется. В то же время, каталазная реакция окисления Э протекает со скоростью 0,096 + 0,010 нмоль/мин/мг белка.
Впервые охарактеризован спектр метаболитных нарушений в гонадах в динамике острой алкогольной интоксикации. Продемонстрировано, что введение Э не приводит к изменению уровня НАД и отношения НАД/НАДН, содержания цАМФ, Р-эндорфина, лей-энкефалина в семенниках. Аминокислотный дисбаланс незначителен и качественно отличается от такового в печени при алкогольной интоксикации. Это позволило сформулировать тезис об отсутствии выраженного влияния обмена Э на метаболический статус клеток семенников и обеспеченность стероидоген-ных ансамблей окисленным НАД .
Впервые изучены особенности ПОЛ в семенниках при острой и хронической алкогольной интоксикации. Индукция ПОЛ при однократном введении Э проявлялась в увеличении количества диеновых коньюгатов (ДК), уменьшении содержания аскорбиновой кислоты, восстановленного глютатиона. При хронической интоксикации эффект был выражен в
7 большей степени и заключался в повышении уровня более поздних продуктов - малонового диальдегида (МДА) и флуоресцирующих продуктов (ФП). Аналогичные сдвиги, включая снижение активности СДГ и 17-дегидрогеназы, были обнаружены при индукции ПОЛ с помощью у-облучения и CCI4. Выявленные закономерности подтверждены в модельных системах in vitro. Э проявлял выраженную прооксидантную активность в культуре клеток Лейдига. Он увеличивал наработку МДА и потенцировал действие комплекса АДФ-Ре3+. Это позволило впервые обосновать положение о том, что индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации является фактором, обусловливающим угнетение биосинтеза Т.
Исследована гормонпродуцирующая функция семенников при различной функциональной активности надпочечников. Показано, что адре-налэктомия, иммобилизационный стресс, введение дексаметазона оказывают однотипное угнетающее действие на биосинтез Т. Причем, на этом фоне эффект Э был неаддитивным. В сочетании с полученными данными о стрессогенной активности спирта это позволило обосновать принципиально важный тезис о том, что в реализации повреждающей активности Э эксплуатируются общие механизмы взаимодействия двух нейроэндок-ринных осей : гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой.
Впервые продемонстрировано, что витамин А нарушает реципрок-ность функционирования гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой систем у крыс и оказывает выраженное стимулирующее действие на биосинтез Т как в норме, так и при алкогольной интоксикации. Обнаруженный эффект был подтвержден в исследовании с участием добровольцев. Аналогичное, хотя и менее выраженное действие ретинол продемонстрировал у больных хроническим алкоголизмом. В моделях in vitro было показано, что одной из вероятных точек приложения активности ретинола является СДГ, активность которой увеличивалась в присутствии физиологических концентраций данного витамина.
Теоретическая и практическая значимость.
Изучены биохимические механизмы угнетения Э биосинтеза Т на уровне целого организма, изолированных клеток Лейдига, субклеточных фракций. Показано, что основным молекулярным дефектом в процессе стероидогенеза является индуцируемое Э снижение активности СДГ.
Впервые проведено комплексное исследование спектра этанолмета-болизирующих ферментов семенников человека. Продемонстрировано, что основной изофермент АДГ относится к III классу и обладает низким сродством и каталитической активностью по отношению к Э. Иммунохи-мическими методами изучено межклеточное распределение фермента. Показано, что он присутствует во всех клетках, но наибольшее содержание отмечается в сперматоцитах и сперматогониях. Активность МЭОС в ткани семенников не выявляется, а скорость пероксидазного окисления этилового спирта в каталазной реакции составляет всего 0,096 нмоль/мин/мг белка. Сделано заключение о том, что ткань семенников
8 весьма инертна в окислении Э, что дополнительно подтверждается характером изменений концентрации НАД, отношения НАД/НАДН, спектра свободных аминокислот в семенниках при алкогольной интоксикации. Вывод о низкой скорости окисления Э в семенниках и незначительном влиянии этого процесса на окислительно - восстановительный статус клеток существенно суживает зону поиска способов профилактики и коррекции алкогольного гипогонадизма.
Продемонстрировано, что индукция ПОЛ в семенниках при алкогольной интоксикации играет важную роль в механизме ингибирующего действия Э на стероидогенез. Этот вывод позволяет целенаправленно подойти к поиску факторов, улучшающих гормонсинтезирующую функцию семенников, среди природных и синтетических соединений, обладающих антиоксидантной активностью.
Сформулирован и экспериментально подтвержден тезис об опосредовании части эффектов Э в семенниках элементами гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, что открывает новые возможности в изучении механизмов гонадотоксичности Э и разработке способов профилактики и коррекции данной патологии, основанных на использовании антистрессорных и адаптогенных мероприятий.
Продемонстрировано наличие кортикостерона и ПР-гидроксилазы стероидов в семенниках крыс. Характер изменения концентрации данного кортикостероида при различной функциональной активности надпочечников и алкогольной интоксикации свидетельствует о том, что его биосинтез осуществляется in situ и, возможно, регулируется гонадотропинами. Это расширяет существующие представления о регуляции стероидогенеза в гонадах и будет способствовать изучению механизмов взаимодействия гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой осей, а также влияния Э на биосинтез стероидов.
Впервые показано, что витамин А является фактором, нарушающим реципрокность функционирования гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой систем и оказывающим мощное стимулирующее действие на биосинтез Т в организме крыс и здоровых людей. Это открывает широкие перспективы в изучении молекулярных механизмов его активности и разработке способов профилактики и коррекции повреждения гонад при алкоголизме.
Одним из практических достижений работы является разработка способа выделения электрофоретически-гомогенного препарата АДГ из семенников человека, что в последующем позволило получить моноспецифическую антисыворотку и создать на ее основе иммунохимические тест-системы для оценки межклеточного распределения и проведения количественного анализа АДГ III. Такого рода тест-системы могут быть применены в практике научных исследований для изучения распределения и биологической функции ферментов обмена Э в других органах и тканях человеческого организма.
Разработан способ определения концентрации кортикостерона методом адсорбционной микро-ВЭЖХ, нашедший широкое применение в биохимических исследованиях.
Разработан эффективный микрометод высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения динитрофенилгидразонов альдегидов, позволивший оптимизировать способы определения активности МЭОС и пероксидазного окисления Э.
Разработана эффективная хроматографическая система разделения интермедиатов стероидогенеза, что может быть использовано в практике биохимических исследований для изучения отдельных стадий этого процесса в семенниках.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Острая и хроническая алкогольная интоксикация у крыс приводит к угнетению биосинтеза Т в семенниках. Основным молекулярным дефектом в функционировании стероидогенного комплекса семенников при действии Э является нарушение превращения Зр-ОН-5-ен-стероидов в З-оксо-4-ен-стероиды, катализируемое СДГ.
-
АДГ семенников человека относится к III классу изоферментного спектра и имеет низкое сродство и каталитическую активность по отношению к Э. Она содержится во всех клетках семенников, причем наибольшая концентрация отмечается в сперматоцитах и сперматогониях. Этанолметаболизирующие ферменты семенников обладают малой мощностью и не приводят при алкогольной интоксикации к снижению уровня НАД, либо отношения НАД/НАДН.
-
Острая и хроническая алкогольная интоксикация у крыс сопровождается усилением ПОЛ в семенниках. Э в культуре клеток Лейдига оказывает прооксидантное действие. Индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации является одним из факторов в механизме угнетения биосинтеза Т.
-
Алкогольная интоксикация увеличивает концентрацию кортикостерона в надпочечниках и плазме крови крыс. Изменение функциональной активности надпочечников, сопровождающееся увеличением либо уменьшением концентрации кортикостероидов в различных экспериментальных ситуациях, предотвращает угнетение биосинтеза Т этанолом.
-
Ретинола ацетат увеличивает концентрацию Т в семенниках и плазме крови крыс, в плазме крови людей добровольцев как на интактном фоне, так и при алкогольной интоксикации и повышает активность СДГ in vitro.
Апробация результатов диссертации.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 9 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Москва, 1987), 4, 5 и 7-ой Гродненской областной конференции молодых ученых и специалистов "Молодежь и научно-технический прогресс" (Гродно, 1987, 1988, 1990), 3 Всесоюзной конференции "Перспективные методы плани-
рования и анализа при исследовании случайных полей и процессов" (Гродно, 1988), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991), Международной конференции, посвященной 35-летию Гродненского медицинского института (Гродно, 1993), международном симпозиуме ESBRA (Стокгольм, 1997), совместных заседаниях лабораторий Института биохимии АН Беларуси и кафедры биохимии Гродненского государственного медицинского института (1990 - 1997).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 32 печатных работы. Из них 3 -за рубежом, 18 статей и 11 тезисов - в отечественных изданиях. По материалам работы защищено две диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских и биологических наук.
Объем и структура работы.
